痛风易感基因无创检测试剂盒（apoe等基因）的制作方法[0002]痛风是由于嘌呤代谢紊乱及尿酸排泄障碍所导致的疾病。作为其主要临床特征之一的高尿酸血症是痛风发病的直接原因。当血液中尿酸浓度过高时，尿酸就会以钠盐的形式沉积在关节、软组织和肾脏中，从而使身体免疫系统产生响应并引发造成痛苦的组织异物炎性反应。由于半数以上的痛风病患者都有家族史，说明遗传因素在痛风的发病过程中起着重要作用。已经有研究表明亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、SLC22A12基因和载脂蛋白E (ApoE)等基因的多态性均与高尿酸血症的易感性有显著关联，在预防和治疗痛风中具有一定的预测价值。[0003]MTHFR基因是同型半胱氨酸(Hcy)代谢途径中的关键酶。MTHFR基因的第677位C — T突变(C677T)会使其编码的氨基酸从丙氨酸变为缬氨酸，从而影响酶的活性及热稳定性并使血浆中同型半胱氨酸浓度升高。研究发现在我国云南昆明地区、山东青岛地区及新疆地区的高尿酸血症患者中MTHFR基因第677位T等位基因频率及TT基因型频率均显著高于健康人群。另外，在山东沿海地区的高尿酸血症患者及痛风病患者中也发现了相同的结论，表明MTHFR基因是高尿酸血症和痛风病的遗传易感基因。[0004]SLC22A12编 码的尿酸盐转运蛋白URATl在调节肾小管对尿酸盐的重吸收以及维持血清中尿酸的动态平衡中发挥着重要的作用。最初在德国原发性高尿酸血症患者中发现SLC22A12基因外显子I的C258T位点多态性与高尿酸血症呈现显著相关性。随后在我国山东沿海地区亦发现SLC22A12基因C258T多态性位点的CC+CT基因型频率显著增加而TT基因型频率则明显降低，是高尿酸血症的候选基因之一，可积极用于指导痛风病的预防工作。[0005]ApoE是由299个氨基酸构成的含磷脂糖蛋白，是血浆脂蛋白的重要组成部分并直接参与胆固醇代谢。ApoE主要有ε 2、ε 3和ε 4三种等位基因，分别编码Ε2、Ε3和Ε4三种不同的异构体。在一项针对巴西城市人口的研究中发现ε4等位基因在高尿酸血症患者中显著升高。而在我国新疆地区汉族人口中也有研究表明与正常人群相比，高尿酸血症患者的ApoE基因型有显著差异，ε 2等位基因频率呈现下降趋势而ε 4等位基因频率则有升高趋势。另外，在山东济南地区的高尿酸血症患者中也发现了 ε4等位基因频率有升高的趋势。因此ε 4等位基因被认为是高尿酸血症发病的危险因素，在痛风病的预防过程中具有重要参考价值。[0006]综上所述，鉴于MTHFR基因、SLC22A12基因和ApoE基因在高尿酸血症和痛风疾病中体现出来的疾病显著相关性，可以通过检测这些痛风发生相关基因位点的基因型来及时筛查出易患痛风的高危人群，从而有针对性地预防和治疗痛风，这对于降低痛风的发病率有非常重要的意义。
[0007]基于检测MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T(rs3825016)、AP0E基因上ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的3个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估痛风发病的危险因子的基础上，本发明提供一种检测痛风遗传易感性的试剂盒。[0008]该试剂盒包括:
检测 MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T (rs3825016)、AP0E基因上ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物。
[0009]PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)。
[0010]PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0011]DNA测序反应组件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0012]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0013]PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0014]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70`% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0015]本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。

[0016]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0017]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0018]实施例1.检测试剂盒的使用。
[0019]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0020]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)MTHFR(C677T)正向引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC 3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(2)SLC22A12 (C258T)正向引物:5’ACGATTGTGGAGGTGAAGATG3’
SLC22A12 (C258T)反向引物:5’ CATGTGGCTGTGTACCCAG3’
(3)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)正向引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)反向引物:5’ TGCCCATCTCCTCCATCC3’。
[0021 ] PCR扩增的反应体系为:10 X PCR反应缓冲液2.5ml ；25mM的dNTP混合液
0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。
[0022]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0023]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0024]在AB I2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0025]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)MTHFR(C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC 3’
(2)SLC22A12 (C258T)测序引物:5’ACGATTGTGGAGGTGAAGATG3’
(3)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)测序引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’。
[0026]反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0027]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0028]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0029]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0030]实施例2.对人们进行预防痛风发病的基因无创检测的服务。
[0031]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0032]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的MTHFR基因上C677T (rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T (rs3825016)、APOE 基因上 ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的 3 个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0033]3.痛风发病高危人群风险评估
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具痛风易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、SLC22A12 基因上的 C258T(rs3825016)、APOE基因上ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358)的3个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读痛风易感基因无创检测报 告单。