一种检测个体叶酸代谢障碍的试剂盒的制作方法[0002]叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必须的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。叶酸在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸也作为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)及其它微生物的促进增殖因子而起作用。[0003]叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人体缺少叶酸可导致红血球的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白血球减少。叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。如果在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可引起胎儿神经管发育缺陷，而导致畸形。因此，准备怀孕的女性，可在怀孕前就开始每天服用400微克叶酸。[0004]但目前已知育龄妇女服用叶酸增补剂时由于个人的遗传体质不同，存在叶酸代谢能力的差异，不同人群所需叶酸剂量不能一概而论。如服用剂量不足实际需求，达不到补充叶酸的效果；而盲目过量服用高浓度叶酸，会干扰孕妇的营养元素代谢，同样会影响胎儿发育，超量服用叶酸也会引起药品不良反应，反而会对孕妇和胎儿造成严重不良后果。所以不同遗传体质的育龄妇女必须根据自身对叶酸代谢情况，有的放矢地补充所需要的叶酸。[0005]因此，选取与育龄妇女孕`前/孕期以及胎儿发育所需的叶酸代谢密切相关且研究明确的一些重要基因位点，综合利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的检测个体叶酸代谢障碍的试剂盒，通过此检测报告还可以帮助医师针对不同体质的育龄妇女指导她们补充适量的叶酸，具有很强的社会意义和广阔的市场前景。[0006]目前，经证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢密切相关的基因有:5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)。[0007]MTHFR 为 5,10 — methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)(亚甲基四氢叶酸还原酶)蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接的为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。研究发现，MTHFR基因存在多种多态型，影响MTHFR活性和热稳定性。常见的变异包括:(1)677 C-T =MTHFR基因第677位密码子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，编码后酶分子中丙氨酸被缬氨酸替代，引起MTHFR热稳定性和活性降低，相对于正常的C/C基因型，纯合子T/T基因型MTHFR活性在37摄氏度降低50%~60%，在46摄氏度降低65% ；(2) 1298 A-C:编码后酶分子中谷氨酸被丙氨酸替代，引起MTHFR活性降低。1298 A-C与677 C-T不同的是，纯合子和杂合子血浆同型半胱氨酸升高和叶酸降低均不明显。然而，如果同时存在1298 A-C和677 C-T复合变异的杂合子，则MTHFR活性低于野生型40%。[0008]甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR能够保持甲基钴铵III在一定水平，而甲基钴铵III是激活蛋氨酸合成酶的辅助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR变异是造成叶酸/甲基维生素缺乏症E型的主要原因。MTRR 66A — G多态性，导致蛋氨酸被异亮氨酸替代，使该酶活性降低。该基因型对同型半胱氨酸水平有显著影响。有研究指出，MTRR基因A66G多态，血浆同型半胱氨酸增高，基因型为MTRR 66GG，MTRR 66AG的孕妇或胎儿发生神经管畸形的危险性较正常对照组增加。


[0009]基于5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)上的3个SNP位点多态性可用来评估叶酸代谢遗传能力的基础，本发明提供一种检测个体叶酸代谢障碍的试剂盒。
[0010]该试剂盒包括:
检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP多态性基因型的特异性引物对；` 检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP多态性基因型的特异性引物对；
检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP多态性基因型的特异性引物对；实时定量PCR反应组件(包括ddH20、Buffer、MgCl2溶液、dNTPs、Taq酶、SYBR染料等)本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号和rsl801131号SNP位点、甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点而设计，能使用SYBR Green荧光
PCR技术特异性检测出这三个SNP位点基因型的引物对。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的，并可用常规的引物合成技术进行合成。
[0011]优选的，检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP多态性基因型的特异性引物对为:
有义引物 1-1:GAGGAGCTGACCAGTGAGGA (SEQ ID NO:1)
