专利名称：一种y染色体微缺失检测试剂盒的制作方法Y染色体是男性特有的染色体，其上有精子发生相关基因，对睾丸决定和睾丸分化过程起重要作用的基因和基因家族。当前男性不孕育的越来越多，影响男性不育的因素较多，如内分泌紊乱、遗传缺陷、环境因素或全身疾病等。其中由遗传因素引起的不育占整个影响因素的30%。Y染色体缺失是造成男性不育的主要遗传学因素之一，对Y染色体缺失进行检测具有重要的临床指导意义。Tiepolo等首先提出Y染色体上有多个基因参与生精过程。 称为无精子因子(AZF)。现已明确有3个与精子缺失直接相关的基因片段AZFa、AZFb、AZFc(在AZFb与AZFc之间还存在AZFd座位，中等程度的少精子和精子数目正常却形态异常多会与该区域的缺失有关)，分别位于Yql 1.23的近、中、远端，其缺失可导致无精子症或严重的少精子症，约占无精子症或严重少精子症总数的10% 15%。这些亚区所包含的位点在男性生殖过程的不同时期起着不同的作用，其中任何一个座位的微缺失都可导致生精障碍，可使患者表现为少弱精症甚至无精症，从而造成不育。AZFa缺失表现为唯支持细胞综合症为主的严重生精障碍，AZFb缺失表现为生精阻滞，AZFc缺失的表现可从正常到无精子，AZFd的缺失表现同AZFc缺失。但AZF并不是单一的基因，而是在功能上相互关联的基因家族，在精子发生、发育和成熟中发挥重要作用。研究显示，Y染色体微缺失机制可能与其内部同源重复序列间的重组有关。AZFa缺失是由HERV15重复序列之间的重组引起的；AZFb和AZFc区主要由5种具有回文结构的不同序列家族组装而成，而同源序列间的重组是导致他们缺失的主要原因；尤其是在AZFc区，大约94%是重复片段，长度介于115-700kb，这可能与AZFc区具有较高的缺失率有关。此外，Y染色体AZF区以外的重复序列之间的同源重组也可能造成一些缺失。运用降落式PCR (touchdown PCR, TD-PCR)技术，对Y染色体AZF基因片段序列标签位点(STS)进行检测分析，从而达到AZF基因微缺失的筛查，诊断Y染色体微缺失，找到不育的真正原因。从而避免不必要的药物及手术治疗，如一些激素的应用及精索静脉曲张的手术治，为男性不育的临床诊断和治疗提供指导。本方法亦适用于胞质内单精子注射(ICSI)技术辅助生育治疗前的检测、少精子症与无精子症男性患者遗传学检测、精子库的入库前筛查等。当前Y染色体微缺失检测的主要方法有Southern blot印记杂交,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)以及突光定量PCR。其中普通PCR电泳技术是应用最为广泛。然而，普通PCR扩增后经常出现两种情况①未扩增出任何产物导致假阴性结果。②未找到最佳扩增条件，产生大量非特异产物。在影响普通PCR扩增的众多因素中(如PCR仪器性能、反应体系、反应条件等)，退火温度的影响最大。
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用一种对Y染色体微缺失进行诊断的试剂，它可以简便、高效、特异的检测Y染色体缺失。一种Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括(i) PCR扩增反应试剂；(ii)扩增Y染色体AZFa区域SY84序列的引物SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2 ;其碱基序列为SEQ ID NO. I TCAGCAAAGAGAAGGGTCT, SEQ ID NO. 2 TGAAGCCTACTACCTGGAGGCT ；扩增Y染色体AZFa区域SY86序列的引物SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ;其碱基序列为SEQ ID NO. 3 CTCAGCACATGGGTGACACACAGA, SEQ ID NO. 4 CACAGACACACACAGAGGGACAA ；扩增Y染色体AZFb区域SY127序列的引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6 ;其碱基序列为SEQ ID NO. 5 ATAGAGGCTAGGCTCACAA, SEQ ID NO. 6 TAATCAAGCTGCAGGCAG ；扩增Y染色体AZFb区域SY134序列的引物SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8 ;其碱基序列为SEQ ID NO. 7 TACAAAACTGTCTGCCTCACC, SEQ ID NO. 8 CTGTTATAACAACCACTGCCAA ；扩增Y染色体AZFc区域SY254序列的引物SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10 ;其碱基序列为SEQ ID NO. 9 AGGCTGGGTGTTACCAGAAG, SEQ ID NO. 10 TCACTTCTTTCACTGAACCGT ；扩增Y染色体AZFc区域SY255序列的引物SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12 ;其碱基序列为SEQ ID NO. 11 TGAACGTGCTGAGTTAC, SEQ ID NO. 12 AGTTATGTGCTCGTCATG ；扩增SRY基因的引物SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14，其碱基序列为SEQ ID NO. 13 GTGCAAGAGAATATTCCCG, SEQ ID NO. 14 :CCTAGCTGGTGCTCCATTC。进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、10*PCR缓冲液、Mg2+、高效Tag酶。Mg2+反应终浓度优选为I. 25mM ；dNTP反应终浓度优选为2. 5mM。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤(i)采集待测血液样本，提取DNA ；(ii)以该DNA为模板，用权利要求I所述引物SEQ ID NO. I 12进行TD-PCR扩增，得到PCR反应产物；( iii )琼脂糖凝胶电泳分析结果。优选地，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增本发明公开了Y染色体微缺失检测试剂盒，所述试剂盒包括(i)PCR扩增反应试剂；(ii)扩增Y染色体AZFa区域SY84序列的引物；扩增Y染色体AZFa区域SY86序列的引物；扩增Y染色体AZFb区域SY127序列的引物；扩增Y染色体AZFb区域SY134序列的引物；扩增Y染色体AZFc区域SY254序列的引物；扩增Y染色体AZFc区域SY255序列的引物；扩增SRY基因的引物。它可以简便、高效、特异的检测Y染色体缺失。