专利名称：高度增殖的重组细胞的制作方法重组微生物被这些使用(以肥料、益生菌、疫苗等形式)或者用于以廉价和灵活的方式来生产多种分子,如DNA构建体、多肽等。然而，更高的产量需要高密度培养微生物，尤其是细菌细胞，而这仍然是困难的。此外，发酵是在肉汤(发酵液)中进行微生物培养的结果，并且导致乙酸盐/酯的大量生产(尤其是当糖酵解超过Krebs循环时)，进而抑制它们的生长。 已经实现了数种可能性，如透析、过滤以及添加纯氧。通过透析或过滤从微生物中分离乙酸盐/酯允许所述微生物进一步生长，具有以下限制，例如价格以及得到的产物在培养基中可能的稀释度。添加氧气有利于氧化代谢，而不利于糖酵解，以及乙酸盐/酯的消耗。然而，这种方法需要将更复杂的设备添加至到生物反应器中。欧洲专利申请EP0316229描述了提供降低的乙酸盐/酯产量以及增加的细胞密度和随后产量的突变的大肠杆菌菌株。然而，在这个专利申请中未公开得到的一个或多个突变，以及受影响的一个或多个途径。经鉴别TldD和tldE基因对于小菌素B17的加工和成熟是必要的(Allali, N. , Afif, H. , Couturier, M. and Van Melderen, L. (2002))。大肠杆菌的高度保守的TldD和tldE蛋白涉及小菌素B17的加工以及CcdA降解(J. Bacteriol，184，3224-3231)。由于在许多真细菌和古细菌中TldD和tldE蛋白是高度保守的，这说明它们具有其他重要作用。由dam基因编码的甲基化酶(Dam甲基化酶)将甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸转移到序列GATC中腺嘌呤残基的N6位置上。Dam涉及对于特定内切核酸酶的耐受性，涉及DNA的修复机制以及涉及基因表达的控制。
本发明提供了不存在现有技术缺点的新型重组细胞以及它们的制备方法。优选地，本发明提供了具有改进特性(像降低的乙酸盐/酯产量以及对于乙酸盐/酯降低的敏感度)的这类细胞，与野生型菌株相比较具有延长的对数生长期以及产生更高数量的活细胞的细胞，用于改善(增加)有价值的生物或化学下游产物的产量，所述有价值的生物或化学下游产物是指从这些细胞中获得的内源性以及外源性分子，像核酸构建体、多肽、糖类、脂质、维生素等。此外，本发明提供了具有增加的质粒数量的细胞。本发明的第一方面涉及用于改善(增加)(原核生物)细胞生长的方法，其中(天然地)包括(野生型和/或功能性)tldD和/或tlaE、以及dam核苷酸序列的这种细胞(野生型细胞)经受所述tldD和/或tlaE、以及dam核苷酸序列的部分或全部缺失，或者经受使TldD和/或TlaE、以及Dam蛋白(的功能)失活的一个或多个突变。该一个或多个突变包括在这些tldD和/或tlaE、以及dam核苷酸序列中的一个或多个突变，优选地引起核苷酸的插入或缺失，和/或引入终止密码子和/或产生具有用一个氨基酸取代另一个氨基酸的翻译的肽链，并且还(有可能地)包括在这些tldD和/或tlaE、以及dam序列的下游和/或上游起作用并且产生相同表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。优选地，使Dam蛋白失活的突变将其活性部分地失活。 部分失活优选地是指截短该蛋白保留野生型蛋白的N-端部分，并且有可能产生比野生型活性更低活性的蛋白。根据本发明，使Dam蛋白失活的一个突变(优选地)是dam : :kan突变。有利地，dam序列的3’区域的缺失产生由dam天然序列的5’区域组成的序列，更优选地，从核苷酸I开始直至核苷酸178，并且对由天然Dam蛋白的59个氨基端氨基酸(大肠杆菌；SEQ. ID. NO. 8)组成的称为Daml-59多肽的进行编码的序列。这个核苷酸序列称为短dam序列。短dam序列(大肠杆菌；SEQ. ID. NO. 7)缺少从核苷酸179至核苷酸837的dam天然序列的3’末端。