用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法

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专利名称

用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法
发明者

叶芬, 吴胜昔, 李应国, 温海霞, 胡仁建, 蔡家利, 项锦欣
公开日

2011年11月9日
申请日期

2011年3月11日
优先权日

2011年3月11日
申请人

重庆理工大学
文档编号

C12Q1/68GK102234693SQ20111005947
关键字

病毒猪瘟圆环检测用于
权利要求

1. 一种用于检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的基因芯片，其特征在于采用如下表所示的探针序列2.如权利要求1所述基因芯片，其制备方法包括如下步骤根据 GenBank 中已发表的 PCV-2、PRRSVE, PRRSVA, CSFV 的序列，应用 DNAMar 的MEGALIGN程序找出各个病毒的保守区；寡核苷酸潜在的二聚体和特异性用NCBI 即美国生物技术信息中心网站，http //www. ncbi. nlm. nih. gov的BLAST程序结合 PrimerPremier5. 0、01igo6. 0进行鉴定；根据探针、引物设计的相关原则及利用上述软件设计扩增目的片段的引物序列和探针序列，其序列和特性见下表1、表2 ；合成时在每个探针的5’加上1个氨基和15个T ；正链引物用CY-3荧光标记；引物用双蒸水稀释为 100 μ mol/L, -20°c保存备用；在氨基化片基上点制的60-mer寡核苷酸探针，质量等级为PAGE级；寡核苷酸探针用无菌水溶解后，再与2X上样缓冲液，按1 1混合，使点样终浓度调整为25 μ mol/L，通过晶 S PerSOnalArrayerTM-16个人点样仪将探针片段有序地点制成6行X 5列的阵列，每条探针横向重复点3个点；点制好的基因芯片通过37°C水浴放置18h以上后经洗涤、封闭、干燥后置干燥器中室温保存；所述上样缓冲液为pH 7. 4含0. 5% SDS的200 μ mol/L PBS ；表1基因芯片引物序列3.采用权利要求1或2所述基因芯片检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括如下步骤(1)标准病毒基因的扩增按照分子生物学实验技术提取标准猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的DNA或RNA，对RNA进行反转录后进行多重PCR体系的构建及优化，对优化好的体系进行带标记引物的PCR扩增，体系如下PCR体系I 包括PCV-2、PRRSVA、CSFV的三种模板DNA或者cDNA各1 μ L ； 10XPCRBuffer2. 5 μ L ；浓度 25mmol/L 的 MgCl22 μ L ；浓度为 10mmol/L 四种 dNTPsO. 8 μ L ； Taq DNA聚合酶0. 4 μ L ;5端代CY-3标记的10 μ mol/L四种引物各1 μ L，加入无菌水至 25 μ L体系；PCR 体系 II 包括 PRRSVA、PRRSVE 的 cDNA 各 1 μ L ;10XPCR Buffer2. 5 μ L ；浓度 25mmol/L 的 MgCl22 μ L ；浓度为 10mmol/L 四种 dNTPsO. 8 μ L ；Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L ;5 端代CY-3标记的10 μ mol/L两种引物各1 μ L，加入无菌水至25 μ L体系；PCR反应程序用PCR仪在94°C温度环境下变性6min ；循环步骤为94°C变性30s， 54°C /581退火308，721延伸lmin，进行；35个循环；最后72°C延伸lOmin，PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳；(2)基因芯片杂交配制15 μ L的杂交体系5 μ L的带标记的PCR产物和10 μ L芯片杂交液，芯片杂交液含25%甲酰胺、10XSSC、0. 2% SDS，将两者混合均勻后放入PCR仪进行高温变性；变性条件为95°C变性5min后，立即置于冰浴上快速冷却3min ；将15 μ L杂交体系小心地加入到如权利要求2所述基因芯片的小孔里，组装上杂交盒，放入40 42°C的水浴锅进行杂交2 4h ；(3)对杂交好的芯片清洗及扫描结果分析对杂交好的芯片要进行洗片；将洗好的芯片置于50ml离心管中在台式冷冻离心机离心aiiin以甩干，再利用晶芯 LUX&an10K-A微阵列芯片共聚焦激光扫描仪进行扫描并对结果进行分析；(4)对被检病毒基因的检测用设计的引物对被检病毒基因进行扩增、基因芯片杂交和对杂交好的芯片清洗及扫描结果分析，即将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交，扫描、分析芯片上荧光信号；其具体操作方法同步骤(1)、(2)和(3)；并与标准病毒基因扫描结果进行比对，获得检测结果
技术领域

