专利名称：一种快速筛选微生物培养基的方法微生物培养基是人工配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的、一定比例的多种营养物质的混合物，同时，培养基也为微生物提供除营养外的其他生长所必须的环境条件。培养基的组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品质量 及产量等都有着重要的影响。因此，培养基的配方成分、各配方成分的含量比例，以及培养基的制备方法都会对微生物的生长造成重大影响。选择适合的培养基是微生物发酵生产中至关重要的一步。但是，传统的培养基筛选方法如下固定一个基本组分配方，以单个组分含量为变量，进行遥瓶发酵培养，然后分时间段取样，检测各选择变量下的菌体生长浓度，画出菌体生长曲线，进而判断适合该菌种的培养基配方成分及其比例。这种传统筛选方法需要做很多次的培养实验，操作繁琐，费时费力，不便于进行大量的培养基筛选实验，而且容易造成实验误差。
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种步骤简单、操作方便、所得菌体生长曲线准确度高、筛选结果可靠性高的节约时间和人力成本的快速筛选微生物培养基的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种快速筛选微生物培养基的方法，它包括以下步骤(I)准备设备器材准备实验所需用到的设备器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微发酵透气膜封口膜、恒温培养振荡器和酶标仪；(2)制备菌悬液及各待筛选的培养基SI :制备菌悬液，它包括以下步骤Sll :用固体培养基培养被测增殖菌种；S12 :用生理盐水将菌体洗脱下来，得到被测菌种菌悬液；S2 :制备各待筛选的培养基，它包括以下步骤S21 :分别根据各待筛选培养基的不同配方配制被测菌种的培养基S22 :在生物安全柜中用无菌滤膜进行除菌过滤，得到各待筛选的培养基；(3)接种被测菌种菌悬液，它包括以下步骤S3 :培养基移液至微孔板采用移液器将步骤S2所得的各培养基分别加入微孔板的小孔中，每个小孔内分别加入一种待筛选的培养基，并记录每个小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，其中，每个小孔内加入的培养基的量为200 250iil ;S4 :菌悬液移液至微孔板采用移液器将步骤SI所得的菌悬液接种到已加有培养基的微孔板小孔中，其中，每个小孔内加入的菌悬液的量为50 60iil ;(4)振荡培养用微发酵透气膜封口膜将微孔板的各小孔封好，将整个微孔板置于恒温培养振荡器中缓慢振荡培养8 IOh ;(5)检测吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭开微发酵透气膜封口膜，采用酶标仪检测各小孔内发酵液对可见光的吸光值OD ；(6)作生长曲线、对比筛选根据单个小孔内不同时段的吸光值OD作出菌体的生长曲线，结合步骤S3所记录的各小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，筛选出适合该菌种使用的培养基。快速筛选流感嗜血杆菌培养基的方法包括以下步骤 (I)准备设备器材准备实验所需用到的设备器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微发酵透气膜封口膜、恒温培养振荡器和酶标仪；(2)制备菌悬液及各待筛选的培养基SI :制备菌悬液，它包括以下步骤Sll :用固体培养基培养流感嗜血杆菌；S12 :用生理盐水将菌体洗脱下来，得到流感嗜血杆菌菌悬液；S2 :制备各待筛选的培养基，它包括以下步骤S21 :配制各待筛选的流感嗜血杆菌培养基，培养基中各组分的重量比如下氯化血红素0. 0005 0. 003,辅酶10. 0005 0. 