在dam kan突变体中获得同样的突变。 可替代地，在dam序列中的一个或多个突变可以是完全缺失或者使其活性完全失活的一个或多个突变。有利地，用于改善(增加)(原核生物)细胞生长的本方法还包括使(原核生物)细胞经受csrA核苷酸序列的3’部分的缺失或者经受使这种CsrA蛋白的活性降低(部分失活)的一个或多个突变的步骤。优选地，csrA序列3’区域的缺失产生了由csrA天然序列的5’区域组成的序列，更优选地，从核苷酸I开始直至核苷酸150，并且对由天然CsrA蛋白的50个氨基端氨基酸组成的称为CsrAl-50的多肽进行编码的序列。这种核苷酸序列称为短csrA序列。该短csrA序列缺少从核苷酸151至核苷酸186的csrA天然序列的3’末端。优选地，在用于改善(增加)(原核生物)细胞生长的这种方法中，使这种(原核生物)细胞生长在补充有碳源的培养基中，所述碳源优选地是糖分解碳源和/或选自由甘油、丙酮酸盐和/或糖分解糖类组成的组中，更优选葡萄糖。本发明的一个相关方面涉及用于在(原核生物)细胞中增加质粒数量(相对丰度；μ g质粒DNA : μ g染色体DNA)的方法，包括使(这种(原核生物)细胞的)tldD和/或tldE基因经受使TldD和/或TldE蛋白失活的一个或多个突变的步骤。优选地，在用于增加质粒数量的这种方法中，与对照细胞(参照或野生型细胞)相比较，经受使TldD和/或TldE蛋白失活的一个或多个突变的(重组)细胞的质粒数量增加了至少3倍，优选至少10倍。该一个或多个突变包括在tldD和/或tldE核苷酸序列中的一个或多个突变，优选地引起核苷酸的插入或缺失，和/或引入终止密码子和/或产生具有用一个氨基酸取代另一个氨基酸的翻译的肽，而且还包括在这些tldD和/或tldE序列的下游和/或上游起作用并且产生相同表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。使TldD和/或TldE蛋白失活的优选的突变是这些tldD和/或tldE基因的完全缺失。优选地，在用于增加质粒数量的这种方法中，质粒数量增加至少3倍。有利地，在用于增加质粒数量的这种方法中，质粒是低拷贝数量的质粒(即在正常条件下具有少于50个拷贝/细胞，优选地少于20个拷贝/细胞，更优选地少于15、10、9、8、7、6、或者甚至少于5个拷贝/细胞的质粒)。 优选地，用于增加质粒数量的这种方法进一步包括使(原核生物)细胞经受dam和/或csrA核苷酸序列的部分或全部缺失或者经受使产生的Dam和/或CsrA蛋白的活性失活的一个或多个突变的步骤。优选地,使Dan和/或CsrA蛋白失活的这些突变是dam核苷酸序列3’部分的缺失和/或csrA核苷酸序列3’部分的缺失，这导致产生截短的(短)Dam和/或截短的(短)CsrA蛋白。优选地，在用于增加质粒数量的这种方法中，使(原核生物)细胞生长在补充有碳源的培养基中，所述碳源优先选自由糖分解碳源组成的组中和/或选自由甘油、丙酮酸盐和/或糖分解糖类组成的组中，更优选葡萄糖。本发明的另一个方面涉及分离的(纯化的)高度增殖(重组)的(原核生物)细胞，其中tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列被部分地或全部地缺失或者包括使该tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列失活的一个或多个突变(优选地，其中使Dam失活的这种突变，例如dam核苷酸序列3’部分的缺失，是短dam序列，该短dam序列包含从核苷酸I开始直至核苷酸178的dam开放阅读框的5’区域或者使Dam蛋白失活的一个或多个突变，优选dam kan突变)，并且其中该细胞有可能进一步包括对感兴趣的基因产物进行编码的外源核苷酸序列。可能地，这种原核生物细胞不是大肠杆菌。