2型糖尿病易感性无创检测试剂盒（vdr等基因）的制作方法[0002]2型糖尿病亦称为非胰岛素依赖型糖尿病，患者的主要特征为胰岛素抵抗、胰岛素相对缺乏以及高血糖。2型糖尿病主要在40岁以上的成年人中发病，占所有糖尿病患者的90%以上。2012年世界卫生组织最新数据显示我国已经成为世界第一糖尿病大国，患病率为9.7%，远高于世界平均水平。由于病因复杂加上早期症状轻微且并无酮症酸中毒和昏迷等现象，2型糖尿病一般多在病情发展多年后才被诊断发现。因此目前急需一种有效的早期检测手段。已经有研究表明遗传因素在2型糖尿病的发病过程中起着重要的作用，肿瘤坏死因子α (TNF-α)、脂联素(AdipoQ)和维生素D受体(VDR)等基因的多态性均与2型糖尿病的易感性有直接关联，在预防和治疗2型糖尿病中具有一定的预测价值。[0003]炎症反应被认为是胰岛素抵抗的触发因素，因此TNF-α作为重要的炎症细胞因子在2型糖尿病研究中备受关注。TNF-α具有抑制外周组织葡萄糖摄取、抑制胰岛素受体及其底物磷化的作用，其过量表达可引起胰岛素抵抗。TNF-α中位于基因启动子区域的第308位G/A多态性被发 现与2型糖尿病有显著相关性。国内诸多研究表明在2型糖尿病患者中308GA+AA基因型频率和308A等位基因频率有显著增加。Meta分析结果也显示亚洲人群中TNF- α的308Α等位基因是2型糖尿病的危险因素，会显著增加2型糖尿病的发病率。目前普遍认为的作用机制是由于TNF- α第308位G — A突变会导致其转录水平显著上升，从而诱导胰岛素抵抗及血脂代谢紊乱。[0004]AdipoQ是由脂肪组织特异性分泌的一种血浆激素蛋白，具有降血糖、降血脂以及提高胰岛素敏感性的作用。由于其血清水平与胰岛素敏感指数呈正相关，AdipoQ多态性在2型糖尿病发病机制研究中一直颇受重视。目前已发现由于GGI — GGS的同义突变，在AdipoQ外显子2中存在Glyl5Gly多态性。有研究表明，在2型糖尿病患者中AdipoQ外显子2 Glyl5Gly位点处的G等位基因频率与GG基因型频率要显著高于对照人群，因此认为AdipoQ是2型糖尿病的易感基因。由于T — G同义突变并未改变AdipoQ的氨基酸序列，故该突变被认为是由于密码子使用频率的差异而影响了 AdipoQ的翻译效率。[0005]由于维生素D对胰岛细胞具有保护作用并能维持胰岛素正常分泌和糖耐受，VDR的基因多态性也与2型糖尿病的发生有密切关联。已经有研究表明VDR基因FokI位点的存在(f等位基因)会增加2型糖尿病的发病率。在2型糖尿病患者中f等位基因频率和ff基因型频率有显著上升且ff基因型的2型糖尿病患者在口服葡萄糖耐量后分泌的胰岛素会明显减少。因此VDR基因的f等位基因是2型糖尿病发病的危险因子。其普遍认为的作用机制是FokI位点的存在使VDR有2个翻译起始位点(ATG)并允许翻译合成活性较低的VDR蛋白，从而降低了 VDR蛋白总体的有效活性。[0006]综上所述，鉴于TNF-α基因、AdipoQ基因和VDR基因在2型糖尿病疾病中体现出来的疾病显著相关性，可以通过检测这些2型糖尿病发生相关基因位点的基因型来及时筛查出易患2型糖尿病的高危人群，从而有针对性地预防和治疗2型糖尿病，这对于降低2型糖尿病的发病率有非常重要的意义。
[0007]基于检测TNF-α 基因上 G-308A (rsl800629)、ADIPOQ 基因上的 Glyl5Gly(rs2241766)、VDR基因上Fok I (rsl0735810)的3个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估2型糖尿病发病的危险因子的基础上，本发明提供一种检测2型糖尿病遗传易感性的试剂盒。[0008]该试剂盒包括:
检测 TNF-α 基因上 G-308A (rsl800629)、ADIPOQ 基因上的 Glyl5Gly (rs2241766)、VDR基因上Fok I (rsl0735810)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件 (包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0010]本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。

[0011]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0012]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0013]
实施例1.检测试剂盒的使用。
[0014]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0015]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:(1)TNF- a (G-308A)正向引物:5’ GGAAGCCAAGACTGAAACCA 3’
TNF- a (G-308A)反向引物:5’ TCATCTGGAGGAAGCGGTAG3’
(2)ADIPOQ (Glyl5Gly)正向引物:5’ TCAAGGTGGGCTGCAATAT3’
ADIPOQ (Glyl5Gly)反向引物:5’AGGCACCATCTACACTCATCC3’
(3)VDR (Fok I)正向引物:5’CCAGCTATGTAGGGCGAATC3’
VDR (Fok I)反向引物:5’CAGCCTTCACAGGTCATAGCA3’。
[0016]PCR扩增的反应体系为:10 X PCR反应缓冲液2.5ml ；25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0017]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0018]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul ，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0019]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0020]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)TNF- a (G-308A)测序引物:5’ GGAAGCCAAGACTGAAACCA 3’
(2)ADIPOQ (Glyl5Gly)测序引物:5’TCAAGGTGGGCTGCAATAT3’
(3)VDR (Fok I)测序引物:5’CCAGCTATGTAGGGCGAATC3’。
[0021]反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0022]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0023]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0024]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0025]实施例2.对人们进行预防2型糖尿病发病的基因无创检测的服务。
[0026]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0027]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的TNF- α基因上G_308A( rs 1800629 )、ADIPOQ 基因上的 Glyl5Gly (rs2241766)、VDR 基因上 Fok I (rsl0735810)的 3 个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。[0028]3.2型糖尿病发病高危人群风险评估
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具2型糖尿病易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者TNF-α基因上G-308A (rsl800629)、ADIPOQ基因上的Glyl5Gly(rs2241766)、VDR基因上Fok I (rsl0735810)的3个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读2型糖尿病 易感基因无创检测报告单。