专利名称：胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基及喂食细胞的制作方法 胚胎干细胞，系来自于囊胚中内层细胞群之未分化细胞，具有能分化成全部组织之多样性，而被期待于细胞培养、组织移植、新药研究、及基因治疗之领域中之应用。再者，亦已获知可由移植成体之体细胞核所得之复制胚胎，诱导胚胎干细胞。近年来，将胚胎干细胞导入以神经组织为首之各种组织之技术已被报告出来，由于由胚胎干细胞所诱导之组织系无免疫排斥之遗传性上相等之组织，故可期待其于移植医疗及基因治疗之利用。又，亦有报告指出，胚胎干细胞之培育对象由实验小动物扩展至包含人类之灵长类，如猕猴胚胎干细胞之分离、由人类体外受精卵之胚胎干细胞之分离等。又，末盛等人，由以往临床试验有用之医学研究中广泛使用之长尾猴(Macaca fascicularis)之显微受精卵，成功地培育出新颖之胚胎干细胞，且证明其多样性能长期维持，并且，亦证明可由该长尾猴胚胎干细胞诱导多巴胺神经。上述之含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞，为促进其生长，以往系与喂食细胞共同培养。特别是，由于若使用血清培养包含人类之灵长类之胚胎干细胞，则无法维持未分化状态，故探讨以无血清培养基培养(参照专利文献1)。然而，仅以无血清培养基培养无法维持胚胎干细胞，而为了代替一部分血清之效果，必须与喂食细胞共同培养。该喂食细胞，例如，使用将由鼠之胎儿所调制出之纤维母细胞，以排多癌(Mitomycin-C)或放射线照射而使增殖停止之细胞，故因人类胚胎干细胞与来自鼠之喂食细胞之共同培养，而有感染人兽共通感染症之虞。由于期待由该人类胚胎干细胞所诱导之组织，能作为移植医疗及基因治疗之材料，故期盼能尽可能的排除兽共通感染症等之疑虑。因此，亦有报告指出，取代鼠之胎儿而以人类胎儿之纤维母细胞、成人输卵管上皮细胞(非专利文献1)、来自人类新生儿之包皮之纤维母细胞(非专利文献2、3)、成人表皮纤维母细胞(非专利文献4)、人类骨髓细胞(非专利文献5)作为喂食细胞利用之方法。然而，此等大致皆系利用初代细胞，由于为了大量制得胚胎干细胞而需要来自复数供应源之材料，故需要花费一一检查每供应源之时间。又，培育此等来自人类之喂食细胞之培养基，由于使用牛胎儿血清(FBS)等之血清，故亦有由该血清传播未知之感染源或普恩蛋白(prion)之未知病源体的危险性。专利文献1国际公开第98/30679号非专利文献1Nat.Biotechnol.20933-936(2002)非专利文献2Biol.Reprod.682150-2156(2003)非专利文献3Hum.Reprod.181404-1409(2003)非专利文献4Stem.Cells.21546-556(2003)非专利文献5Stem.Cells.21131-142(2003)发明内容本发明之课题，系提供一种胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基(以下，称为喂食细胞培育培养基)，系将培养包含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞所使用之喂食细胞，由特定供体之材料有效率地建立、并能以感染机会少之状态进行培养。并且，提供一种与含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞共同培养亦较安全之喂食细胞之制造方法，以及由此方法制得之喂食细胞。本发明人等，为解决上述问题而持续研究之结果发现，于基本培养基中，由至少含有血清白蛋白及胰岛素之胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基，可将含有选自由胚胎干细胞之喂食细胞所得之胎儿表皮纤维母细胞、胎儿肌肉纤维母细胞、胎儿肺纤维母细胞、胎儿上皮细胞、胎儿内皮细胞、成体表皮纤维母细胞、成体肺纤维母细胞、成体上皮细胞、成体内皮细胞中之至少1种细胞种源之细胞集团安定地进行增殖，而完成本发明。
