专利名称：一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的cik细胞的制备方法过继性细胞免疫治疗是指通过输注自身或同种特异性、非特异性抗肿瘤免疫效应细胞，直接杀伤肿瘤细胞或病毒的治疗方法。过继性细胞免疫治疗已进入临床应用，并成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗方法，特别是过继免疫治疗中的CIK细胞治疗，因具有细胞增殖速度快、杀伤活性高、临床应用副作用小等优点已广泛应用于临床。CIK细胞(Cytokine hduced Killer)最初是指在正常人体外周血中只占的⑶3+⑶56+T淋巴细胞。临床应用的CIK细胞是经体外扩增的，以⑶3+⑶56+、⑶3+⑶8+、⑶4+ 为主的异质性细胞群，是一种高效的具有广谱杀瘤活力的免疫效应细胞，也是目前国际上公认的最有效的肿瘤生物治疗细胞之一。临床上单独应用体外培养的各类效应性T细胞治疗实体瘤的总体有效率均未超过30%。其中肿瘤患者存在免疫抑制因素是重要原因。近年来肿瘤免疫抑制网络的重要节点-CD4+CD25+F0xp3+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的作用日益受到重视。在荷瘤机体内，Treg细胞数量明显升高。越来越多的证据表明，荷瘤机体内Treg细胞的增加成为导致肿瘤免疫逃逸和限制肿瘤免疫治疗疗效的重要原因之一。所以对Treg调控成为肿瘤免疫治疗的重要环节。天然Treg是一个具有免疫调节作用的T淋巴细亚群，约占⑶4+T细胞的 5% _10%，起着维持机体自身免疫耐受的作用。而当机体内Treg数量增多或功能增强时， 机体就会处于一种高度免疫耐受的状态。现已证实，各种肿瘤患者均能检测到Treg数量有增多趋势。Treg发挥免疫抑制功能可能通过以下途径①Treg通过直接的细胞接触来发挥作用，或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子来抑制效应细胞；②抑制效应性⑶4+Τ 细胞、CD8+T细胞的活化、增殖；③或经由穿孔素和颗粒酶B途径直接杀伤CD4+T细胞、CD8+T 细胞；④抑制树突状细胞(DC)的功能，通过下调转录因子NF-κ B，抑制共刺激分子⑶80、 ⑶86、⑶40以及TNF-α、IL_12的产生；⑤减少CIK或NK细胞中表达的NKG2D受体的数量， 产生的TGF-β抑制NK细胞的细胞毒性；⑥抑制T细胞依赖的B细胞产生免疫球蛋白；⑦抑制免疫效应细胞向肿瘤局部微环境聚集。Treg细胞的抑制作用，既发生在效应细胞活化的最初启动阶段，又发生在效应性细胞发挥杀伤肿瘤细胞作用的最终效应阶段，Treg细胞对效应性细胞增殖、杀瘤能力均有很强的抑制性。Treg在正常人体的外周血单核细胞(PBMC)中以小于5%的比率存在，但在肿瘤患者中这一比例提高。此外，体外培养CIK细胞时所用的IL-2能诱导Treg细胞增殖，并分泌大量IL-10，由此抑制CIK细胞增殖、降低其细胞杀伤能力。因此迫切需要除去培养前的 Treg细胞、培养过程中转化的Treg细胞，以改善CIK细胞的杀伤能力。免疫磁珠(Immunomagnetic bead, 1MB)技术是由 John Ugelstar 等于 1979 年提出的一种免疫学技术。1MB为包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性。该技术被广泛地应用于医学卫生领域的许多方面，并由此引发了生物分离技术上的一次革命。1MB技术区别于流式细胞技术的一个最明显的优势在于，它可以保证被分离靶细胞的形态和功能完整。免疫磁珠技术同时还具有灵敏度高、特异性高、检测速度快、重复性好、操作简单和不需要昂贵的仪器设备等优点。用1MB技术进行细胞分离有两种方式，一种是直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法称为阳性分离；用1MB去除无关细胞使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。因此可以利用免疫磁珠将PBMC中的Treg细胞去除。2003年Rudensky等研究证明Foxp3在T细胞上特异性表达，且R)xp3为Treg细胞发育所必需，在调控T细胞的发育上起着非常重要的作用。Foxp3是Treg细胞发育的一个重要开关。没有1^即3就没有Treg细胞，因此我们可以利用抑制R)xp3的活性，控制CIK 细胞培养中iTreg细胞的产生。IL-21是IL-2家族成员，主要由⑶4+T细胞分泌，在T细胞、NK细胞、B细胞上均发现其受体。IL-21能促进T细胞、NK细胞的增殖和功能，以及能促进CD8+细胞抗肿瘤作用。 IL-21可抑制⑶4+CD25+Treg的主要调节者转录因子R)xp3的表达，减少⑶4+T细胞分化形成Treg细胞，从而相应地抑制Treg细胞的产生。因此我们利用免疫磁珠分选技术在CIK 细胞培养前去除Treg细胞，培养过程中加入IL-21，减少⑶4+T细胞的分化形成Treg细胞， 以提高CIK细胞的免疫治疗效果。众所周知IFN- γ、⑶3单抗、IL-2是刺激CIK的主要细胞因子，但前已述及IL_2能诱导Treg细胞增殖，并分泌大量IL-10，由此抑制CIK细胞增殖、降低其细胞杀伤能力。我们在CIK 细胞制备过程中也发现，加入IFN-Y刺激，PBMC会发生凋亡，影响了细胞的扩增， 因此IL-2、IFN- γ不宜加入过多。而PHA对PBMC的诱导效果和IFN- γ相同，并且具有高效的促增殖作用，可作为T细胞的强激活剂，促进免疫活性细胞前体向免疫活性细胞转化。 因此我们推荐用PHA替代部分IFN- y。CIK细胞的毒性需要提高，亚硒酸钠价格低廉，能提高CIK细胞的毒性，因此我们推荐在CIK细胞培养时加入亚硒酸钠。
