专利名称：一种猪瘟疫苗生产用/牛病毒性腹泻病毒抗体阴性新生牛血清生产工艺的制作方法 新生牛血清是将出生14小时以内未进食的健康小牛采集到的血液，经分离收集、过滤除菌而制成的浅黄色澄清稍粘稠的上清液，是目前生物技术领域中生产疫苗(如猪瘟疫苗)不可缺少的原材料之一。而目前猪瘟疫苗生产用BVDV抗体阴性新生牛血清生产工艺为将出生14小时以内未吃初乳的健康新生小牛体表清洗干净后，固定到采血台上，经采血、分离、混合、过滤除菌等工艺。由于牛群中BVDV抗体阳性率高，造成混合血清中BVDV阴性的可能性很小，满足不了生产高质量猪瘟疫苗的需求。因为牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus BVDV)也称牛病毒性腹泻—粘膜病毒(BVDV/MDV)，与猪瘟病毒(CSFV)同属黄病毒科瘟病毒属，亲缘关系密切，在血清学上有交叉反应，新生牛血清中如含有BVDV抗体，将严重影响猪瘟疫苗的效价与保护率。BVDV病又呈全球性分布，在《国外兽医学—畜禽疾病》Ames R..Vet.Med.1990，101140-1145中报道牛群中BVDV血清抗体阳性高达50％～90％。而目前包括猪瘟疫苗在内的所有生物制品制造业都渴望其所用的原材料要批量大、批间差小，因此只有将几百头甚至几千头新生牛的血清混合，才能实现这一愿望，并且这也是目前所有新生牛血清生产厂家的研发方向。因为牛群中BVDV抗体阳性率高，无法实现成品新生牛血清中BVDV抗体阴性，这一现实长期困扰着猪瘟疫苗生产企业和用户，这也是猪瘟疫苗提高质量和效益的最大障碍。
本发明的目的是提供一种猪瘟疫苗生产用/BVDV抗体阴性新生牛血清生产工艺，能保证BVDV抗体阴性，批量大，便于溯源，提高猪瘟疫苗的质量、效价和保护率。本发明生产工艺流程包括全封闭无菌采血、静置凝固、低温分离、BVDV抗体阴性原料血清筛选，大规模混合、现代膜过滤，还包括(a)将非疫区出生14h以内未吃初乳，经检疫合格的健康小牛，建立有利于溯源母牛健康档案，根据小牛健康状况、出生时间进行分类编号，实行颈动脉全封闭无菌采血，静置凝固，低温分离收集血清，每1头或2头小牛的血清单独装入专门的血清桶，每桶取样，分别检测BVDV抗体；(b)样品经γ射线或水浴灭活，用病毒中和试验原理，用牛肾或牛睾丸原代细胞在96孔细胞培养板上进行检测；(c)由检测样品、平衡盐、10-6BVDV标准株制成的中和液中和1h，吸附2h后加维持液，在5％CO237℃中培养5天，根据细胞病变情况筛选出BVDV抗体阴性的样品，根据其编号挑选出BVDV抗体阴性的血清；(d)将挑选出BVDV抗体阴性的血清，解冻后用现代膜过滤，加入细胞加强剂，然后用大规模混合罐混合、再进行分装。其中所说的静置凝固是在冰浴中静置保存10～12h。其中所说的中和液，其比例为检测样品∶平衡盐∶10-6BVDV标准株＝1∶1∶1。本发明的优点是采用96孔细胞培养板，筛选出BVDV抗体阴性的粗制血清进行加工生产，工作效率高、结果可靠、低成本、适用于工业化生产，提高了猪瘟疫苗的质量、效价和保护率，为养猪业的迅速、健康发展提供了保障。将非疫区出生14h以内(必须保证从出生到采血的时间不能超过14h)未吃初乳，经检疫合格的健康小牛，建立有利于溯源母牛健康档案，档案内容主要包括所属地(饲养场)、畜主、编号和近期的疫病防疫情况。根据小牛健康状况、出生时间进行分类编号。出生2小时以内的健康小牛用绿牌(F)表示，同一天收购的分别以F1、F2、F3……表示。出生4小时以内的健康小牛用蓝牌(G)表示，同一天收购的分别以G1、G2、G3……表示。出生14小时以上的健康小牛用黄牌(Y)表示，同一天收购的分别以Y1、Y2、Y3……表示。小牛精神不振、拉稀或进食的用红牌(R)表示，同一天收购的分别以R1、R2、R3……表示，被编入R类的小牛，只能将皮进行利用，肉加工后可以作为动物饲料肉粉添加剂，血液不能利用，必须当场高压灭菌后废弃。