003,酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；S22 :在生物安全柜中用无菌滤膜进行除菌过滤，得到各待筛选的培养基；(3)接种流感嗜血杆菌菌悬液，它包括以下步骤S3 :培养基移液至微孔板采用移液器将步骤S2所得的各培养基分别加入微孔板的小孔中，每个小孔内分别加入一种待筛选的培养基，并记录每个小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，其中，每个小孔内加入的培养基的量为200 250iil ;S4 :菌悬液移液至微孔板采用移液器将步骤SI所得的菌悬液接种到已加有培养基的微孔板小孔中，其中，每个小孔内加入的菌悬液的量为50 60iil ;(4)振荡培养用微发酵透气膜封口膜将微孔板的各小孔封好,将整个微孔板置于恒温培养振荡器中缓慢振荡培养8 IOh ;(5)检测吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭开微发酵透气膜封口膜，采用酶标仪检测各小孔内发酵液对可见光的吸光值OD ；(6)作生长曲线、对比筛选根据单个小孔内不同时段的吸光值OD作出菌体的生长曲线，结合步骤S3所记录的各小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，筛选出适合该菌种使用的培养基。快速筛选A群脑膜炎奈瑟氏菌培养基的方法包括以下步骤(I)准备设备器材准备实验所需用到的设备器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微发酵透气膜封口膜、恒温培养振荡器和酶标仪；(2)制备菌悬液及各待筛选的培养基SI :制备菌悬液，它包括以下步骤Sll :用固体培养基培养A群脑膜炎奈瑟氏菌；S12 :用生理盐水将菌体洗脱下来，得到A群脑膜炎奈瑟氏菌菌悬液；S2 :制备各待筛选的培养基，它包括以下步骤S21 :配制各待筛选的A群脑膜炎奈瑟氏菌培养基，培养基中各组分的重量比如下酸水解酪蛋白0 3，胰蛋白胨0 3，L-半胱氨酸0. 002，磷酸二氢钠0. 1，硫酸镁0. 05，葡萄糖0. 2，氯化钠0. 2，酵母浸粉0. 5 ；S22 :在生物安全柜中用无菌滤膜进行除菌过滤，得到各待筛选的培养基；(3)接种A群脑膜炎奈瑟氏菌菌悬液，它包括以下步骤S3 :培养基移液至微孔板采用移液器将步骤S2所得的各培养基分别加入微孔板的小孔中，每个小孔内分别加入一种待筛选的培养基，并记录每个小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，其中，每个小孔内加入的培养基的量为200 250iil ;S4 :菌悬液移液至微孔板采用移液器将步骤SI所得的菌悬液接种到已加有培养 基的微孔板小孔中，其中，每个小孔内加入的菌悬液的量为50 60iil ;(4)振荡培养用微发酵透气膜封口膜将微孔板的各小孔封好，将整个微孔板置于恒温培养振荡器中缓慢振荡培养8 IOh ;(5)检测吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭开微发酵透气膜封口膜，采用酶标仪检测各小孔内发酵液对可见光的吸光值OD ；(6)作生长曲线、对比筛选根据单个小孔内不同时段的吸光值OD作出菌体的生长曲线，结合步骤S3所记录的各小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，筛选出适合该菌种使用的培养基。快速筛选C群脑膜炎奈瑟氏菌培养基的方法包括以下步骤(I)准备设备器材准备实验所需用到的设备器材，包括生物安全柜、移液器、微孔板、微发酵透气膜封口膜、恒温培养振荡器和酶标仪；(2)制备菌悬液及各待筛选的培养基SI :制备菌悬液，它包括以下步骤Sll :用固体培养基培养C群脑膜炎奈瑟氏菌；S12 :用生理盐水将菌体洗脱下来，得到C群脑膜炎奈瑟氏菌菌悬液；S2 :制备各待筛选的培养基，它包括以下步骤S21 :配制各待筛选的C群脑膜炎奈瑟氏菌培养基，培养基中各组分的重量比如下葡萄糖0 0. 5，酵母浸粉0 0. 6，酸水解酪蛋白2，胰蛋白胨2，L-半胱氨酸0. 002，磷酸二氢钠0. 1，硫酸镁0. 05,氯化钠0. 