亦即，本发明系以下所述者1.一种胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基，其含有血清白蛋白、胰岛素及基本培养基，该血清白蛋白之量为2g/L～50g/L，该胰岛素之量为1mg/L～100mg/L，而该基本培养基系由选自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201及MCDB202中之至少一种所构成。
2.如上述1所记载之培养基，其中，进一步含有细胞黏连因子。
3.如上述2所记载之培养基，其中该细胞黏连因子，系选自胶原(collagen)、明胶(gelatine)、纤维结合素结合蛋白(fibronectin)、粘连蛋白(Vitronectin)、层粘连蛋白(laminin)、聚离胺酸(polylysine)、聚鸟胺酸(polyornithine)、及聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine)中之至少1种。
4.如上述1、2或3所记载之培养基，其中，进一步含有细胞增殖因子。
5.如上述4所记载之培养基，其中，该细胞增殖因子，系选自纤维母细胞增殖因子及上皮细胞增殖因子中之至少一种。
6.一种胚胎干细胞用喂食细胞之制造方法，其包括培养增殖步骤，将含有选自胎儿表皮纤维母细胞、胎儿肌肉纤维母细胞、胎儿肺纤维母细胞、胎儿上皮细胞、胎儿内皮细胞、成体表皮纤维母细胞、成体肺纤维母细胞、成体上皮细胞、成体内皮细胞中之至少1种细胞种源之细胞集团，以上述1～5任一项记载之胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基进行培养增殖；及停止增殖步骤，将该培养增殖之细胞集团，以排多癌或放射线照射而使增殖停止。
7.如上述6所记载之制造方法，其中该培养增殖步骤，系于以细胞黏连因子涂布之培养容器中进行。
8.如上述7所记载之制造方法，其中该细胞黏连因子，系选自胶原、明胶、纤维结合素结合蛋白、粘连蛋白、层粘连蛋白、聚离胺酸、聚鸟胺酸、及聚乙烯亚胺中之至少1种。
9.如上述6、7或8所记载之制造方法，于该培养增殖步骤中，使培养细胞平均细胞分裂20次以上。
10.一种胚胎干细胞用喂食细胞，系由上述6～9之任一项记载之制造方法所制得。
藉由本发明之喂食细胞培育培养基，即使与含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞共同培养，亦可建立较安全之喂食细胞，而能长期培养。喂食细胞之材料，由于系来自例如胎儿表皮纤维母细胞、胎儿肌肉纤维母细胞、胎儿肺纤维母细胞、胎儿上皮细胞、胎儿内皮细胞、成体表皮纤维母细胞、成体肺纤维母细胞、成体上皮细胞、成体内皮细胞等特定之供体，故对于长期培养之可能性系有用。藉此，可将含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞与喂食细胞共同培养，于作为移植或基因治疗等材料之胚胎干细胞使用时，可提供人畜共通感染症疑虑少之胚胎干细胞。


图1，系显示以实施例2所培育之喂食细胞培养之长尾猴胚胎干细胞之第10天之群落(40倍)之图。
图2，系显示以实施例2所培育之喂食细胞培养之长尾猴胚胎干细胞继代后之第4天之群落(100倍)之图。