采血所有的器具处理方法如下尽量去除或减低采血过程中外源性细菌内毒素污染，所用器具用清洁剂清泡在热水中约10min，然后进行刷洗，用自来水冲洗5遍以上，再用蒸馏水涮洗3～4次，最后用蒸馏水涮洗1～2遍，低温烘干后用牛皮纸封口。如果器具为塑料橡胶制品，用较低的温度和压力，长时间蒸汽灭菌，如115℃(007Mpa)20min。如果器具为金属和玻璃制品，用较高的温度和压力，短时间蒸汽灭菌，如126℃(0.14Mpa)30min，玻璃制品还要用干热灭菌即180℃维持2.5h。
做好准备工作后，将小牛用自来水清洗干净，然后固定在局部空气净化达到100级的工作台上，将小牛编号朝接血方向以便记录，接血人员登记小牛编号和类别，准备好离心管并编号，从采血孔中输出采血管；小牛颈部先剪毛，75％酒精棉球做大面积消毒后，再用75％酒精棉球在切口处消毒一次，做皮肤切口，用钝性分离找出颈总动脉，向脑端用线绳解扎，向心端用止血钳解扎，再用75％酒精棉球对颈总动脉消毒，两解扎间做切口，向心方向插入采血针头解除止血钳解扎，血液在采血管内流向洁净室层流罩下已准备好的离心杯中，调整采血管的位置，使血液沿管壁流入，用解扎线绳的末端固定采血针(管)，接血离心的地方必须与固定小牛和采血的地方分室进行，接血所在环境必须在万级背景下的局部百级中进行。
采得的血液在自然状态冰浴中静止10～12h，然后放入低温离心机中(温度控制在2～8℃下，3600～4000r/min)离心20～30min，离心应在万级环境中进行，收集血清，将每1头或每2头小牛的血清单独装入专门的血清桶，每桶取样，分别检测BVDV抗体，样品和桶均编一个相同的编号，桶中的血清在一15℃～-18℃中贮存，样品送实验室进行BVDV抗体检测。
样品用56℃水浴30min或60Coγ射线进行灭活，其剂量为10Kgy。用病毒中和试验原理，在96孔细胞培养板上用牛肾或牛睾丸原代细胞进行实验，其细胞要符合西北民族大学生物工程与技术实验室《鉴定用原代细胞的制备、鉴定与灵敏度实验规程》的要求。细胞长成单层后，加中和1h的中和液100μl/孔，中和液成份为检测样品、平衡盐、10-6BVDV标准株，其比例为检测样品平衡盐∶10-6BVDV标准株＝1∶1∶1。吸附2h后换加维持液200μl/孔，在5％CO237℃中培养5天，根据细胞病变的情况筛选出BVDV抗体阴性的样品，根据其编号挑选出BVDV抗体阴性的血清。将BVDV抗体阴性血清解冻后用现代膜过滤，加入细胞加强剂，其有效成分在血清中最终浓度0.12mmol/L，然后用15转/h的转速在大规模混合罐中混合并分装。
终产品按上述方法经BVDV抗体检验结果为阴性的，即为BVDV抗体阴性新生牛血清，其它指标检测执行《中国生物制品主要原辅材料质控标准》(2000年版)。
在本工艺中生产BVDV抗体阴性血清时，每1～2头的血清单独包装，并挑选BVDV抗体阴性的血清专门生产，在生产过程中不存在BVDV抗体污染环节，能保证终产品中BVDV抗体阴性。按此法生产的2批产品共2500升，送中国兽医诊断中心，用进口的检测试剂盒检测，结果均为阴性，得到的检测数据特别理想。


本发明涉及一种新生牛血清生产工艺，更具体地说，涉及一种猪瘟疫苗生产用/BVDV抗体阴性新生牛血清生产工艺。本发明生产工艺，其工艺流程包括全封闭无菌采血、静置凝固、低温分离、BVDV抗体阴性原料血清筛选、大规模混合、现代膜过滤。本发明的优点是采用96孔细胞培养板，筛选出BVDV抗体阴性的粗制血清进行加工生产，工作效率高、结果可靠、低成本、适用于工业化生产，提高了猪瘟疫苗的质量、效价和保护率，为养猪业的迅速、健康发展提供了保障。