本发明涉及生物基因技术和计算机数据分析领域，尤其涉及一种用于检测猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)、猪圆环病毒 2 型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型与美洲型(Porcine Reproductive md RespiratorySyndrome Virus Europe type and America type, PRRSE, PRRSVA)基因芯片及芯片的制备方法，以及采用该基因芯片进行检测或诊断病毒的方法
背景技术

专利详情
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权力要求
说明书
法律状态

专利名称：用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法随着规模化猪场的增加，猪疫病的种类也在增加，旧的疫病没有消灭，新的疫病不断出现，并且随着病毒株的变异使猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势。猪瘟 (ClassicalSwine Fever, CSF)、猪圆环病毒病 2 型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2) 和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是目前威胁我国猪的主要传染性疾病。对于危害全球养猪业发展的猪主要疫病，快速准确诊断是控制该病重要前提。常规的病毒分离诊断方法虽然准确，但费时费力，并且需要专门的技术人员进行操作。基于分子生物学的诊断方法要以RT-PCR和荧光PCR为主。RT-PCR比荧光RT-PCR方法灵敏度低、耗时长；荧光RT-PCR方法具有高灵敏度的特点，但检测成本高，并且不能同时检测几种疾病。近年来，猪癌病毒(ClassicalSwine Fever Virus，CSFV)、猪圆环病毒 2 型 (PorcineCircovirus Virus type 2，PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus,PRRSV)已成为危害世界规模化养猪业的重要猪病症候群。这些病原均可导致猪的繁殖障碍，且常成混合感染，不易区分，给临床鉴别诊断造成较大困难。在这种情况下，如何快速、灵敏、准确地对多种疫病同时做出诊断以及早制定和采取相应防制措施是现代动物疫病检疫新的发展方向。基因芯片技术是近年来兴起的一种早期快速检测的方法，通过高通量平行检测病原体的多个基因，可大大提高检测的灵敏度和精确度，克服了 PCR扩增以单个基因为靶标进行检测而易出现假阳性及假阴性的缺点，同时通过计算机软件分析杂交结果，降低了结果判断的主观因素，因而能够快速、准确、高通量地对多种疾病进行早期的快速诊断与排查。但是，目前未有成熟的基因芯片检测技术应用于猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征(亚型)的检测。
针对现有技术存在检测费时费力和成本高，且只能对单一病种进行检测之不足，本发明的目的是提供一种猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因芯片，以及该芯片的制备方法；进一步，本发明还提供采用该基因芯片对猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征三种病同时进行检测的方法。本发明采用的技术方案如下一种用于检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的基因芯片，其特征在于采用如下表所示的探针序列本发明提供了一种猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型与美洲型基因芯片检测方法，基因芯片采用如下表所示的探针序列本发明采用该基因芯片对猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征三种疾病同时进行检测的方法。解决了现有检测技术费时费力和特异性差，或只能对单一病种进行检测的问题。本发明设计的所有探针在5’端均合成一个连接氨基，并设计有一段15bp长度的多聚T连接臂，结果表明其具有较高的固定效率。本发明建立的带标记引物的多重PCR扩增技术能够一次性扩增出多种与对应探针互补的荧光标记DNA，保证固液相中核酸杂交的高度特异性和灵敏性。此外，采用此种标记分法，可以大大缩短检测时间，降低芯片检测的成本，更适合推广到临床应用中。

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