有义引物 1-2:GAGGAGCTGACCAGTGAGGC (SEQ ID NO:2)
反义引物 1:CITTGTGACCAITCCGGITT (SEQ ID NO:3)
优选的，检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801131号SNP多态性基因型的特异性引物对为:
有义引物 2-1:AGCTGCGTGATGATGAAATAGA (SEQ ID N0:4)有义引物 2-2:AGCTGCGTGATGATGAAATAGG (SEQ ID NO:5)
反义引物 2:TATTGGCAGGTTACCCCAAA (SEQ ID NO:6)
优选的，检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP多态性基因型的特异性引物对为:
有义引物 3-1:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAT (SEQ ID NO:7)
有义引物 3-2:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAC (SEQ ID NO:8)
反义引物 3:TCACTGTTACATGCCTTGAAGTGA (SEQ ID NO:9)
本发明试剂盒的组分和含量包括:
溶液单份体积终浓度
ddH2030.2μ1
Buffer5M-1IX
MgCl24μ12mM
dNTPs4M-1200nM each
Primer (SP+AP) 1M-1+1M-1 0.4uM each
Taq0.3μ11.5U in all
SYBR Green 荧光染料 2.5μ11 X
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
[0012]
热循环参数:
94 °C2min
94 °C45sec
60 °C45sec
72。。lmin 72 °C7min40循环

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
[0013]
实施例1.检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人体外周血，提取血液中的基因组DNA。
[0014]步骤2:如果要做N管，在一个1.5ml或更大体积的管子中，一次加入从ddH20到SYBR每个试剂，体积为:NX单份体积。
[0015]在冰上操作，保持试剂的活性。
[0016]因为SYBR荧光染料的缘故，要避免中强光照射。
[0017]在移液准确的前提下，尽量缩短操作时间，减少非特异扩增。
[0018]充分振荡，使成分均匀。[0019]步骤3:在PCR管中加入模板DNA和步骤2已配置完成的混合溶液，振荡，离心。
[0020]步骤4:实时定量PCR反应
使用可检测与叶酸代谢相关的基因的实时定量PCR检测试剂盒，其中，包含下列引物
对:
有义引物 1-1:GAGGAGCTGACCAGTGAGGA (SEQ ID N0:1)
有义引物 1-2:GAGGAGCTGACCAGTGAGGC (SEQ ID NO:2)
反义引物 1:CTTTGTGACCATTCCGGTTT (SEQ ID NO:3)
有义引物 2-1:AGCTGCGTGATGATGAAATAGA (SEQ ID N0:4)
有义引物 2-2:AGCTGCGTGATGATGAAATAGG (SEQ ID NO:5)
反义引物 2:TATTGGCAGGTTACCCCAAA (SEQ ID NO:6)
有义引物 3-1:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAT (SEQ ID NO:7)
有义引物 3-2:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAC (SEQ ID NO:8)
反义引物 3:TCACTGTTACATGCCTTGAAGTGA (SEQ ID NO:9)
有义引物1-1、有义引物1-2、反义引物1特异地针对检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点多态性；`
有义引物2-1、有义引物2-2、反义引物2特异地针对检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点多态性；
有义引物3-1、有义引物3-2、反义引物3特异地针对检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rsl801394号SNP位点多态性；
将反应管放入仪器上进行热学反应，反应过程941:、21^11，941:、4586(3，601:、4586(3，72°C、45sec，40 循环。
[0021]62 V~92 V缓慢升温，产生熔点曲线(melting curve,或称解离曲线，dissociation curve)。
[0022]步骤5:SNP基因型分析
熟悉实时定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识实时定量PCR仪上显示的荧光定量曲线，根据不同序列引物和SYBR荧光染料结合的信号强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
[0023]
实施例2.对育龄妇女进行叶酸代谢障碍检测的服务步骤1:DNA提取
由医院检验科医师对被检者进行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因组DNA。
[0024]步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检者基因组DNA的0RMDL3基因上的rs7216389号SNP位点和C5基因上的rs25681号SNP位点分别进行实时定量PCR检测，确定这两个SNPs位点的基因型。
[0025]步骤3:个体叶酸代谢能力的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具个体叶酸代谢能力的分析报告单。报告中详细说明了被检测者的叶酸代谢能力，并由医师向被检测者详细说明和解读个体叶酸代谢能力的分析报 告单。