肥胖易感性无创检测试剂盒（lepr等基因）的制作方法 [0002]肥胖病是指机体脂肪总含量过多和(或)局部体脂含量过多，是由遗传和环境因素共同作用所致的慢性代谢性疾病。随着生活水平的不断提高，生活方式的改变，我国居民超重和肥胖率呈明显上升的趋势。儿童单纯性肥胖的发病率逐年增加，已被国际儿科界列为21世纪儿童健康的重要课题之一。肥胖可依据脂肪堆积部位分为两类:一类以总体脂增加，脂肪积聚于臀部、大腿等处为特点，称为皮下脂肪型肥胖，亦即全身性肥胖；另一类以脂肪主要积聚于腹部，尤其是腹腔内为特点，称为内脏型肥胖，亦即中心型肥胖。超重和肥胖与高血压、2型糖尿病等慢性非传染性疾病密切相关，其中，中心型肥胖与心血管疾病及胰岛素抵抗综合症的发生具有更高的相关性。[0003]肥胖的病因相当复杂，遗传因素在肥胖的发生机制中占据重要地位。涉及到能量消耗或能量摄取的基因与肥胖的发生有关。人类的肥胖病患者大多表现为高瘦素水平，存在瘦素抵抗状态，因此瘦素受体(Leptin receptor, LEPR)作为瘦素调节机体摄食及能量代谢的信号传递中介受到高度重视。而研究瘦素受体多态性与能量代谢各指标的关系对于揭示肥胖及其相关疾病的共同遗传背景有着很重要的意义。由于LEPR基因外显子第668个核苷酸A —G替换，谷氨酸被精氨酸替换(Gln223Arg)。该位点的带电性由中性转向正电荷，能够影响LEPR的功能并改变其信号传递能力。推测Gln223Arg基因多态性也可能对LEPR信号传导通路产生了影响，从而参与了瘦素抵抗性肥胖的发病机制。[0004]解偶联蛋白(UCP)是线粒体内膜转运载体，UCP的基因多态性可影响mRNA的转录及蛋白质的表达，进而影响基础代谢率，从而改变人的肥胖易感性。解偶联蛋白2 (uncoupling proteins 2, UCP2)基因定位于llql3染色体,是UCP家族成员之一。大量研究表明，UCP2基因是肥胖相关基因之一。邹恒昀等的研究发现男性中-866G/A多态性与肥胖有关，男性中GG基因型个体相对AA基因型具有更高的肥胖率，这与Harald等对698个奥地利人的研究结果一致，相对G等位基因，A等位基因的携带者具有较低的肥胖率。一系列研究还表明UCP2基因多态性与冠心病、2型糖尿病等疾病也有相关性。[0005]G蛋白β3亚单位上的GNB3基因存在着多态C825T位点。GNB3基因825位上的多态性是指GNB3基因中第10个外显子的825位发生了胞嘧啶核苷酸(C)和胸腺核苷酸(T)的改变。国内外学者对大量人群的C825T等位基因分析研究表明，该位点的多态性与肥胖存在相关性。还发现GNB3基因825位点多态性与孕妇产后正常体重恢复有关。GNB3基因型与机体脂肪含量有关，基因型825Τ/Τ脂肪含量显著高于基因型825T/C和825C/C。[0006]因此，建立简单、快速的肥胖易感基因检测方法，及时筛查出易患肥胖症的高危人群，有针对性的进行健康指导和预防，对于保障人类安全健康具有非常重要的意义。
[0007]基于GNB3 基因上 C825T、LEPR 基因上 Gln223Arg、UCP2 基因上-866G/A 的 3 个SNPs位点基因型可用来评估肥胖症发病风险级别，本发明提供一种肥胖症基因检测试剂盒。[0008]该试剂盒包括: 检测 GNB3 基因上 C825T、LEPR 基因上 Gln223Arg、UCP2 基因上-866G/A 的 3 个 SNPs位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物。
[0009]PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)。
[0010]PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0011]DNA测序反应组件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0012]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0013]PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0014]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0015]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。

[0016]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0017]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0018]实施例1.检测试剂盒的使用。
[0019]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0020]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)GNB3 (C825T)正向引物:5’- TTCCTGCCGCTTGTTTGA-3’
GNB3 (C825T)反向引物:5’ - AAATGCCAGGAACCCAGAA-3’
(2)LEPR (Gln223Arg)正向引物:5’ - AAACTCAACGACACTCTCCTT-3’
LEPR (Gln223Arg)反向引物:5’ - ACTGACATTAGAGGTGAC-3’
(3)UCP2 (-866G/A)正向引物:5’- CACGCTGCTTCTGCCAGGAC-3，
UCP2 (-866G/A)反向引物:5’ - AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。[0021 ] PCR扩增的反应体系为:10 X PCR反应缓冲液2.5ml ；25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0022]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0023]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0024]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0025]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)GNB3 (C825T)测序引物:5’- TTCCTGCCGCTTGTTTGA-3’
(2)LEPR (Gln223Arg)测序引物:5，- AAACTCAACGACACTCTCCTT -3，
(3)UCP2 (-866G/A)测序引物:5，- CACGCTGCTTCTGCCAGGAC -3，。
[0026]反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0027]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0028]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0029]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0030]实施例2.为人群进行肥胖症基因检测的服务。
[0031]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0032]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3个SNPs位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0033]3.肥胖症基因高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具肥胖症风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者GNB3基因上C825T、LEPR基因上Gln223Arg、UCP2基因上-866G/A的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读肥胖症基因检测报告单。