专利名称：斑点叉尾鮰病毒现场快速检测试剂盒及检测方法斑点叉尾鮰病毒是ー种有囊膜的双链DNA病毒，含囊膜的完整病毒粒子直径为175nm 200nm ;其核衣壳为二十面体，直径90nm 105nm。该病毒又称鲴鱼疱疫病毒I型(Ictaluridherpes virus I),国际病毒分类委员会(ICTV)第八次报告的最新病毒分类系统将其归类为疱疫病毒科(Herpes virus)、鲴鱼疱疫病毒属(Ictaluri virus)。研究发现，该病毒主要感染斑点叉尾鲴和鲴鱼两种经济鱼类，患病鱼发病时表现出水肿、眼突出、鳍条和肌肉出血等症状，组织病理学变化为肾管和肾间组织广泛坏死。该病毒引起的斑点叉尾 鲴病毒病(Channel Catfish Virus disease, CCVD)是一种严重的、急性致死性传染病，最先报道于美国，目前主要在北美地区流行，其传播速度快、死亡率高，一旦发病就会给斑点叉尾鲴养殖带来严重的经济损失。斑点叉尾鲴在国内的养殖始于上世纪80年代，因养殖效益高，目前已成为我国重要的水产养殖经济鱼类之ー；随着养殖规模的扩大以和养殖密度的増加，养殖期间大规模爆发斑点叉尾鮰病毒病的风险也大大增加了。所以研究并建立CCV的快速检测预警技木，加强斑点叉尾鮰苗种和成鱼类检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，有效切断病毒传播，保障我国斑点叉尾鮰养殖业的健康持续发展就显得尤为迫切和重要。目前，CCV检测还主要依赖于病毒分离培养、病理切片法、电镜观察法、抗体杂交和PCR检测法。病毒分离培养法需要专门的培养条件及细胞系并且耗时较长，不适于进行预警监测；病理切片法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；用抗体杂交检测法检测CCV虽然在速度上优于病理切片法，但其灵敏度较低，在CCV尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；ccv的PCR检测法，虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能实现对CCV的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，使得PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了 PCR检测方法在生产中的推广应用。进行斑点叉尾鮰病毒早期检测并采取预防措施是水产养殖中降低斑点叉尾鮰病毒流行风险、減少发病照成巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的斑点叉尾鮰病毒检测试剂盒就尤为必要。
本发明的目的是提供ー种斑点叉尾鮰病毒现场快速检测试剂盒及检测方法，即适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的斑点叉尾鮰病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有技术的不足，使CCV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。本发明一个方面是提供用于检测斑点叉尾鮰病毒的引物组，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO :1-4 ;具体信息如下上游引物I SEQ ID NO 1 5’-AGGGAGGTCACCACGAGCATTTTGTCGCGGACAGGGTCATG-3’下游引物I SEQ ID NO 2 5’-TCGCCCTCTGGGTGATCGTTTTTGGGATCTCTCGTGGGGAATG-3’上游引物2 SEQ ID NO 3 :5’ -GAGATCGCCATCGGTTCG-3’·下游引物2 SEQ ID NO :4 :5’ -ACCGGGGCTCCAGTCT-3，。本发明的另一个方面提供一种用于检测斑点叉尾鮰病毒的试剂盒，包括如下的组分(I)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物I和下游引物I各I 2μ M，扩增引物的上游引物2和下游引物2各O. I 0.4μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 O. 8 2. 0mM,MgCl24 IOmM, Betaine (甜菜碱)0. 6 1.2M, Tris-HCllO 40mM，KC110 20mM，MgSO4I 4mM，(NH4) 2S046 12mM，Triton X-100O.05% I. 0%, Bst DNA 聚合酶 2 25U ;(5)阴性对照管，内装无斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。染料可以选钙黄绿素与金属离子形成的配合物，也可以选分子生物学中应用的核酸染料。选用钙黄绿素时，需将O. 5 50mM金属离子与f 80 μ M钙黄绿素形成的配合物预混于扩增反应液中。核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，为SYBR Green、GelRed,GelGreen、Go IdView 或 GeneFinder 中的任一种。上述的FTA膜片是由英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小于I平方毫米的纸片。本发明的试剂盒用于非疾病和治疗目的的斑点叉尾鮰病毒的检测，例如对饲料和养殖水体的检测。用本发明上述检测试剂盒检测CCV的方法，按下列步骤进行(I)取样品组织约O. 02 I. Og置于采样管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置I 20min ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗:T5min以洗涤FTA膜片；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55 65° C条件下保温40 70min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动l_3min ；(7)用力向下甩动扩增检测管，使管内混有染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的CCV检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的CCV检测结果为阴性。