图3，系显示以实施例2所培育之喂食细胞培养之长尾猴胚胎干细胞之增殖之图。
图4，系显示以实施例2所培育之喂食细胞培养之长尾猴胚胎干细胞继代后之第4天之群落其SSEA-4免疫染色相片(100倍)之图。
图5，系显示以实施例3所培育之喂食细胞培养之长尾猴胚胎干细胞之第10天之群落(40倍)之图。
图6，系显示以实施例3所培育之喂食细胞培养之长尾猴胚胎干细胞继代后之第4天之群落(100倍)之图。
图7，系显示以实施例3所培育之喂食细胞培养之长尾猴胚胎干细胞之增殖之图。
图8，系显示实施例4中组合涂布明胶与喂食细胞培育培养基(B)进行培养时之MRC-5之增殖之图。记载有培养开始时之PDL、与以之后继代培养时之细胞数测定所算出之培养结束时之PDL。
图9，系显示实施例5中组合涂布胶原与喂食细胞培育培养基(B)进行培养时之MRC-5之增殖之图。记载有培养开始时之PDL、与以之后继代培养时之细胞数测定所算出之培养结束时之PDL。

本发明所使用之基本培养基，可单独使用选自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201、MCDB202，及/或亦可组合复数使用，而以利用于纤维母细胞之无血清培养基之DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB201、MCDB202为佳，而利用于灵长类胚胎干细胞之无血清培养中之DMEM∶Ham F12为1∶1之混合培养基，由培养基之营养价值、喂食细胞培育后之与胚胎干细胞共同培养之生存率之观点考虑则较佳。
再者，本发明所利用之基本培养基之详细组成，系根据表1所记载之出处。
表1基本培养基之出处


本发明所使用之喂时细胞培育培养基，系含有血清白蛋白及胰岛素作为必须成分。该培养基亦可再含有其它成分。然而，其它成分若含有牛胎儿血清(FBS)等未知成分或夹杂物，因感染症等之疑虑高，故为不宜。
作为其它成分，有该基本培养基中未含有之成分、或该基本培养基中已含有但量不足够之成分。具体而言，例如，细胞黏连因子、细胞增殖因子、运铁蛋白等含有金属之蛋白质、其它之聚及蛋白质、胺基酸类、维他命类等。将此等成分配合于基本培养基中，以制造喂食细胞培育培养基。又，亦可将市售之称为血清代替物者配合于基本培养基中，来制造喂食细胞培育培养基。该血清代替物，通常系含有血清白蛋白及胰岛素，且含有如上所述之其它成分。因此，可于基本培养基中，将血清代替物以配合目的之量使用适当量之血清白蛋白及胰岛素。作为血清代替物，例如，于上述专利文献1所记载血清代替物。
本发明之喂食细胞培育培养基中，以含有细胞黏连因子作为其它成分为佳。又，以含有细胞增殖因子为佳。再者，以含有运铁蛋白等含金属之蛋白质为佳。作为细胞黏连因子，以选自胶原、明胶、纤维结合素结合蛋白、粘连蛋白、层粘连蛋白、聚离胺酸、聚鸟胺酸、及聚乙烯亚胺中之至少1种为佳，特别是以胶原、明胶、纤维结合素结合蛋白、粘连蛋白等为更佳。作为细胞增殖因子，以选自纤维母细胞增殖因子(FGF)、及上皮细胞增殖因子(EGF)中之至少1种为佳。
本发明之喂食细胞培育培养基中，必须含有血清白蛋白2g/L～50g/L及胰岛素1mg/L～100mg/L之比例。更佳之血清白蛋白的量为4g/L～25g/L、胰岛素的量为5mg/L～30mg/L。
再者，细胞黏连因子以含有0.3mg/L～50mg/L左右为佳。惟于后述之将细胞黏连因子涂布于培养容器内面使用之场合，于喂食细胞培育培养基中不一定须配合细胞黏连因子。细胞增殖因子，于喂食细胞培育培养基中，以含有0.01μg/L～100μg/L之比例为佳，特别是含有纤维母细胞增殖因子0.1μg/L～10μg/L为佳、含有上皮细胞增殖因子0.5μg/L～50μg/L为佳。运铁蛋白等含有金属之蛋白质，以含有1mg/L～50mg/L之比例为佳。
