专利名称：高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞的制备方法γ δ T细胞是介于获得性免疫和天然免疫之间的特殊免疫类型细胞，具有抗原特异性识别功能而无MHC限制性。目前用于抗肿瘤研究的Y δΤ细胞主要是指VY9VS2T细胞，约占外周血Y δ T细胞的50-95%。人外周血的V γ 9V δ 2Τ细胞通过细胞表面TCR识别非肽类磷酸化抗原，在抗原识别过程中无需MHC分子的限制和提呈。目前常用于活化V γ 9V δ 2Τ细胞的非肽类磷酸化抗原有异戊二烯焦磷酸(IPP)、含氮双磷酸盐(N-BPs)及烷基胺。其中IPP是甲羟戊酸通路的中间产物，能直接引起V γ 9V δ 2Τ细胞的活化。N-BI^s及烷基胺是通过抑制甲羟戊酸通路的限速酶一法尼基二磷酸合酶，使胞内IPP蓄积，从而间接活化Vy 9V δ 2Τ细胞。由于 IPP在肿瘤细胞内广泛存在，使V γ 9V δ 2Τ细胞对IPP刺激适应，并呈弱反应或无反应。故使用更为有效的磷酸抗原是目前需要解决的技术难题之一。最新研究表明，2-甲基-赤藻糖醇-4-磷酸途径的产物羟甲异戊烯二磷酸酯 (HMBPP)是目前功能最强的V γ 9V δ 2Τ细胞激活剂，其刺激V γ 9V δ 2Τ细胞增殖能力是IPP 的10000倍，法国hnate Wiarma公司所合成的磷酸化抗原HDMAPP (商品名Picostim)的结构式与HMBPP基本相同，经体外实验证实同样具有强大的刺激V γ 9V δ 2T细胞的功能。磷酸化抗原与IL-2联用可在体外选择性扩增V γ 9V δ 2Τ细胞，并在临床试验中得到了证实。利用这一方法体外扩增肝癌、结直肠癌、血液肿瘤患者的自体VY9VS δ2Τ细胞技术已经建立。这些V γ 9V δ 2Τ细胞大多数为⑶27XD45RA+表型，表达穿孔素、颗粒酶A和 B和分泌IFN- γ，并且呈现多细胞克隆的多样性。目前已开展V γ 9V δ 2Τ细胞治疗晚期肿瘤的I期临床研究，Bennouna等人对10 例晚期肾癌研究发现60% (6/10)的患者疾病稳定，稳定时间达25. 7周。Dieli等人利用 VY9V52T细胞激动剂和IL-2治疗18例激素抵抗性前列腺癌，结果有3例部分缓解，5例稳定。尽管V γ 9V δ 2Τ细胞治疗在可行性、治疗耐受以及初步的疗效方面取得了令人鼓舞的结果，但是该疗法尚未取得最佳疗效，其主要原因在于V γ 9V δ 2Τ细胞的体内杀伤肿瘤活性还有待提高。因此，寻求增强V γ 9V δ 2Τ细胞的抗肿瘤细胞毒活性的新手段十分必要。IL-21是一个良好的细胞因子，IL-21R广泛表达于包括活化的、δ T细胞在内的淋巴细胞表面。IL-21与IL-2、IL-15等细胞因子联用可协同刺激原始和记忆性⑶8+T细胞及NKT细胞增殖，IL-21同样可以刺激Y δ T细胞的短期增殖，并且通过上调穿孔素和颗粒酶来增强NK和⑶8+Τ细胞的抗肿瘤功能，因此我们选择IL-21来刺激V γ 9V δ 2Τ细胞。本项发明证实IL-21在一定程度上能促进磷酸化抗原活化的V γ 9V δ 2Τ细胞的分裂，短暂诱导V Y 9V δ 2Τ细胞增殖。IL-21与IL-2共同刺激的V γ 9V δ 2Τ细胞抗肿瘤功能显著增强， 表现为⑶56及一些溶酶体颗粒表达增加。由于V γ 9V δ 2Τ细胞在人外周血中含量极微，单用磷酸抗原HDMAPP刺激扩增两周获得的细胞纯度仍低于70%，无法为临床提供一种高纯度的细胞制剂，因此我们发明一种先用免疫磁珠分选技术富集V γ 9V δ 2T细胞，然后用HDMAPP联合IL-2和IL-21扩增高纯度VY9VS2T细胞的方法。
本发明提供一种高纯度、高细胞毒活性的Y δ T细胞的制备方法，能提高Y δ T细胞纯度，及CD56+、穿孔素、颗粒酶表达率。克服现有制备Y δ T细胞的方法存在纯度低、细胞毒活性低的技术问题。本发明所采用的技术方案是一种制备Vy 9V δ 2Τ细胞的方法，包括如下步骤采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini MACS分选得到γ δ T细胞，再经HDMAPP激活， 同时加入IL-2和IL-21，置于37°C，5% CO2的培养箱中孵育，4天后补充含有IL-2的培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高细胞毒活性的V γ 9V δ 2T细胞。根据本发明，所述的培养基为GT-551人淋巴细胞培养基或RPMI1640，并添加10% 自身血浆。所述的单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水清洗，低速离心后获得。所述的Y S T细胞是指Vy 9V δ 2Τ细胞，采用Mini MACS间接免疫磁珠正向分选方法获得。