该一个或多个突变包括在这些tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列上用于避免它们表达的一个或多个突变，而且还包括在这些tldD和/或tldE、以及dam序列的下游和/或上游起作用并且产生相同表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。优选地，这种细胞选自由梭状芽孢杆菌(Clostridium sp)、鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp)、芽孢杆菌、以及有可能地乳酸杆菌、双歧杆菌、乳球菌细胞组成的组中。本发明的另一个方面涉及分离的(以及纯化的)高度增殖(重组)的大肠杆菌细胞，其中 tldD 和 / 或 tldE、以及 dam 序列(SEQ. ID. NO. 1，SEQ. ID. NO. 3，SEQ. ID. NO. 5)被缺失或者包括使TldD和/或TldE、以及Dam活性失活的一个或多个突变(优选地，其中使Dam失活的这种突变，例如dam核苷酸序列3’部分的缺失，是短dam序列，该短dam序列包括从核苷酸I开始直至核苷酸178的dam开放阅读框的5’区域(SEQ. ID. NO. 7)，或者使Dam蛋白失活的一个或多个突变(和/或dam : kan突变))，并且其中该细胞进一步包括对感兴趣的基因产物进行编码的外源插入片段或外源核苷酸序列。该一个或多个突变包括在tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列上用于减少或避免它们表达的一个或多个突变，而且还包括在这些tldD和/或tldE、以及dam序列的下游和/或上游起作用并且产生相同表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。“对感兴趣的基因产物进行编码的外源核苷酸序列或插入片段”是指有可能涉及生物或化学化合物生产的核苷酸序列，所述生物或化学化合物是感兴趣的基因产物，它们并非天然存在于(野生型)细胞中，并且它们对于工业、医药、化妆品、化学或环境应用具有价值。感兴趣的这些基因产物的非限制性实例是核苷酸序列(有可能包括在载体中，例如质粒、病毒或噬菌体)、糖类(包括低聚和多聚糖)、脂质(包括脂肪酸，如ω-3脂肪酸)、生物聚合物、酸(包括丁酸)、维生素、烃类以及衍生的产物，包括聚合物、亚铁血红素、酶和辅酶、细菌素、抗体(或其部分，包括纳米抗体)、基于核苷酸的疫苗组合物、用于免疫的(多)肽(或其部分，如抗原决定簇)以及可以重新获得用于任何工业、医药、化妆品、化学、食品相关或环境应用的任何蛋白。有利地，感兴趣的基因产物是免疫学活性的基因产物(免疫抑制化合物或免疫刺激化合物)或者可以由在降解环境污染物方面有效的化合物组成，优选杀虫活性的产物。 感兴趣的基因产物也可以包括多肽或由多肽组成，如抗原或抗原的部分、酶、抗血栓溶解化合物(anti-thrombolytic compound)、激素、神经递质、抗体、抗体的部分、纳米抗体、涉及多糖合成的蛋白、维生素、脂类、涉及转运重金属的蛋白、疫苗佐剂、等等。有利地，这些高度增殖的(原核生物)细胞(编码野生型和/或功能性CsrA蛋白；大肠杆菌的SEQ. ID. NO. 9)进一步经受csrA核苷酸序列3’部分的缺失或者经受使这种CsrA蛋白的活性降低(部分失活)的一个或多个突变。优选地,csrA序列3’区域的缺失产生由csrA天然序列的5’区域组成的序列，更优选从核苷酸I开始直至核苷酸150，并且对由天然CsrA蛋白的50个氨基端氨基酸组成的称为CsrAl-50的多肽进行编码的序列(大肠杆菌的SEQ. ID. NO. 11)。这种核苷酸序列称为短csrA序列。该短csrA序列缺少从核苷酸151至核苷酸186的csrA天然序列的3’末端。在csrA kan突变体中获得同样的突变。此外，这种重组(原核生物)细胞还可以进一步包括一个或多个选择标记。