本发明之用以建立胚胎干细胞用喂食细胞可使用之细胞，例如，可选自胎儿表皮纤维母细胞、胎儿肌肉纤维母细胞、胎儿肺纤维母细胞、胎儿上皮细胞、胎儿内皮细胞、成体表皮纤维母细胞、成体肺纤维母细胞、成体上皮细胞、成体内皮细胞中之至少1种。将含有所选择之细胞种别之细胞集团，于含有本发明之喂时细胞培育用培养基之培养容器内，以3％～10％之CO2、温度35℃～40℃之条件下，培养1日～30日，可使其增殖。使上述之细胞集团增殖后，以排多癌或放射线照射使细胞之增殖停止，藉此制得大量之喂食细胞。
如上所述，藉由含有细胞增殖步骤、及增殖停止步骤之制造方法，可于无血清培养下进行育成，而制造大致无动物感染之安全的胚胎干细胞用喂食细胞。该细胞增殖步骤，可于细胞培养容器中事先以细胞黏连因子涂布。该细胞增殖步骤中，藉由使培养细胞平均细胞分裂20次以上，可大量制造喂食细胞。
实施例以下，说明本发明之实施例及比较例，但本实施例系显示以辅助本发明之再现为目的之其中一实施样态，并无法以本实施例作为本发明之界限或限制事项。又，以下之实施例等中，喂食细胞，系使用以含有牛胎儿血清(FBS)增殖之株化人类细胞。此系由于直接由人体得到人类细胞作为实验材料极为困难，而成为将已提供为研究用之株化人类细胞使用于实验之状况。
实施例1以添加FBS 10v/v％之MEM培养基，培养至41.77PDL(populationdoubling level，细胞集团倍增值(日本组织培养学会编「组织培养之技术」第3版(基础编)1996年p42))，将由细胞库分让之人类正常2倍肺纤维母细胞株(MRC-5)，使用以下之喂食细胞培育培养基(A)使细胞数悬浊成2.4×106cells，而于涂布明胶之培养皿上，以1次之继代培养培养至42.99PDL。
喂食细胞培育培养基(A)之组成添加牛血清白蛋白(BSA)5g/L、EGF 10μg/L、胰岛素1mg/L、皮质醇(hydrocortisone)1mg/L之RITC80-7培养基。
接着，将上述培养之MRC-5，使用含有最终浓度为10μg/mL之排多癌(Mitomycin-C，MMC)之喂食细胞培育培养基(A)，培养2～3小时，使细胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之喂食细胞培育培养基(A)，将细胞以磷酸缓冲溶液(PBS)洗净3次。将洗净后之细胞，藉由胰蛋白酶处理(0.25w/v％胰蛋白酶、1mM EDTA)由培养皿剥离，计算细胞数。其结果，可制得约5.5×106cells之喂食细胞。
实施例2将由与实施例1相同之细胞库分让之MRC-5，使用以下之喂食细胞培育培养基(B)使细胞数悬浊成2.1×105cells，而于涂布明胶之培养皿上，进行4次之继代培养培养至53.47PDL。
接着，将上述培养之MRC-5，使用含有最终浓度为10μg/mL之MMC之喂食细胞培育培养基(B)，培养2～3小时，使细胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之喂食细胞培育培养基(B)，以PBS将细胞洗净3次制成喂食细胞。将该喂食细胞，于涂布明胶之直径60mm培养皿上，以每1枚约4×105个之活细胞数接种附着。
喂食细胞培育培养基(B)之组成添加有含白蛋白83g/L及胰岛素100mg/L之血清代替物(Knock outSerum Replacement，印皮多露建公司(专利文献1))20v/v％、MEM非必须胺基酸溶液(印皮多露建公司)1v/v％、丙酮酸钠1mmol/L、L-麸酰胺2mmol/L、2-乙基硫醇(mercaptoethanol)0.1mmol/L、EGF 10μg/L、及FGF 1μg/L之DMEM∶Ham＝1∶1之混合培养基。