在上述步骤中，从第(4)步开始应将作为阴性对照的无斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、作为阳性对照的吸附了斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片，以及吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测。本发明的试剂盒中汇集CCV现场快速检测所需的FTA膜片、TE缓冲液、扩增反应液、染料等试剂和研磨棒、牙签、吸管等器材，使得CCV的检测能够快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明依据优选的CCV基因组中0RF8保守区序列所设计的扩增引物能有效检测CCV的所有毒株，而与其他病毒的衣壳蛋白 又无同源性，检测特异性非常好；采用醇类物质对取样后的FTA膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置染料的方法，在反应结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用的可靠性。采用本发明的方法和试剂盒只需广I. 5小时就可完成CCV的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如离心机、PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别；与0^已有检测技术相比，本发明的检测方法成本非常低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，可以替代斑点叉尾鮰病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和PCR检测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在野外的生产现场使用，对加强CCV的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。说明书附I :使用本发明试剂盒检测斑点叉尾鮰病毒的特异性的电泳图，其中，M:DL2000Marker，泳道1-6 分别为阳性对照膜片，SVCV，GCRV，IHNV, TRIBV,阴性对照膜片；图2 .使用本发明试剂盒检测人工感染和健康的斑点叉尾鮰样本的电泳图， 其中，M DL2000Marker,泳道1_5分别为阳性对照膜片，样本I，样本2，样本3，阴性对照膜片。

I.2M, Tris-HC120mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-100 0. 1%, Bst DNA 聚合酶8U ;染料为25 μ M钙黄绿素和8mM氯化锰形成的配合物；引物信息如下上游引物I (SEQ ID NO 1) 5’-AGGGAGGTCACCACGAGCATTTTGTCGCGGACAGGGTCATG-3，下游引物I (SEQ ID NO 2)5’-TCGCCCTCTGGGTGATCGTTTTTGGGATCTCTCGTGGGGAATG-3’上游引物2 (SEQ ID NO 3)5’-GAGATCGCCATCGGTTCG-3’下游引物2 (SEQ ID NO 4)5，-ACCGGGGCTCCAGTCT-3，。(5)阴性对照管，I个，内装无斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，I个，内装吸附了斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，I管，内装500 μ L无水乙醇；
(8) FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(I个)分别封装于无菌袋中；(9)包装盒(I个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4X6个；(10)使用说明书，I份。实施例2 :本发明的检测试剂盒也可由以下部件组成(可检测4个样品的包装)(I)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，6个，每个管内装有Iml的蒸馏水；(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μ L的TE缓冲液(含IOmMTris-HCl和ImM EDTA, ρΗ8. O)；(4)扩增检测管,6个,每个管内装有25 μ L扩增反应液和IyL的核酸染料,扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物I和下游引物I各I. 6 μ Μ，扩增引物的上游引物 2 和下游引物 2 各 O. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, MgCl28mM, Betaine (甜菜碱)I. 2M, Tris-HC120mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-100 0. 1%, Bst DNA聚合酶8U ;核酸染料I μ L,成分为稀释10倍的GeneFinder ,且核酸染料已粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。(5)阴性对照管，I个，内装无斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，I个，内装吸附了斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，I管，内装500 μ L异丙醇；(8) FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(I个)分别封装于无菌袋中；(9)包装盒(I个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4X6个；(10)使用说明书，I份。