“选择标记”是指在选择压力下赋予细胞优势的基因。发明人还观察到与不包括这些遗传修饰的对照(野生型)细胞相比较，本发明的重组细胞的糖原含量增加了 10倍，优选至少50倍。此外，发明人观察到本发明的重组(原核生物)细胞还存在其他表型，如降低的乙酸盐/酯产量。优选地，与对照(野生型)细胞(不存在这些遗传修饰的细胞)的产量相比较，在本发明的重组(原核生物)细胞中，乙酸盐/酯的产量至少降低的系数为10%，优选至少15%，更优选至少20%。发明人观察到，与不包括这些遗传修饰的对照(野生型)细胞的生长相比较，本发明的高度增殖的细胞具有延长的指数生长，这意味着其生长增加了至少25%或50%，优选至少75%，更优选100%。有利地，根据本发明在高度增殖的细胞中，停滞期以及传代时间保持不受影响。出人意料地，与不包括这些遗传修饰的对照(野生型)细胞相比较，本发明的高度增殖的细胞对乙酸盐/酯的敏感度也降低了以下的系数，优选地至少30%。更优选至少50%，并且有利地至少75%。因此，本发明的另一个方面涉及用于获得降低(重组)细胞乙酸盐/酯产量的方法(优选地降低的系数为至少10%，优选至少15%，更优选地至少20%)，和/或将这种细胞对于乙酸盐/酯的敏感度降低的系数为至少30%，更优选至少50%，有利地至少75%的方法(与天然地包括tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列的对照(参照或野生型)细胞相比较)，其中使这种细胞经受tldD和/或tldE、以及dam序列的部分或全部缺失,或者经受使这些核苷酸序列失活的一个或多个突变(即，使相应的编码蛋白失活)。本发明还涉及与天然地包括tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列的对照(参照或野生型)细胞相比较，增加(重组)细胞糖原含量的方法(增加10倍，优选至少50倍)，并且其中使这种细胞经受tldD和/或tldE,以及dam序列的部分或全部缺失,或者经受使这些核苷酸序列失活的一个或多个突变(即，使相应的编码蛋白失活，例如dam核苷酸序列3’部分的缺失)或者经历使Dam蛋白的活性降低的一个或多个突变(使Dam蛋白活性部分地失活)。相反地，本发明涉及(本发明的)重组细胞用于糖原(增加的)产量的用途。该一个或多个突变包括在tldD和/或tldE、以及dam核苷酸序列中用于避免它们表达的一个或多个突变，并且还包括在这些tldD和/或tldE以及dam序列的下游和/或上游起作用并且产生相同表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。优选地,使dam序列失活的突变是dam kan突变和/或dam核苷酸3’部分的缺失导致daml-178序列，该daml-178序列包括从核苷酸I开始直至核苷酸178的dam开放阅读框的5’区域。 在根据本发明的一种或多种方法中，使(原核生物)细胞优选地生长在补充有碳源的培养基中，优先选自由糖分解碳源组成的组中和/或选自由甘油、丙酮酸盐和/或糖分解的糖类(如葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖或乳糖，更优选地葡萄糖)组成的组中的碳源，更优选地该培养基补充有葡萄糖。本发明的另一个方面是根据本发明的高度增殖的细胞用于合成感兴趣的分子的用途，所述感兴趣的分子优先选自由RNA或DNA序列、多肽(优选胰岛素)、尤其是抗原或抗原的部分、酶(包括木葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、酯酶等)、激素、维生素、亚铁血红素、月旨类、氨基酸、酸(如丁酸)、糖类(低聚和/或多聚糖)、生物聚合物、烃、碳水化合物(如糖原)、抗生素分子、质粒、病毒、噬菌体或它们的混合物组成的组中。