Graves病基因无创检测试剂盒（TSHR等基因）的制作方法[0002]Graves病(GD)是一种伴有甲状腺激素增多的器官特异性自身免疫性疾病，它的发生具有一定的遗传因素。以促甲状腺素受体抗体(TRAb)阳性、高甲状腺素血症、Graves眼病、弥漫性甲状腺肿和胫前黏液性水肿为特征。Graves病的发生呈明显的家族聚集性，患者家族成员的患病风险为正常人群的15倍，而且同卵双生子的患病一致率显著高于异卵双生子。大量的流行病学研究为其遗传易感提供了确凿的证据。单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)指的是基因组序列上的单个碱基突变。作为第三代遗传学标记，SNP在疾病易感基因的研究中有着重要的意义。通过分子诊断检测与Graves病发生密切相关的基因位点就可以提前评估受检者患Graves病的风险，从而提早预防和治疗。[0003]细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原 4(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen4，CTLA-4)是一种免疫调节分子。近年的研究表明:CTLA-4基因多态性与多种自身免疫性疾病的发生风险相关。CTLA-4基因上外显子I第17密码子49位点A/G多态性造成CTLA-4信号肽中编码氨基酸的改变，从而影响蛋 白翻译后加工、修饰，使sCTLA-4功能发生变化。研究发现GD患者等位基因G/G和G基因频率在GD组均较对照组显著增加，提示CTLA-4G49可能是GD的易感因素，CTLA-4基因可能是GD的易感候选基因。[0004]促甲状腺素受体(TSHR)基因能够编码一种特异的蛋白质TSHR，表达在甲状腺滤泡细胞表面，调节甲状腺的增殖分化和甲状腺激素的合成。在Graves病中TSHR基因区域的遗传变异可能通过改变正常TSHR的结构、表达量以及翻译后过程，引起机体针对TSHR的自身免疫反应。今年来，大样本的研究已经明确了 TSHR基因和Graves病的发生密切相关，其中最值得关注的区域定位于TSHR基因内含子I上。对1000多例Graves病患者和1000多名健康对照者进行TSHR rsl79247基因分型，得到3种基因型:AA、AG、GG，其中病例组AA基因型频率和A等位基因明显高于对照组。提示TSHR rsl79247是Graves病的独立易感位点。[0005]FcRL3基因包含16个外显子，在淋巴细胞聚集区如成熟B细胞中高表达。近年来的国内外研究数据显示，FcRL3基因多态位点不但与GD相关，还与多发性硬化、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病相关。研究发现FcRL3基因启动子rs7528684位点存在A / G多态性，而且⑶病患组的GG基因型和G等位基因频率均明显高于正常对照组。提示FcRL3基因可能是GD等自身免疫性疾病的遗传标志之一。[0006]因此，建立简单、快速的Graves病易感基因无创检测方法,能够检测出Graves病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患Graves病的高危人群，有针对性的进行孕期检测和指导，对于降低人群得病率、保障大众的安全健康具有非常重要的意义。
[0007]基于CTLA-4 基因上 A49G(rs231775)、TSHR 基因上 rsl79247、FcRL3 基因上rs7528684的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估Graves病发病风险级别，本发明提供一种Graves病基因无创检测试剂盒。[0008]该试剂盒包括:
检测 CTLA-4 基因上 A49G(rs231775) ,TSHR 基因上 rsl79247、FcRL3 基因上 rs7528684的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul ；
本试剂盒供一人份检测使用，`试剂盒的保存温度为_20°C。

[0010]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0011]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0012]实施例1.检测试剂盒的使用。
[0013]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0014]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)CTLA-4 (A49G)正向引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA3’
CTLA-4 (A49G)反向引物:5’GAATACAGAGCCAGCCAAGC3’
(2)TSHR (rsl79247)正向引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
TSHR (rsl79247)反向引物:5’ ATACTGCCATCTCAAAGCC 3’
(3 ) FcRL3 (rs7528684)正向引物:5’ AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’
FcRL3 (rs7528684)反向引物:5’GGTGGAACCTCTTTGATTGC3’。
[0015]PCR扩增的反应体系为:10 X PCR反应缓冲液2.5ml ；25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0016]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0017]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0018]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0019]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)CTLA-4 (A49G)测序引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA 3’
(2)TSHR (rsl79247)测序引物:5’ TCTAAACTTCCCACATCAC 3’
(3)FcRL3 (rs7528684)测序引物:5’AATGTCTCCAAGACTGTGCC3’。
[0020]反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水 2ul。
[0021]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0022]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0023]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0024]实施例2.为人群进行Graves病基因无创检测的服务。
[0025]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0026]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CTLA-4基因上A49G (rs231775)、TSHR基因上rsl79247、FcRL3基因上rs7528684的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0027]3.Graves病高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具Graves病风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CTLA-4基因上A49G(rs231775)、TSHR基因上rs 179247、FcRL3基因上rs7528684的SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读Graves病基因无创检测报告单。