专利名称：一种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法细胞贴壁強度的检测是在生命科学研究及基础医学研究中经常遇到的问题。现有的细胞贴壁強度检测方法各有局限利用飞秒激光发射装置和原子力显微镜进行检测的方法(5ロ《Noncontact estimation of intercellular oreaking force using a femtosecondlaser impulse quantified by atomic force microscopy》所述的方法)虽然测量准确，对细胞无接触式伤害，但由于其所需设备及技术门槛过高，且检测耗时较长，操作繁琐，不利于该技术的普及和大范围应用；转碟法(如《A novel mode of cell detachment fromfibrillar fibronectin matrix under shear》所述的方法)虽然所需器材和技术门滥较低，但是需要对不同半径处的贴壁细胞进行计数，使得检测耗时较长，操作繁琐，而且其使用离心カ这ー非生物因素作为评价标准，影响了结果的准确性和生物学意义。
要解决的技术问题为了避免现有技术的不足之处，本发明提出ー种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁強度的方法，克服现有技术操作繁琐、不易于实现自动化、仪器及技术门槛过高的缺点。技术方案ー种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法，其特征在于步骤如下步骤I :以3 5 X IO4个/cm2的密度在细胞培养板中的多个孔中接种细胞，，置于37°C细胞培养箱中培养24h，使其充分贴壁；步骤2 :将细胞脱壁试剂进行倍半稀释，得到ー组脱壁试剂溶液浓度，各脱壁试剂溶液的浓度梯度的稀释倍数分别为2° J1J2J3J4J5J6 ；步骤3 :吸干细胞培养板中的培养基，分别将ー组脱壁试剂溶液中的每个脱壁试剂溶液浓度和磷酸盐缓冲液PBS加入细胞培养板中不同的孔内，温育5 20min，进行充分反应；温育5 20min，进行充分反应；步骤4 :将细胞固定液加入细胞培养板中，然后将细胞培养板置于振荡器或摇床上，震荡5 50min，以使细胞充分固定；步骤5 :检测每个孔内中仍贴壁的细胞的数量，并以PBS处理组的检测值为标准值，做归ー化分析，得出ー组脱壁试剂溶液浓度梯度的贴壁细胞比例Na ；重复步骤3 步骤5 :每个浓度梯度处理组做3个以上的重复；再做一组不吸干培养基的阴性对照，作为细胞接种数误差的对照；所述磷酸盐缓冲液PBS和脱壁试剂浓度溶液的体积ー样；步骤6 :对细胞贴壁强度评测I.以各浓度梯度处理组的Na值为横坐标，以各Na值对应的脱壁试剂稀释倍数D为纵坐标得到曲线图，以最小二乗法拟合曲线公式，得到Na=F(D)；2.选取1/2NA(PBS)为标准，代入上述曲线公式Na=F(D),计算出此时对应的脱壁试剂稀释倍数，D5(l%，并以D5(l%表征此种细胞的贴壁强度。所述的细胞固定液和脱壁试剂均采用PBS作为溶剂配制。所述细胞脱壁试剂为O. 025% O. 5%的胰酶溶液或O. 01% O. 2%的EDTA溶液。有益效果本发明提出的ー种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法，有益效果是由于采用细胞脱壁试剂这类细胞生物学中常用的实验试剂减弱细胞与基底间的粘附作用，之后固定细胞，检测处理后各浓度梯度处理组的贴壁细胞数，并以PBS处理组的检测值为标准值，做归ー化分析，制作以Na为横坐标，以D为纵坐标的曲线图，以V2Na (PBS)对应的稀释 倍数D5(l%来表征该种细胞的粘附强度。与现有技术相比，本发明体现了减少实验耗时，简化实验步骤，易于实现自动化批处理，提高測定精度及结果平行性的有益效果。步骤6 :对细胞贴壁强度评测I.以各浓度梯度处理组的Na值为横坐标，以各Na值对应的脱壁试剂稀释倍数D为纵坐标得到曲线图，以最小二乗法拟合曲线公式，得到Na=F(D)；2.选取PBS处理组Na值的一半，即选取1/2NA (PBS)为标准，代入上述曲线公式Na=F⑶，计算出此时对应的脱壁试剂稀释倍数，D5(l%，并以D5(l%表征此种细胞的贴壁强度。