根据本发明的高度增殖的细胞还可以用作益生菌或生物修复剂，并且本发明的最后一个方面涉及制药、化妆品、保健品、食品、饲料或饮料组成或者包括根据本发明的细胞的废物处理厂。根据本发明的高度增殖的细胞(具有重要的糖原存储作用)可以用于合成生物(生物可降解的)塑料，用于生产生物(生物可降解的)塑料袋或由“塑料”制成的其他设备(有可能通过使用糖原作为用于合成这种生物(生物可降解的)塑料的原料)，并且还用于制造纸张(造纸、具有改善的特性(光滑性、白度等)的纸涂层，等等)、食品(用作增稠剂和稳定剂的食品添加剂)、粘合剂以及胶(优选瓦楞板粘合剂)，用于石膏墙板制造过程中，用于纺织品化学药品中(在纺织期间用于减少纱线断裂或者用作纺织品印花增稠剂)，用于印刷工业中(用于制造防粘脏喷雾粉末(anti-set-off spray powder))以及用于石油开采中(用于调节钻井流体的粘度)。本发明的一个相关方面涉及(原核生物)细胞(如大肠杆菌)的用途，该细胞经受在对TldD和/或TldE蛋白进行编码的tldD和/或tldE核苷酸序列中的一个或多个突变，这些突变使这些TldD和/或TldE蛋白失活用来增加质粒数量(相对丰度；即μ g质粒DNA μ g染色体DNA )。该一个或多个突变包括在这些tldD和/或tldE核苷酸序列中的一个或多个突变，优选地引起核苷酸的插入或缺失，和/或引入终止密码子和/或产生具有用一个氨基酸取代另一个氨基酸的翻译的肽，并且还包括在这些tldD和/或tldE序列的下游和/或上游起作用并且产生同样表型的一个或多个核苷酸序列的一个或多个突变。使TldD和/或TldE蛋白失活的优选突变是这些tldD和/或tldE基因的完全缺失。优选地，在这些突变的(原核生物)细胞中，质粒数量增加了至少3倍。 有利地，这种质粒是低拷贝质粒(S卩，在正常条件下具有少于50个拷贝/细胞，优选地少于20个拷贝/细胞，更优选地少于15、10、9、8、7、6、或者甚至少于5个拷贝/细胞的质粒)。有可能地，在用于增加质粒数量的这种用途中，使(原核生物)细胞进一步经受使Dam蛋白(部分地)失活的一个或多个突变和/或经受使CsrA蛋白(部分地)失活的一个或多个突变。优选地,使Dam和/或CsrA蛋白失活的这些突变是dam核苷酸序列3’部分的缺失和/或csrA核苷酸序列3’部分的缺失,这导致产生截短的Dam和/或CsrA蛋白。
糖原合成还可以用作用于生产衍生糖类的底物，例如在食品工业中找到一些有利应用的麦芽糖糊精。非常出人意料地是以下事实，对于相同的葡萄糖消耗而言，与野生型菌株的O. 9g/I相比较(对照或参照)，本发明的这些双突变体和三(以及进一步的)突变体产生更少的乙酸盐/酯(即O. 6g/l)。使用K-Acet试剂盒(Megazyme)来测量乙酸盐/酯的产量。技术人员可以容易地找到其他方法并且将它们应用于本发明。还非常出人意料地是，与野生型菌株(对照或参照)(在O. 5g/l下抑制生长)相比较，增加了对双突变体和三(以及进一步的)突变体生长的乙酸盐/酯抑制作用的耐受性(至
O.9g/l)。优选地，本发明的高度增殖细胞(细菌)可以进一步包括选择标记。实施例2 :根据本发明的修饰的细胞菌株的用途根据本发明，进一步开发了结合用于表达感兴趣的蛋白的外源性(在细胞中不是天然存在的外源序列或插入片段)核苷酸序列的重组细胞(包括大肠杆菌菌株的细菌)，并且有利地，发明人测量了相应蛋白的增加的产量。发明人使用根据本发明的重组细菌，优选大肠杆菌菌株，用于生产多肽，优选胰岛素、以及酶，包括木葡聚糖酶、脂肪酶以及酯酶。发明人使用根据本发明的重组细菌，优选大肠杆菌菌株，用于生产氨基酸，例如苯丙氨酸。发明人使用根据本发明的修饰的细菌，用于生产肽类以及非肽类激素。此外，发明人使用根据本发明的重组细菌，用于生产维生素和辅酶，例如甲基萘醌类(维生素K2)、维生素B12、辅酶Qltl以及亚铁血红素基团。发明人使用根据本发明的重组细菌，用于生产脂类，尤其是包括Ω-3脂肪酸的那些。发明人使用如W02007/095215中说明的重组细菌(例如梭状芽孢杆菌菌株)，用于生产酸类，例如丁酸。出人意料地，发明人测量出这种重组细菌的乙酸盐/酯合成的降低，与生长增加相结合，起协同作用增加了丁酸的产量。有利地，发明人注意到在电解之后可以将丁酸转变成己烷。发明者使用根据本发明的重组细菌，用于通过野油菜黄单胞菌来生产低聚和/或多聚糖(例如黄原胶)和/或生产其他生物聚合物。