2 ；S22 :在生物安全柜中用无菌滤膜进行除菌过滤，得到各待筛选的培养基；(3)接种C群脑膜炎奈瑟氏菌菌悬液，它包括以下步骤S3 :培养基移液至微孔板采用移液器将步骤S2所得的各培养基分别加入微孔板的小孔中，每个小孔内分别加入一种待筛选的培养基，并记录每个小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，其中，每个小孔内加入的培养基的量为200 250iil ;S4 :菌悬液移液至微孔板采用移液器将步骤SI所得的菌悬液接种到已加有培养基的微孔板小孔中，其中，每个小孔内加入的菌悬液的量为50 60iil ;(4)振荡培养用微发酵透气膜封口膜将微孔板的各小孔封好,将整个微孔板置于恒温培养振荡器中缓慢振荡培养8 IOh ;(5)检测吸光值每隔I 2h，取出微孔板并揭开微发酵透气膜封口膜，采用酶标仪检测各小孔内发酵液对可见光的吸光值OD ；(6)作生长曲线、对比筛选根据单个小孔内不同时段的吸光值OD作出菌体的生长曲线，结合步骤S3所记录的各小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，筛选出适合该菌种使用的培养基。本发明还包括一个对实验中需用到的设备器材在使用前进行灭菌的步骤，它包括以下步骤( I )将生物安全柜、酶标仪和恒温培养振荡器置于C级洁净环境下，用臭氧熏蒸除菌；(II)将微发酵透气膜封口膜、微孔板和移液器的吸头进行121°C的湿热灭菌30mino 本发明所述的移液器采用250 U I移液器。本发明所述的微孔板采用96孔微孔板。本发明所述的酶标仪采用8通道全波长酶标仪。本发明的有益效果是将被测菌种菌悬液及不同配方的待筛选培养基分别加入微孔板中的各小孔内同时进行发酵培养，每隔一段时间采用酶标仪检测各小孔内发酵液对660nm波长可见光的吸光值，从而得到被测菌体的生长曲线，得出不同配方及配方比例的培养基对该菌种生长的影响，最终完成培养基的筛选；本筛选方法步骤简单、操作方便、所得菌体生长曲线准确度高、筛选结果可靠性高且筛选速度快、减轻了工作人员的工作量，降低了培养基筛选成本，可适用于大量的培养基筛选实验。S2 :制备各待筛选的培养基，它包括以下步骤S21 :配制各待筛选的流感嗜血杆菌培养基，培养基中各组分的重量比如下A2B2组氯化血红素0.001，辅酶10. 001，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；A2B3组氯化血红素0.001，辅酶10. 002，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；A2B4组氯化血红素0.001，辅酶10. 003，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；A3B1组氯化血红素0.002，辅酶10. 0005，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A3B2组氯化血红素0.002，辅酶10. 001，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ；S22 :在生物安全柜中用无菌滤膜进行除菌过滤，得到各待筛选的培养基；(3)接种流感嗜血杆菌菌悬液，它包括以下步骤S3 :培养基移液至微孔板采用250 Ul移液器将步骤S2所得的各培养基分别加A 96孔微孔板的小孔中，每个小孔内分别加入一种待筛选的培养基，并记录每个小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，其中，每个小孔内加入的培养基的量为250 ill ；S4 :菌悬液移液至微孔板采用250 Ul移液器将步骤SI所得的菌悬液接种到已加有培养基的96孔微孔板的小孔中，其中，每个小孔内加入的菌悬液的量为60iil ;(4)振荡培养用微发酵透气膜封口膜将96孔微孔板的各小孔封好,将整个96孔微孔板置于恒温培养振荡器中缓慢振荡培养IOh ；(5)检测吸光值每隔2h，取出96孔微孔板并揭开微发酵透气膜封口膜，采用8通道全波长酶标仪Multiskan GO检测各小孔内发酵液对660nm波长可见光的吸光值OD66tl,每次检测完成后，迅速盖上微发酵透气膜封口膜以避免染菌，放回恒温培养振荡器中继续培养;(6)作生长曲线、对比筛选根据单个小孔内不同时段的吸光值OD作出菌体的生长曲线，结合步骤S3所记录的各小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，筛选出适合该菌种使用的培养基。实施例3本实施例的被测菌种选用流感嗜血杆菌Hib，对氯化血红素及辅酶I浓度不同的Hib培养基进行筛选。