采用本发明所述的方法检测细胞粘附強度，在线性良好，数据结果标准差小，根据所得曲线方程及归ー化分析所得的贴壁细胞比例Na，可以快速、准确的检测出该种细胞的粘附强度。实施例2 :使用本发明所述方法检测细胞粘附強度 I.准备人骨肉瘤细胞系MG-63，以4X IO4个/cm2的密度在96孔板中接种细胞，即I.4X IO4个/孔，共接种50孔，每孔加200 μ I培养基。置于37°C细胞培养箱中培养24h，使其生长至80%的汇合率；2.以EDTA溶液为标准液，倍半稀释，配制浓度梯度溶液，各梯度溶液浓度分别为标准液浓度的 50%,25%,12. 5%,6. 25%,3. 13%Λ. 57%,O. 79% ；3.吸干96孔板中45个孔的培养基，以PBS及EDTA浓度梯度溶液(O. 79% 100%标准液浓度)处理细胞，每孔100 μ 1，每个浓度共做5个重复。最后5个留有培养基的孔作为细胞接种数误差的对照；4. 37°C细胞培养箱中消化IOmin ;5.用2%的戊ニ醛溶液固定细胞，每孔加100μ I ;6.将96孔板置于微孔振荡器上，全速震荡20min，以使细胞固定；7.吸去孔中液体，置于60°C烘箱中，烘干3h;8.用odyssey红外突光系统检测700nm处的突光信号；9.以PBS处理组的荧光强度值为标准值，对其余各组的荧光強度值做归一化分析，得到贴壁细胞比例，Na;10.以各处理组Na值与对应的EDTA稀释倍数D做曲线图，利用软件拟合曲线公式；11.选取PBS处理组Na值的一半，即72NA (PBS)为标准，代入上述曲线公式，计算出此时对应的EDTA稀释倍数D5(l%，并以D5(l%表征此种细胞的贴壁强度。采用本发明所述的方法检测细胞粘附強度，在线性良好，数据结果标准差小，根据所得曲线方程及归ー化分析所得的贴壁细胞比例Na，可以快速、准确的检测出该种细胞的粘附强度。实施例3 :使用本发明所述方法检测细胞粘附強度I.准备有GFP标记的小鼠颅顶前骨细胞系MC 3T3-E1，以4X IO4个/cm2的密度在96孔板中接种细胞，即I. 4X IO4个/孔，共接种50孔，每孔加200 μ I培养基。置于37°C细胞培养箱中培养24h，使其生长至80%的汇合率；2.以EDTA溶液为标准液，倍半稀释，配制浓度梯度溶液，各梯度溶液浓度分别为标准液浓度的 50%,25%,12. 5%,6. 25%,3. 13%Λ. 57%,O. 79% ；3.吸干96孔板中45个孔的培养基，以PBS及EDTA浓度梯度溶液(O. 79% 100%标准液浓度)处理细胞，每孔100 μ 1，每个浓度共做5个重复。最后5个留有培养基的孔作为细胞接种数误差的对照；4. 37°C细胞培养箱中消化IOmin ;5.用8%的多聚甲醛溶液固定细胞，每孔加100μ I ;6.将96孔板置于微孔振荡器上,全速震荡20min,以使细胞固定；7.吸去孔中液体，每孔加入200 μ I浓度为O. 25%的胰酶溶液，37°C温育，直至所有细胞都脱壁；8.收集细胞悬液，用流式细胞仪计数；9.以PBS处理组细胞数量为标准值,对其余各组的细胞数量做归ー化分析,得到贴壁细胞比例，Na;
10.以各处理组Na值与对应的EDTA稀释倍数D做曲线图，利用软件拟合曲线公式；11.选取PBS处理组Na值的一半，即72NA(PBS)为标准，代入上述曲线公式，计算出此时对应的EDTA稀释倍数D5(l%，并以D5(l%表征此种细胞的贴壁强度。采用本发明所述的方法检测细胞粘附強度，在线性良好，数据结果标准差小，根据所得曲线方程及归ー化分析所得的贴壁细胞比例NA，可以快速、准确的检测出该种细胞的粘附强度。


本发明涉及一种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法，技术特征在于由于采用细胞脱壁试剂这类细胞生物学中常用的实验试剂减弱细胞与基底间的粘附作用，之后固定细胞，检测处理后各浓度梯度处理组的贴壁细胞数，并以PBS处理组的检测值为标准值，做归一化分析，制作以NA为横坐标，以D为纵坐标的曲线图，以1/2NA(PBS)对应的稀释倍数D50％来表征该种细胞的粘附强度。与现有技术相比，本发明体现了减少实验耗时，简化实验步骤，易于实现自动化批处理，提高测定精度及结果平行性的有益效果。