发明人获得了用于增加鞘氨糖(sphingan)产量的重组鞘氨醇单胞菌菌株，和/或用于合成琥珀酰聚糖多糖的苜蓿根瘤菌菌株。发明人获得了具有W02008/021141中所述的核苷酸序列的重组大肠杆菌菌株，用于增加从木质纤维素生物质生产乙醇的产量。发明人获得了根据本发明的大肠杆菌菌株，并且进一步用W02008/003078中所述的核苷酸序列转化，用于增加类异戊二烯脂类的产量。他们将这些方法应用于其他原核生物，包括光合作用种类。发明人修饰了根据本发明的大肠杆菌菌株，并且进一步具有Klocke等人说明的核苷酸序列(Applied Genetics and Molecular Biotechnology, 67, 532-538 (2005)),用于生产细菌素(肠道菌素A和B)。发明人修饰了根据本发明的大肠杆菌菌株，用于增加可以包括重组核苷酸序列的质粒或其片段的产量。·本领域的技术人员还可以修饰用作益生菌(活的微生物，当以适当量施用时，这些活的微生物赋予宿主健康的益处，尤其是在哺乳动物体内，包括人类)或者生物修复剂的细菌菌株。本领域的技术人员可以使用根据本发明的修饰的细菌，用于通过进一步分离具有免疫刺激特性的DNA片段序列(如富含CpG的片段)以及有可能地糖类衍生物来增加疫苗佐
剂的产量。除了在工业过程中有用的生长增加，发明人注意到在体内益生性微生物的生长增加。实施例3 :根据本发明的修饰的细胞菌株与其他高度增殖细胞的比较以及开发另一种高度增殖的细胞发明人进一步进行了经受tldD和tldE缺失以及经受Dam截短的本发明的高度增殖细胞与以前开发的经受tldD和tldE缺失以及经受CsrA截短的另一种高度增殖细胞的比较。他们进一步结合了所有这些tldD、tldE、Dam、CsrA突变。发明人发现本发明的高度增殖细胞优于他们以前开发的细胞。事实上，对于本发明的高度增殖细胞而言，测量的0D600约高20% (也参见图I)。发明人进一步注意到，结合的突变体没有受到添加突变的不利影响，而是进一步具有10%到20%附加的0D600值。实施例4 :用于增加细胞中质粒数量的方法发明人检验了 tldD和tldE基因的突变和/或Dam基因的突变是否会导致每细胞质粒拷贝数量降低，并且发明人通过与相应的野生型细胞比较，寻找突变的细胞中质粒的含量。与在具有TldD和/或TldE突变与Dam突变(如本发明的截短的Dam)相结合的，并且生长在含有葡萄糖(O. 4% ;W:v)的LB培养基中的(高度增殖的)细胞中减少的质粒含量不同，发明人测量出以归一化为细胞(染色体)DNA计(即相对丰度)质粒数量增加了 3至20倍。发明人进一步注意到低拷贝数量的质粒(例如具有少于50、20、15、10或者甚至5个拷贝/细胞)具有较高数值的倾向(从20%至100%额外的增加)。
然后发明人将这些结果与使用经受tldD和/或tldE突变(例如tldD和/或tldE的全部缺失)，但是在Dam或CsrA蛋白中没有突变的细胞获得的结果进行了比较。发明人发现甚至这种TldD和TldE突变的细胞也具有增加的质粒数量的相同表型，虽然增加的数量仅仅是野生型细胞数量的三至五倍(当用细胞DNA对计算进行归一化时)。 技术人员可以容易地将本发明应用于其他微生物中或应用于其他工业应用中。


本发明涉及增加细胞生长的方法，其特征在于tldD和/或tldE基因中的缺失或一个或多个突变，与dam中的一个或多个突变，或者dam基因中的部分缺失或缺失相结合，本发明还涉及获得的细胞并涉及其用途。