所述的HDMAPP的终浓度为3 μ M，细胞因子IL-2的终浓度为100IU/ ml，IL-21的终浓度为lOng/ml。依据单个核细胞的浓度不同，细胞继续培养时间约7_14天。本发明所用的原料和试剂除特别说明外，均市售可得。本发明的有益效果是利用免疫磁珠分选技术以获得高纯度的Y δ TCR阳性细胞，然后联用IL-2和IL-21共同刺激培养的γ δ T细胞，使其抗肿瘤功能增强。解决了现有技术体外扩增的Y ST细胞纯度低及细胞毒活性低的问题。3)高效Y δ T细胞的诱导扩增将上述获得的Y δ T细胞置于含有HDMAPP(3 μ Μ)的RPMI1640培养液中，放入 225cm2的培养瓶中，同时加入细胞因子IL-2(终浓度为100IU/ml)和IL_21(终浓度为 10ng/ml)，置于37°C，5% CO2的培养箱中孵育，每M小时观察细胞形态及生长情况，并计数细胞。每2-3天补充含有IL-2的培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高细胞毒活性的Y δ T细胞。实施例21.培养的、δ T细胞形态学观察细胞培养Mh即可见γ δ T细胞贴壁生长，每个集落约3-6个细胞，48h后集落开始变大，培养IOd可见大的集落和极少量单个贴壁生长细胞，单个细胞呈条梭状。培养IOd 的细胞涂片行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积大，呈椭圆或不规则形，细胞核大多为椭圆或圆形，核染质疏松，核膜不规则，有凸起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富， 染成灰兰色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。透射电镜见细胞呈圆形，表面有较多的细长突起的微绒毛，胞质中见多组高尔基氏器，较丰富的粗面内质网，线粒体细小，电子密度高，还可见高电子密度颗粒和脂滴，细胞核椭圆有凹陷，常染色质多细小，分布均勻，异染色质少，核仁明显。取培养10天的细胞 100 μ 1，加入100 μ 1 0. 4%台盼蓝染色液，活细胞不被染色，死细胞被染成蓝色，显微镜下计数。本发明制备的细胞活力大于90%。2.培养的Y δ T细胞纯度及免疫表型检测分别取培养0、4、7、10天浓度约106/ml的细胞100 μ 1，分别加入检测用鼠抗人 CD3-FITC、V δ 2-FITC、CD56-PE抗体10 μ 1，室温避光孵育30分钟，用PBS洗涤两次，经流式细胞仪检测，本发明制备的细胞制剂，⑶3+Τ细胞高度富集达到99. 5% 士0. 3%，⑶3+V δ 2+Τ 细胞从1. 3% 士0. 6%急速扩增到93. 8% 士4%，⑶3+V δ 2+Τ细胞在培养第7天达到峰值， 直到第10天保持稳定。3.培养的Y δ T细胞细胞毒活性的测定取对数生长期的肾腺癌786-0细胞株作为靶细胞，靶细胞悬液浓度为lX105/ml、 5XioVml,2. 5X 104/ml，每孔取100 μ 1铺于96孔培养板中，培养24小时，取本发明制备的细胞浓度调节为lX106/ml，加入96孔板中，使效靶比分别为10 1,20 1和40 1，各浓度设3个复孔并分别设空白对照，培养48小时后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20 μ 1，继续培养4小时后弃上清，每孔加入DMSO 100 μ 1，于570nm处读取吸光度值，计算杀伤率。结果显示本发明制备的Vy 9V δ 2T细胞对786-0细胞株的杀伤活性高于单用IL-2 时的5倍，证实IL-2和IL-21联用对增强V γ 9V δ 2Τ细胞的抗肿瘤效应有协同作用。本发明公开了一种高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞的制备方法。属于体外细胞培养领域。方法包括采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini MACS分选得到γδT阳性细胞，再经磷酸抗原HDMAPP(3μM)激活，同时加入基因重组人细胞因子IL-2(100IU/ml)和IL-21(10ng/ml)，置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育，4天后补充含有IL-2的培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞。本发明利用免疫磁珠分选技术以获得高纯度的γδTCR阳性细胞，然后联用IL-2和IL-21共同刺激培养的γδT细胞，使其抗肿瘤功能增强；解决了现有技术体外扩增的γδT细胞纯度低及细胞毒活性低的问题。