将冷冻保存之长尾猴胚胎干细胞解冻后，将以下述之长尾猴胚胎干细胞用培养基(A)使活细胞数悬浊成约2×105cells/ml之浓度后者，接种至已附着前述喂食细胞之培养皿。于5％CO2、37℃之培养箱内，每日进行长尾猴胚胎干细胞用培养基(A)之交换进行培养，至长尾猴胚胎干细胞之群落成长至可继代培养为止(10天)。
长尾猴胚胎干细胞用培养基(A)之组成添加有含白蛋白83g/L及胰岛素100mg/L之血清代替物(专利文献1)20v/v％、MEM非必须胺基酸溶液(印皮多露建公司)1v/v％、丙酮酸钠1mmol/L、L-麸酰胺2mmol/L、2-乙基硫醇0.1mmol/L之DMEM∶Ham＝1∶1之混合培养基。
将上述培养之长尾猴胚胎干细胞群落，藉由胰蛋白酶处理(0.25w/v％胰蛋白酶)由培养皿分离。将部分培养皿中之细胞再接种至含有新喂食细胞之培养皿中，之后以相同条件继续培养4天，将剩余培养皿中细胞由培养皿剥离，计算细胞数。
将继代之胚胎干细胞群落培养结束后，将部分培养皿中之细胞与上述同样地由培养皿剥离，计算细胞数。培养皿中剩余之细胞，以4w/v％聚甲醛固定后，以FITC标记之SSEA-4抗体(圣克鲁斯公司)免疫染色，再以荧光显微镜以BP460-490nm、BA515nm进行观察。
其结果，长尾猴胚胎干细胞群落之形态，继代时或培养结束时之任一者，皆与以来自鼠胎儿纤维母细胞之喂食细胞培养者相等(图1、图2)，长尾猴胚胎干细胞系已增殖(图3)。又，培养结束时之免疫染色中，观察到为灵长类胚胎干细胞标志(marker)之一之SSEA-4之荧光(图4)，故证明系灵长类胚胎干细胞之群落。
藉此，说明了以本发明方法培育之由MRC-5培养之喂食细胞，可进行胚胎干细胞之培养。
实施例3将由与实施例1相同之细胞库分让之MRC-5，使用喂食细胞培育培养基(B)使细胞数悬浊成2.4×106cells，而于涂布明胶之培养皿上，进行4次之继代培养培养至53.68PDL。接着，将上述培养之MRC-5，使用含有最终浓度为10μg/mL之MMC之喂食细胞培育培养基(B)，培养2～3小时，使细胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之喂食细胞培育培养基(B)，以PBS将细胞洗净3次制成喂食细胞。
将该喂食细胞，于涂布明胶之直径60mm培养皿上，以每1枚约4×105个之活细胞数接种附着。于已附着前述喂食细胞之培养皿，将冷冻保存之长尾猴胚胎干细胞解冻后，以长尾猴胚胎干细胞用培养基(A)使活细胞数悬浊成约2×105cells/ml之浓度进行接种。于5％CO2、37℃之培养箱内，每日进行长尾猴胚胎干细胞用培养基(A)之交换进行培养，至长尾猴胚胎干细胞之群落成长至可继代培养为止(10天)。藉由胰蛋白酶处理(0.25w/v％胰蛋白酶)，将胚胎干细胞群落分离，并将部分培养皿中之细胞再接种至含有新喂食细胞之培养皿中，之后以相同条件继续培养4天，将剩余之培养皿中细胞由培养皿剥离，计算细胞数。
将继代之胚胎干细胞群落培养结束后，将细胞由培养皿剥离，计算细胞数。其结果，长尾猴胚胎干细胞群落之形态，继代时或培养结束时之任一者，皆与以鼠喂食细胞培养者相等(图5、图6)，细胞系已增殖(图7)。
藉此，与实施例2相同，说明了使用涂布明胶之培养皿，则藉由制成之由MRC-5培养之喂食细胞，可进行胚胎干细胞之培养。
实施例4将由与实施例1相同之细胞库分让之MRC-5，使用喂食细胞培育培养基(B)使细胞数悬浊成2.1×105cells，而于涂布明胶之培养皿上，反复进行继代培养至增殖情况变差为止，以无血清培养调查增殖界限。其结果，由本发明培养基之喂食细胞作成之纤维母细胞，由41.77PDL起亦可增殖至4次之继代培养，并确认可分裂成约53PDL(图8)。