实施例3 :使用本发明的检测试剂盒检测不同鱼类病毒验证检测试剂盒的特异性(I)分别取鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)感染样品、草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)感染样本、传染性造血组织坏死病病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, I HNV)感染样本、大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus, TRIBV)感染样本肾组织各约0. Ig置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置IOmin ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min ；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，55飞5°C保温60min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动2min ；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液。在上述步骤中从第4步开始，将无斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、吸附了斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。结果表明，阳性FTA膜片的检测管出现了绿色，提示有CCV存在；阴性对照的检测管显示橙黄色，提示无CCV存在；SVCV、GCRV、IHNV和TRBIV感染样本对应的检测管均呈现橙黄色，提示无CCV存在，这表明本发明的引物和试剂盒对CCV是特异的，检测过程中不会产生假阳性。为了验证上述结果，从各检测管内分别取扩增产物2 μ L进行2%琼脂糖电泳，电泳结果如图I所示，从图中可以看出，阳性对照对应的泳道有LADDER样电泳条带出现，而其他四种鱼类病毒感染样本、阴性对照对应泳道均无核酸条带出现；将阳性对照对应泳道中的分子量约170bp的电泳条带切胶回收进行测序，经序列比对发现该条带序列与CCV上游引物I和下游引物I间序列一致；所以电泳结果及测序结果均证实本发明的引物和试剂盒可以特异性的扩增CCV核酸，而不会与其他鱼类病毒交叉产生假阳性。实施例4 :使用本发明的检测试剂盒检测斑点叉尾鮰病毒的方法(I)取人工感染的斑点叉尾鮰样本I个(样本I)、健康的斑点叉尾鮰样本2个(样本2和样本3)，分别取其肾组织约O. Ig置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状； (2)用研磨棒蘸取浆状的样品将对应编号的FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置IOmin ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到对应编号的漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min ；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到对应编号的扩增检测管内，55 65° C 保温 60min;(6)将扩增检测管上下反复甩动2min ；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液。在上述步骤中从第4步开始，将无斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、吸附了斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。结果表明，用作阳性对照的检测管出现了绿色，而用作阴性对照的检测管中是橙黄色，这表明阳性对照和阴性对照工作正常；病毒感染的样本I对应的检测管呈现绿色，提示有CCV存在，样本2和样本3对应的检测管呈现橙黄色，提示无CCV存在，与预期结果一致。为了验证上述结果，从各检测管内分别取产物2 μ L进行2%琼脂糖电泳，电泳结果如图2所示，从图中可以看出，阳性对照、样本I对应的泳道有LADDER样电泳条带出现，样本2和样本3及阴性对照检测管对应泳道均无核酸条带出现，该结果亦与预期一致。本实施例结果证实本发明的引物和试剂盒可以特异性扩增CCV感染鱼体内的CCV核酸而不产生假阴性，同时也不会与鱼体内基因组核酸交叉产生假阳性。实施例5 :使用本发明试剂盒检测饵料、水体中病毒存在情况使用实施例I或实施例2中的检测试剂盒，按下列步骤进行(I)取斑点叉尾鮰鲜活饵料(样本I和样本2)约O. lg、养殖水体中100目筛絹过滤物约O. 2克(样本3和样本4)、人工感染CCV斑点叉尾鮰养殖水100目过滤物约O. I克(样本5)置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置IOmin ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min ；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，55飞5°C保温60min ；
(6)将扩增检测管上下反复甩动2min ；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的CCV检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的CCV检测结果为阴性。在上述步骤中从第4步开始，应将无斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片、吸附了斑点叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。结果表明，用作阳性对照的检测管出现了绿色，而用作阴性对照的检测管中是橙黄色,这表明阳性对照和阴性对照工作正常；样本I、样本2、样本3和样本4对应的检测管呈现橙黄色，这说明样本1、2、3和4均未有CCV的污染；样本5对应的检测管呈绿色，表明样本5有CCV污染存在。 实施例6 :利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备斑点叉尾鮰病毒核酸为了验证本发明中快速核酸制备方法制备核酸的效果，分别利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法分别从感染CCV的斑点叉尾鮰中制备病毒核酸。首先利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备病毒核酸(I)取约10-20毫克的斑点叉尾鮰肾组织放入I. 5mL离心管中，加入100 μ L份PBS缓冲液，用研磨棒将组织研磨成浆状；(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加25 μ L ；(3)将加好样品的FTA卡室温放置干燥至少一个小时；(4)用一个钻取工具从所上述干燥后的FTA卡上取下直径约2. Omm的圆片，放进
