一种检测青光眼易感基因的试剂盒的制作方法[0002]青光眼是世界上第三位的致盲眼病，典型的临床表现是视神经萎缩、进行性视野缺损和眼压增高。尽管确切的发病机制尚不为人们所知，但根据原发性青光眼发病呈现家族性，青光眼亲属中的高发性及双生子的研究，均表明遗传因素在青光眼的发病中起着重要作用。随着分子遗传学和分子生物学在眼科领域内研究及应用的不断深入，青光眼的研究有了飞速的发展和长足的进步。[0003]青光眼具有遗传性，代表青光眼有一定的遗传病因。家族中有过青光眼病史的患者需要定期往医院检查，早期发现并及时的治疗为治愈青光眼的关键。[0004]青光眼是一种会影响光学神经，而且导致失明的疾病。研究职员检查了青光眼病人的271位兄弟姊妹并且发现，大约12%的人患有青光眼；那些最初筛检结果没有罹患青光眼又再被筛检的人中(159个人)，7%的人在之后6到8年的追踪研究期间发展了青光眼，而19%的人被怀疑患有青光眼。这些数据显示青光眼会在家庭中遗传，而且风险随着年龄增加而增加。[0005]青光眼具有遗传性，根据英国一项新近研究显示，假如你有兄弟姊妹患有青光眼，那么你眼睛发生损害的风险 可能是一般人预期风险的4倍。基于这些调查结果，有青光眼病人的兄弟姊妹最好每两年要做一次眼睛检查。[0006]目前，LOXLl和CAV1/CAV2基因已被科学家证实与青光眼疾病的发生相关。[0007]研究人员调查了多个国家逾4万人的健康数据，在代号7Q31的染色体上发现了这个遗传标记。它是一个单核苷酸的变体，是比基因更小的遗传单位，其位置在已知的两个与青光眼有关的基因CAVl和CAV2附近。[0008]分析显示，约6%的欧洲人携有一对该遗传标记，他们患青光眼的风险比其他欧洲人高出60%。与欧洲人相比，中国人携带这个遗传标记的比例非常低，基因组中存在这个标记的人还不到1%。不过，携带该遗传标记的中国人患青光眼的风险要大得多一一比其他中国人高出5倍以上。
[0009]LOXLl是科研人员通过对大规模的基因组进行分析，最终发现在人体第15号染色体上的LOXLl基因与青光眼密切相关。所有的剥脱性青光眼病例都可归因于这一基因的变异。研究小组总共选取了 1.6万名青光眼患者进行研究。统计分析显示，携带变异基因的人患剥脱性青光眼的风险大大高于正常人。
[0010]研究小组进一步分析发现，LOXLl基因编码的蛋白质与弹性纤维的形成有关，而弹性纤维如果在眼部异常积聚，就会诱发剥脱性青光眼。

[0011]基于LOXLl基因、CAV1/CAV2基因上的2个SNPs位点多态性可用来评估个体罹患青光眼风险性的基础上，本发明提供一种检测青光眼易感基因的试剂盒。
[0012]试剂盒包括:
检测LOXLl基因上rs3825942号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针
对；
检测CAV1/CAV2基因上rs4236601号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水
[0013]本试剂盒中 所述的特异性引物对是指针对LOXLl基因上rs3825942号SNP位点和CAV1/CAV2基因上rs4236601号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO:1和2、3和4所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物。
[0014]本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对LOXLl基因上rs3825942号SNP位点和CAV1/CAV2基因上rs4236601号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这两个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO:5和6、7和8所示序列的Taqman探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这两对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估个体罹患青光眼风险性的两个SNPs位点的探针均在本发明范围内。
[0015]本发明试剂盒的组分和含量包括:
5μ1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，
0.5μ1 25mM dNTP 混合液，
3μ1 25mM MgCl2 溶液，
0.125μ1 (5unitsM) Taq DNA 聚合酶，
20μΜ特异性引物对每条引物各0.225μ1，
ΙΟμΜ特异性荧光探针对每条探针各0.25μ1，
去尚子水26.625Μ-1 ο
[0016]本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
[0017]

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
[0018]
实施例1.检测试剂盒的使用 步骤1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人体外周血，提取血液中的基因组DNA。[0019]步骤2:荧光定量PCR反应
使用可检测青光眼易感基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，包含下列引物对和荧光探针对:
有义引物 1:5’ - TCCGTCTCCCAGCAA - 3’ (SEQ ID NO:1)
反义引物 1:5’ - CGAAGCCGAGACCGA - 3’ (SEQ ID NO:2)
有义引物 2:5’-TGACAGTCCTTTTCT - 3，(SEQ ID NO:3)
反义引物 2:5’- AATTATATTAACAAA - 3’ (SEQ ID NO:4)
带 VIC 荧光基团探针 1:5，- CACGGGGaCTCCGC -3，(SEQ ID NO:5)
带 FAM 荧光基团探针 1:5，- CACGGGGgCTCCGC -3，(SEQ ID NO:6)
带 VIC 荧光基团探针 2:5，-GTATTGTaTTTGTT-3，(SEQ ID NO:7)
带 FAM 荧光基团探针 2:5’ - GTATTGTgTTTGTT -3’ (SEQ ID NO:8)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针I特异地针对检测LOXLl基因上的rs3825942号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测CAV1/CAV2基因上的rs4236601号SNP位点多态性；
2个SNPs位点分别进行2次独立的荧光定量PCR反`应，每个反应的体系为总体积10μ1，包含浓度为20ng/^l的DNA模板2μ1、?μ1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.?μ? 25mMdNTP 混合液、0.6μ1 25mM MgCl2 溶液、0.025μ1 (5unitsM) Taq DNA 聚合酶、20μΜ 的有义引物和反义引物各0.225μ1、ΙΟμΜ的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μ1，去离子水
5.325Μ-1 ο
[0020]在ΑΒΙ9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取
样品突光量。
[0021]步骤3 =SNP基因型分析
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
[0022]
实施例2.对患者进行青光眼易感基因检测的服务 步骤1:DNA提取
由医院检验科医师对被检者进行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因组DNA。
[0023]步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检者基因组DNA的LOXLl基因上的rs3825942号SNP位点和CAV1/CAV2基因上的rs4236601号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这两个SNPs位点的基因型。
[0024]步骤3:罹患青光眼风险性的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具罹患青光眼风险性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者罹患青光眼的风险性的高低，并由医师向被检测者详细说明和解读罹患青光眼风险 性的分析报告单。