藉此，说明了由1种之细胞株可培育相当量之喂食细胞。
实施例5将由与实施例1相同之细胞库分让之MRC-5，使用喂食细胞培育培养基(B)使细胞数悬浊成2.1×105cells，而于涂布胶原之培养皿上，反复进行继代培养至增殖情况变差为止，以无血清培养调查增殖界限。
其结果，由本发明培养基之喂食细胞所得之纤维母细胞，由41.77PDL起亦可增殖至7次之继代培养，并确认可将纤维母细胞分裂成接近有限分裂细胞之界限之约60PDL(图9)。
藉此，说明了藉由将本发明之培养基与涂布胶原组合，可培育更多之喂食细胞。
实施例6以添加FBS 10v/v％之MEM培养基，将由细胞库分让之人类正常2倍肺纤维母细胞株(TIG-3)培养至28.76PDL，使用喂食细胞培育培养基(B)，使细胞数悬浊成1.8×105cells，而于涂布胶原之培养皿上，以2次之继代培养培养至35.51PDL。
接着，以含有最终浓度为10μg/mL之MMC之喂食细胞培育培养基(B)，培养2～3小时，使细胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之培养基，将细胞以PBS洗净3次。藉由胰蛋白酶处理(0.25w/v％胰蛋白酶、1mM EDTA)，将洗净后之细胞由培养皿剥离，计算细胞数。其结果，可制得约2.1×107cells之喂食细胞。
藉此，说明了藉由本发明之培养基，亦可由MRC-5以外之纤维母细胞株，培育大量之喂食细胞。
比较例1将由与实施例1相同之细胞库分让之MRC-5，改变成使用添加了FGF1μg/L、胰岛素5mg/L且不含血清白蛋白之MCDB202初代纤维母细胞用培养基(以下称「FGM」，Cambrex公司)，悬浊成2.2×105cells，于涂布明胶之培养皿上，进行1次之继代培养。然而，继代后细胞之增殖停止，且无法进行MMC处理，而难以培育喂食细胞。
比较例2将由与实施例1相同之细胞库分让之MRC-5，使用FGM悬浊成2.2×105cells，于涂布明胶之培养皿上，进行1次之继代培养。然而与比较例1相同，继代后细胞之增殖停止，且无法进行MMC处理，而难以培育喂食细胞。
藉由本发明，可以来自动物之感染疑虑少之无血清培养基，生产含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞所使用之喂食细胞。再者，藉由与明胶及胶原等细胞黏连因子组合，可长时间培养，故可将来自特定供体之材料作极致利用，而能将因改变喂食细胞供应源而产生之混入感染源之危险降至非常低。又，根据实施例，确认本发明可利用复数之细胞株，故可利用于多种类之来自动物之胚胎干细胞所适合之各种喂食细胞之培育。


本发明系提供一种胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基，系将培养包含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞所使用之喂食细胞，由来自特定供体之材料有效率地建立、并能以感染机会少之状态进行培养。并且，提供一种与包含人类胚胎干细胞之胚胎干细胞共同培养亦较安全之喂食细胞之制造方法，以及由此方法制得之喂食细胞。于基本培养基中，由至少含有血清白蛋白及胰岛素之胚胎干细胞用喂食细胞培育培养基，将含有选自由胚胎干细胞之喂食细胞所得之胎儿表皮纤维母细胞、胎儿肌肉纤维母细胞、胎儿肺纤维母细胞、胎儿上皮细胞、胎儿内皮细胞、成体表皮纤维母细胞、成体肺纤维母细胞、成体上皮细胞、成体内皮细胞中之至少1种细胞种源之细胞集团安定地进行增殖。