本发明提供一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法。解决现有方法制备的CIK细胞存在纯度低、增殖力低、细胞毒活性低的缺点。本发明的技术方案是采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini MACS分选去除⑶4+CD25+Treg细胞，得到⑶3+、⑶4+、⑶8+的T细胞。将得到的细胞置于含有PHA、IFN- γ的培养液中，使悬浮液中的PHA浓度为100ng/ml,37°C,5% CO2的培养箱中孵育24h后，移至经CD3单抗(1 μ g/ml) 包被的细胞培养瓶中，加入 IFN-y (1000U/ml)，48h 后加入 IL-2 (500U/ml)、IL-21 (lOOng/ml)，4天后补充含有亚硒酸钠(0. 005mg/L)培养基继续培养7_14天，即可得到高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。具体是(I)Ficoll密度梯度法分离患者抗凝血得到单个核细胞；(2)经Mini MACS高强度磁珠分离柱(德国MACS公司)分离，除去CD4+CD25+Treg 细胞，获得CD3+、CD4+、CD8.的T细胞；(3)含10%自身血浆的培养基重悬上述获得的细胞，经PHA(100ng/ml)活化，孵育 24h后，移至经CD3单抗(1 μ g/ml)包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ (1000U/ml)；(4) 48h 后加 IL-2 (500U/ml)、IL-21 (100ng/ml)；(5) 4天后补充含有亚硒酸钠(0. 005mg/L)的培养基继续培养7_14天，即可得到高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。本发明所述的培养基为GT-551人淋巴细胞培养基或RPMI1640培养基，添加10% 自身血浆。患者外周血单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离收集。所述的CD3+、 CD4+、CD8+的细胞是采用Mini MACS间接免疫磁珠负向分选方法去除Treg细胞后获得的CIK 前期细胞。所述的IFN- γ浓度为1000U/ml，CD3单抗为1 μ g/ml ,IL-2为500U/ml、IL_21为 lOOng/ml，亚硒酸钠为0. 005mg/L，依据单个核细胞的浓度不同，细胞继续培养时间约7_14 天收集细胞。本发明的制备方法培养前使用磁珠分选去除Treg细胞，培养中加入IL-21抑制 iTreg细胞转化。同时加入PHA以促进CIK细胞增殖，加入亚硒酸钠提高了 CIK细胞毒作用， 获得的CIK细胞具有更佳的肿瘤治疗效果。上述方法所得的CIK细胞，包括⑶3+CD56+双阳性、⑶4+、⑶8+的细胞总比率占 83% -95% ；同时去除了 CD4+CD25+Treg 细胞。上述方法所制得的CIK细胞，其能用于治疗各种肿瘤、治疗感染及其他免疫相关疾病的药物中。本发明的有益效果是提高了体外扩增的CIK细胞的数量、活性和纯度，使CIK抗肿瘤作用增强。本发明属于体外细胞培养技术领域，具体是一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法。该制备方法是采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini MACS免疫磁珠去除CD4+CD25+Treg细胞，分选得到CD3+、CD4+、CD8+的T细胞；将得到的细胞置于含有植物血凝素(PHA)的培养液中，使悬浮液中的PHA浓度为100ng/ml，37℃、5％CO2的培养条件下孵育24h后，移至经CD3单抗(1μg/ml)包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ(1000U/ml)，48h后加入IL-2(500U/ml)、IL-21(100ng/ml)，4天后补充含有亚硒酸钠(0.005mg/L)的培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。本发明提高了体外扩增的CIK细胞的数量、活性和纯度，使CIK抗肿瘤作用增强。