一种培养基及用该培养基生产多成分高活性灵芝菌粉方法【技术领域】，具体涉及一种多成分高活性灵芝及灵芝菌粉的制备方法。[0002]灵芝:治愈万症，其功能应验，灵通神效，故名灵芝，又名“不死药”俗称“灵芝草”，多孔菌科类、一年生真菌，灵芝作为药物已正式被国家药典收载，同时它又是国家批准的新资源食品，无毒副作用，可以药食两用。科学研究表明，灵芝的药理成分非常丰富，其中有效成份可分为十大类，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、留类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用十分显著。[0003]通过生物发酵的方式提高灵芝药用活性成分的含量因为其具有生产周期短、节省劳动力和受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。但目前国内外对灵芝的研究主要集中在发酵条件及活性成分分离等层面上，整体发酵水平不高，如专利(申请号00111953.2)公开了一种液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺,灵芝酸含量可达2.8mg/100mg，胞内和 胞外多糖总量高达2.34克/升，但该方法效率低，不能满足工业化发酵生产的需要；而专利(申请号201210110969.5)虽然公开了一种利用扩张蛋白提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法，即通过向液体发酵培养基中加入扩张蛋白来提高总黄酮的产量，但此专利中所用的扩张蛋白液制备方法繁复，不利于工厂化生产。
[0004]本发明提供一种简单易行且成本低的利用具有天然活性成分的灵芝菌，通过培养基的选择，经液体深层发酵、生物转化合成含有高比率黄酮类化合物和皂角苷活性成分的灵芝菌粉的方法，具体技术方案如下。[0005]本发明提供了一种深层发酵生产多成分高活性灵芝菌粉的培养基，所述培养基每升中含有大米粉l_5g，马铃薯汁1-40 g，山葡萄籽粉1-6 g，人参粉1-2 g，杏仁粉1-3 g，枸杞子粉1-3 g，山楂汁1-4 g，银杏叶1-5 g，磷酸二氢钾0.1-0.5 g，硫酸镁0.1-0.5 g，葡萄糖1-5 g，其余为水，PH值自然。
[0006]优选地，本发明提供的培养基每升中含有大米粉l_5g，马铃薯汁1-10 g，山葡萄籽粉1-3.5 g，人参粉1-1.5 g，杏仁粉1-1.2g，枸杞子粉1-2.5g，山楂汁1-2.5g，银杏叶1-2.5g，磷酸二氢钾0.1-0.5g，硫酸镁0.1-0.25g，葡萄糖l_3g，其余为水，PH值自然。
[0007]基于上述的培养基，本发明提供了深层发酵生产多成分高活性灵芝的方法，主要包括如下步骤:
I)将灵芝菌种在斜面培养基上培养得到斜面菌种；2)将斜面菌种接种到液体种子培养基中，进行扩繁培养，得到液体种子；
3)将步骤2)得到的液体种子按0.5-1%的接种量接种到一级种子罐的培养基中培养得到一级种子液；
4)将步骤3)得到的一级种子液按5-10%的接种量接种到上述权利要求所述的培养基中，在条件为温度25-27 °C，压力0.03-0.05MPa,空气流量1:0.5-1.0v/v,菌丝浓度40-55w/v的条件下，深层发酵培养56-72h，得到发酵液；
5)将步骤4)得到的发酵液经过滤得到灵芝湿菌丝体和过滤液，湿菌丝体干燥后研磨得到灵芝菌粉；过滤液经真空浓缩干燥后研磨得到灵芝菌粉。
[0008]优选地，在上述深层发酵生产多成分高活性灵芝的方法中，步骤I)所述的斜面培养基为PDA培养基，斜面培养的条件为:在温度为22-25°C的条件下，培养5_7天。
[0009]优选地，在上述深层发酵生产多成分高活性灵芝的方法中，步骤2)所述液体种子培养基为PDA培养基，培养条件为在22-25°C的温度下，摇床转数为100-120转/min，暗培养3-5天。
[0010]优选地，在上述深层发酵生产多成分高活性灵芝的方法中，步骤3)所述一级种子罐培养基为综合培养基，培养条件为在25-27°C的温度下，培养48h。
[0011]目前，由于野生灵芝资源有限，而通过人工栽培获得的灵芝实体所带来的农药及污染很难去除。发酵法可以通过调节培养基的组成、培养温度及时间等条件，在短时间内得到大量的灵芝菌丝体，其在组成上与人工栽培得到的灵芝实体相似，但其克服了污染及农药问题。
[0012]灵芝本身药理成分非常丰富，其中有效成份可分为十大类，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、留类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。经研究，野生灵芝含有极其微量的黄酮类化合物。而黄酮类化合物具有促进血液循环，阻抗动脉硬化形成，改善降低血液中胆固醇含量减少脂肪在血液血管壁上的积累，降低冠状动脉阻塞，止痛、止血治疗外伤引发的症状，对防止体内各组织发炎形成的抗体和消除体内过多的氧化自由基有明显疗效。目前经研究已经从野生灵芝中分离出黄酮类化合物，但其含量是抑制其应用的主要因素。