I.5mL离心管中；(5)在上述离心管中加入200 μ LFTA纯化试剂(Whatman，产品编号WG120204)，静置5分钟；(6)用吸液管将离心管内的FTA纯化试剂全部吸出；(7)重复步骤(5)——(6)两次；(8)在上述离心管中加入 200 μ L TE 缓冲液(IOmMTris-HCl，O. ImM EDTA,pH8. O),
静置5分钟；(9)用吸液管将离心管内的TE缓冲液全部吸出；(10)重复步骤(8) - (9)两次；(11)将上述离心管内的圆片在室温下干燥大约一个小时，圆片即可用于核酸的扩增了。利用本发明中快速核酸制备方法按下面的步骤制备斑点叉尾鮰病毒核酸(I)取约10-20毫克的斑点叉尾鮰脾肾脏组织放入I. 5mL离心管中，用研磨棒将其研磨成浆状；(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到3个FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加5 μ L ；(3)将3个FTA卡上分别滴加100 μ L甲醇、无水乙醇和异丙醇，室温放置3飞分钟；(4)用一个钻取工具从所上述3个FTA卡上分别取下直径约2. Omm的圆片放进
I.5mL离心管中；(5)在上述离心管中加入800 μ L灭菌水，剧烈震荡广3分钟；(6)取出离心管内的圆片即可用于核酸的扩增了。从上述过程中可以看出，采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法大约需要2个多小时才能完成核酸制备，而采样本发明的快速核酸制备方法大约只需要5 10分钟就可以完成核酸制备；所以与Whatman-FTA卡标准核酸制备方法相比，本发明的快速核酸制备方法具有操作简单、快速的优点。实施例7Whatman_FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备核酸的效果对比用实施例5中Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备的斑点叉尾鮰病毒核酸分别作为模板，进行等温扩增反应，每个扩增反应中含25 μ L扩增反应液，扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物I和下游引物I各I. 5 μ Μ，扩增引物的上游引物2和下游引物2各O. 3 μ M，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各I. 5mM, MgCl27mM,Betaine (甜菜碱)I. 3M, Tris-HC120mM, KCllOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-100
0.1%, Bst DNA聚合酶8U;等温扩增反应条件为63°C保温60分钟，然后90° C保持5分钟；最后将每个反应管中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果发现，利用本发明快速核酸制备方法(制备核酸过程中采用了甲醇、无水乙醇和异丙醇等挥发性醇类作为快速干燥液)制备的核酸均可以有效用作等温扩增反应的模板，并且扩增效果略好于采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸的扩增效果。综上所述，本发明检测试剂盒及其检测方法不仅可以应用于斑点叉尾鮰样品中CCV的检测，还可应用于斑点叉尾鮰饵料中CCV的检测；本发明快速核酸制备方法制备斑点叉尾鮰病毒核酸的质量不逊于Whatman-FTA卡标准核酸制备方法核酸的质量，还兼具有快速、简便、低成本的特点。本发明中所述的FTA膜片是英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片JfFTA卡片裁切成尺度为长X宽不小于I毫米Xl毫米的纸片或打孔成直径不小于I毫米的纸片即可制成FTA膜片。本发明的试剂盒所使用的试剂和材料引物由上海生物工程有限责任公司合成；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜碱(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、KCUMgSO4, (NH4)2SO4, MgCl2, Triton X-100购自上海生物工程有限责任公司；无水乙 醇、甲醇、异丙醇、钙黄绿素、氯化锰等购自国药集团化学试剂北京有限公司；等温扩增用的BstDNA聚合酶、反转录酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinder 购自厦门百维信生物科技有限公司。


本发明涉及一种斑点叉尾鮰病毒(CCV)现场快速检测试剂盒及检测方法，试剂盒中包含有序列为SEQ ID NO1-4的引物。本发明的试剂盒使得CCV的检测能够快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；优选的CCV基因组中ORF8保守区序列所设计的扩增引物能有效检测CCV的毒株，而与其他病毒核酸序列又无同源性，检测特异性非常好；采用醇类物质对取样后的FTA膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置染料的方法，在反应结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用的可靠性。