快速筛选流感嗜血杆菌培养基的方法包括以下步骤(I)准备设备器材准备实验所需用到的设备器材，包括生物安全柜、250 Ul移液器、96孔微孔板、微发酵透气膜封口膜、恒温培养振荡器和8通道全波长酶标仪；它还包括一个对实验中需用到的设备器材在使用前进行灭菌的步骤，它包括以下步骤( I )将生物安全柜、8通道全波长酶标仪和恒温培养振荡器置于C级洁净环境下，用臭氧熏蒸除菌；(II)将微发酵透气膜封口膜、96孔微孔板和250 Ul移液器的吸头进行121°C的湿热灭菌30min ； (2)制备菌悬液及各待筛选的培养基SI :制备菌悬液，它包括以下步骤Sll :用固体培养基培养流感嗜血杆菌，Hib菌种按照文献公开的方法(Anderson,1977. I NFCTION AND IMMUNITY. Vol 15. No. 2，P472_477)进行培养，采用 CY 培养基，成分为每升培养基含IOg酸水解酪蛋白、5g酵母提取物、5g葡萄糖、Img氯化血红素、Img辅酶I、0. IM PB、20g 琼脂，pH 值为 7. 6 ；S12 :用生理盐水将菌体洗脱下来，得到流感嗜血杆菌菌悬液；S2 :制备各待筛选的培养基，它包括以下步骤S21 :配制各待筛选的流感嗜血杆菌培养基，培养基中各组分的重量比如下A3B3组氯化血红素0.002，辅酶10. 002，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A3B4组氯化血红素0.002，辅酶10. 003，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A4B1组氯化血红素0.003，辅酶10. 0005，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖5 ;A4B2组氯化血红素0.003，辅酶10. 001，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A4B3组氯化血红素0.003，辅酶10. 002，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖A4B4组氯化血红素0.003，辅酶10. 003，酸水解酪蛋白10，酵母提取物5，葡萄糖S22 :在生物安全柜中用无菌滤膜进行除菌过滤，得到各待筛选的培养基；(3)接种流感嗜血杆菌菌悬液，它包括以下步骤S3 :培养基移液至微孔板采用250 U I移液器将步骤S2所得的各培养基分别加A 96孔微孔板的小孔中，每个小孔内分别加入一种待筛选的培养基，并记录每个小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，其中，每个小孔内加入的培养基的量为200iil ;S4 :菌悬液移液至微孔板采用250 Ul移液器将步骤SI所得的菌悬液接种到已加有培养基的96孔微孔板的小孔中，其中，每个小孔内加入的菌悬液的量为50iil ;(4)振荡培养用微发酵透气膜封口膜将96孔微孔板的各小孔封好,将整个96孔微孔板置于恒温培养振荡器中缓慢振荡培养IOh ；(5)检测吸光值每隔2h，取出96孔微孔板并揭开微发酵透气膜封口膜，采用8通道全波长酶标仪Multiskan GO检测各小孔内发酵液对660nm波长可见光的吸光值OD66tl,每次检测完成后，迅速盖上微发酵透气膜封口膜以避免染菌，放回恒温培养振荡器中继续培养;(6)作生长曲线、对比筛选根据单个小孔内不同时段的吸光值OD作出菌体的生长曲线，结合步骤S3所记录的各小孔内所加入的培养基的配方及其配方比例，筛选出适合该菌种使用的培养基。实施例I 实施例3中，各待筛选培养基中酸水解酪蛋白的浓度均为1%，酵母提取物的浓度均为0. 5%葡萄糖的浓度也均为0. 5% ;氯化血红素及辅酶I的浓度如表I所示


本发明公开了一种快速筛选微生物培养基的方法，它包括以下步骤制备菌悬液及各待筛选的培养基；培养基移液至微孔板；菌悬液接种移液至微孔板；微孔板封口、振荡培养8～10h；每隔1～2h，采用酶标仪检测各小孔内发酵液的吸光值OD；作生长曲线、对比、完成筛选。本发明的有益效果是将被测菌种菌悬液及不同配方的待筛选培养基分别加入微孔板中的各小孔内同时进行发酵培养，实现筛选的步骤简单、操作方便、所得菌体生长曲线准确度高、筛选结果可靠性高且筛选速度快、减轻了工作人员的工作量，降低了培养基筛选成本，可适用于大量的培养基筛选实验。