[0013]灵芝本身不含有皂角苷活性物质，但皂角苷具有抗癌抑制肿瘤，降低血糖，改善代谢，降低血脂，抑制肥胖，降低血小板凝聚，避免形成血栓，改善血液流变避免心肌梗塞和增强机体免疫抗病能力。
[0014]本发明就是利用深层发酵方法通过调节培养基的组成，提高灵芝菌丝中黄酮类化合物和皂角苷活性物质的含量。具体来讲，本发明培养基中所选用的组分中含有大量的黄酮类化合物和皂角苷活性物质，如山葡萄籽、银杏叶等有效成分主要为黄酮类化合物，而人参、杏仁粉等则含有皂角苷等有效成分，这些组分通过液体深层发酵、生物转化合成含有黄酮类化合物和皂角苷活性物质的灵芝菌丝。
[0015]本发明的优点如下:
I)本发明通过灵芝菌经液体深层发酵获得比一般普通灵芝及其菌丝体粉活性成分多的灵芝菌粉；
2)本发明获得的灵芝菌粉中除含有灵芝本身活性成分外，还含有黄酮类化合物和皂角苷活性物质，是一种纯生物不含有其他任何有害物质的多成分、高活性灵芝菌粉；
3)培养基的来源广泛，易得，成本低；
4)本发明所采用的制备方法工艺简单，重复性好，环境可控，适合工业化生产。

[0016]下面结合实施例对本发明做详细说明。
[0017]实施例中所用灵芝菌为黑灵芝(Ganoderma),赤灵芝(Ganoderma Lucidum)和紫灵芝(Ganoderma neo-japonicum)均购自于北京普天同创生物科技有限公司。
灵芝菌粉中活性成分的确定由国家药物代谢产物分析中心和青岛科标化工分析检测有限公司完成。具体而言，相应的方法为:
蛋白质的测定:凯氏定氮法；活性多糖、三萜:紫外分光光度计；总黄酮:芦丁计；皂角苷、腺苷:高效液相色谱方法。
[0018]实施例1
1)制备培养基:每升培养基中含有马铃薯汁40g，大米粉5g，山葡萄籽粉6g，人参粉2g，杏仁粉3g,枸杞子3g,山楂汁4g,银杏叶5g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁0.5g,葡萄糖5g,其余为水，PH自然；
2)将黑灵芝(Ganoderma)，接种到斜面PDA培养基上培养得到斜面菌种，温度为25°C，培养7天；
3)将斜面菌种接种到PDA液体种子培养基中，进行扩繁培养，在25°C条件下，培养5天，得到液体种子；
4)将液体种子按0.5%的接种量接种到一级种子罐中在27°C条件下，培养48h，得到一级种子；
5)将一级种子液按10%的接种量接种步骤I)所述的培养基中，在条件为温度27°C，压力0.05MPa,空气流量1: 1.0v/v,菌丝浓度55w/v的条件下，深层发酵培养72h，得到发酵液；
6)将步骤5)得到的发酵液经板框滤得到灵芝湿菌丝体和过滤液，湿菌丝体干燥后研磨得到过80目筛灵芝菌粉；过滤液经真空浓缩干燥后研磨过80目得到灵芝菌粉。
[0019]实施例2:与实施例1条件相同，灵芝菌种为赤灵芝(Ganoderma Lucidum)?
[0020]实施例3:与实施例1条件相同，灵芝菌种为紫灵芝(Ganoderma neo-japonicum)。
[0021]实施例4
1)制备培养基:每升培养基中含有马铃薯汁20g，大米粉3g，山葡萄籽粉3g，人参粉2g，杏仁粉2g,枸杞子2g,山楂汁2g,银杏叶3g,磷酸二氢钾0.3g,硫酸镁0.2g,葡萄糖3g,其余为水，PH自然；
2)将黑灵芝(Gan oderma)，接种到斜面PDA培养基上培养得到斜面菌种，温度为22°C，培养5天；
3)将斜面菌种接种到PDA液体种子培养基中，进行扩繁培养，在22°C条件下，培养3天，得到液体种子；
4)将液体种子按1%的接种量到一级种子罐中在25°C条件下，培养48h，得到一级种
子；5)将一级种子液按5%的接种量接种步骤I)所述的培养基中，在条件为温度25°C，压力0.03MPa,空气流量1: 0.5v/v,菌丝浓度40w/v的条件下，深层发酵培养56h，得到发酵液；
6)将步骤5)得到的发酵液经板框滤得到灵芝湿菌丝体和过滤液，湿菌丝体干燥后研磨得到过80目筛灵芝菌粉；过滤液经真空浓缩干燥后研磨过80目得到灵芝菌粉。
[0022]实施例5
1)制备培养基:每升培养基中含有马铃薯汁10g，大米粉2g，山葡萄籽粉2g，人参粉lg，杏仁粉lg，枸杞子2g,山楂汁Ig,银杏叶2g,磷酸二氢钾0.3g,硫酸镁0.2g,葡萄糖2g,其余为水，PH自然；
2)将黑灵芝(Ganoderma)，接种到斜面PDA培养基上培养得到斜面菌种，温度为23°C，培养5天；
3)将斜面菌种接种到PDA液体种子培养基中，进行扩繁培养，在24°C条件下，培养4天，得到液体种子；
4)将液体种子按0.8%的接种量接种到一级种子罐中在26°C条件下，培养48h，得到一级种子；
5)将一级种子液按10%的接种量接种步骤I)所述的培养基中，在条件为温度26°C，压力0.04MPa,空气流量1: 0.8v/v,菌丝浓度40w/v的条件下，深层发酵培养66h，得到发酵液；
6)将步骤5)得到的发酵液经板框滤得到灵芝湿菌丝体和过滤液，湿菌丝体干燥后研磨得到过80目筛灵芝菌粉；过滤液经真空浓缩干燥后研磨过80目得到灵芝菌粉。
[0023]实施例中各个主要活性成分通过相应的测定方法得到表1和表2的数据:
表1为相同条件下不同接种菌种的活性成分测定: