专利名称：枯草芽孢杆菌及其分离培养方法芝麻香型白酒以粮食为原料，大曲、麸曲等为糖化发酵剂，利用自然界微生物开放式发酵，霉菌、酵母、细菌协同作用，融入酱香堆积工艺，形成具有独特风格的白酒，一般芝麻香型白酒麸曲采用细菌、酵母、霉菌等多菌种纯培养后混合应用于酿酒生产，由实际生产可知，微生物菌种的性能对芝麻香型酒的品质具有重要的影响。
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌及其分离培养方法，通过该分离培养方法获得耐高温、产吡嗪类化合物能力较好、适应能力强的枯草芽孢杆菌，提高芝麻香酒品质和产量。本发明的技术解决方案是该枯草芽孢杆菌B3 Bacillus subtilis菌株是从高温曲中分离筛选得到的，已于2011年11月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种编号为=CGMCC No. 5512。其中，该枯草芽孢杆菌的分离培养方法包括以下步骤取今世缘生物工程公司培养制作的高温曲样品IOg接种于IOOmL芽孢杆菌富集培养基中，35°C培养18 24小时，得菌悬液；将上述菌悬液置于80°C水浴中加热10 20分钟以杀死不能形成芽孢的菌体；随后将加热处理过的菌悬液稀释10 —3、10 —4、10 —5，每个稀释梯度的样品取ImL加入直径为90mm无菌培养皿中，倒入融化保温的芽孢杆菌分离培养基25 mL中混合，待凝固后倒置于50-60 °C培养箱培养24 48小时；挑取培养皿内形态规则的菌落,在芽孢杆菌分离培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为杆状细菌后采用16S rDNA序列同源性分析，筛选出枯草芽孢杆菌，保藏于营养琼脂斜面备用；经菌种鉴定后取活力较强菌株命名为B3。其中，芽孢杆菌富集培养基蛋白胨10g，KH2PO4 1.5g，酵母膏3g，Na2HPO4 2g，淀粉 3g，MgS04.7H20 O. lg, H2O 1000 mL, pH7. 8 121°C，15 分钟。其中，芽孢杆菌分离培养基由芽孢杆菌富集培养基与7°Bx麦芽汁培养基，溶化后以1:1的质量混匀而成。本发明从高温曲中分离筛选得到枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌的耐温性能较好，60°C仍能够保持良好的性能，而且具有较好的产吡嗪化合物的能力，采用该菌种生产的麸 曲用于芝麻香型白酒生产能提高自产酒的优质品率。 取今世缘生物工程公司培养制作的高温曲样品IOg接种于IOOmL芽孢杆菌富集培养基中，35°C培养18小时，得菌悬液；将上述菌悬液置于80°C水浴中加热10分钟以杀死不能形成芽孢的菌体；随后将加热处理过的菌悬液适当稀释10 —3、10 —4、10 —5，每个稀释梯度的样品取ImL加入直径为90mm无菌培养皿中，倒入融化保温的芽孢杆菌分离培养基25 mL中混合，待凝固后倒置于50°C培养箱培养48小时；挑取培养皿内形态规则的菌落,在芽孢杆菌分离培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为杆状细菌后采用16S rDNA序列同源性分析，筛选出枯草芽孢杆菌，保藏于营养琼脂斜面备用；经菌种鉴定后取活力较强菌株命名为B3 ;其中，芽孢杆菌富集培养基蛋白胨10g，KH2PO41.5g，酵母膏 3g, Na2HPO4 2g，淀粉 3g，MgS04.7H20 0. lg, H2O 1000 mL, pH7. 8 121。。，15 分钟；其中，芽孢杆菌分离培养基由芽孢杆菌富集培养基与7°Bx麦芽汁培养基，溶化后以1:1的质量混匀而成。实施例2 :依以下步骤分离培养枯草芽孢杆菌 取今世缘生物工程公司培养制作的高温曲样品IOg接种于IOOmL芽孢杆菌富集培养基中，35°C培养21小时，得菌悬液；将上述菌悬液置于80°C水浴中加热15分钟以杀死不能形成芽孢的菌体；随后将加热处理过的菌悬液适当稀释10 —3、10 —4、10 —5，每个稀释梯度的样品取ImL加入直径为90mm无菌培养皿中，倒入融化保温的芽孢杆菌分离培养基25 mL中混合，待凝固后倒置于55°C培养箱培养36小时；挑取培养皿内形态规则的菌落,在芽孢杆菌分离培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为杆状细菌后采用16S rDNA序列同源性分析，筛选出枯草芽孢杆菌，保藏于营养琼脂斜面备用；经菌种鉴定后取活力较强菌株命名为B3 ;其中，芽孢杆菌富集培养基蛋白胨10g，KH2PO41.5g，酵母膏 3g, Na2HPO4 2g，淀粉 3g，MgS04.7H20 0. lg, H2O 1000 mL, pH7. 8 121。。，15 分钟；其中，芽孢杆菌分离培养基由芽孢杆菌富集培养基与7°Bx麦芽汁培养基，溶化后以1:1的质量混匀而成。实施例3 :依以下步骤分离培养枯草芽孢杆菌 取今世缘生物工程公司培养制作的高温曲样品IOg接种于IOOmL芽孢杆菌富集培养基中，35°C培养24小时，得菌悬液；将上述菌悬液置于80°C水浴中加热20分钟以杀死不能形成芽孢的菌体；随后将加热处理过的菌悬液适当稀释10 —3、10 —4、10 —5，每个稀释梯度的样品取ImL加入直径为90mm无菌培养皿中，倒入融化保温的芽孢杆菌分离培养基25 mL中混合，待凝固后倒置于60°C培养箱培养24小时；挑取培养皿内形态规则的菌落,在芽孢杆菌分离培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为杆状细菌后采用16S rDNA序列同源性分析，筛选出枯草芽孢杆菌，保藏于营养琼脂斜面备用；经菌种鉴定后取活力较强菌株命名为B3 ;其中，芽孢杆菌富集培养基蛋白胨10g，KH2PO41.5g，酵母膏 3g, Na2HPO4 2g，淀粉 3g，MgS04.7H20 0. lg, H2O 1000 mL, pH7. 8 121。。，15 分钟；其中，芽孢杆菌分离培养基由芽孢杆菌富集培养基与7°Bx麦芽汁培养基，溶化后以1:1的质量混匀而成。比较例4 :菌种优化对比试验
将实施例2的菌株(B3)与实验室保藏的四株枯草芽孢杆菌(B1、B12、B13、B16)分别接入到麸皮培养基中，接种量为1%，于60°C培养48h，测定其吡嗪类化合物含量，如表I所示， 表I不同菌株的固态培养产物中吡嗪类化合物的含量


本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其分离培养方法，从今世缘生物工程公司培养制作的高温曲中分离得到枯草芽孢杆菌，该菌种经性能对比试验，具有耐高温、产吡嗪类化合物能力较好、适应能力强、易培养等特点，能够提高芝麻香酒品质和产量。