心肌梗塞易感性无创检测试剂盒（il-6等基因）的制作方法[0002]心肌梗塞是一种急性的且会引起生命危险的心脏状态。其病因是由于部分心肌的血液循环中断而使相应心肌出现严重的持久性急性缺血，从而最终导致心肌缺血性坏死。其临床症状可表现为胸骨后剧烈疼痛、不适、晕眩等，并出现心律失常、休克和心力衰竭等现象，有时甚至会 丧失知觉。在发展中国家心肌梗塞仍是最大的死亡原因之一，发生后一年内的死亡率约为50%。因此开发出一种便捷、高效的心肌梗塞易感性检测技术将对于预防和治疗心肌梗塞具有积极的意义。目前已经有研究表明血管紧张素转化酶(ACE)和载脂蛋白E(ApoE)等基因的单核苷酸多态性均与心肌梗塞的易感性有直接关联，在预防和治疗心肌梗塞中具有一定的预测价值。[0003]肾素-血管紧张素系统在心血管系统中起着举足轻重的作用，而ACE是肾素-血管紧张素系统的重要成分，负责将血管紧张素I转化为有生物活性的血管紧张素II，能影响心肌和血管平滑肌细胞的增殖。ACE第16内含子中由287个碱基对组成的Alu重复序列的存在(I)或缺失(D)被称为插入/缺失(Ι/D)多态性。ACE的DD基因型可导致较高水平的血管紧张素II并引起心律失常。在中国汉族人群中已经发现心肌梗死患者ACE基因的DD基因型和D等位基因频率均显著高于正常人，被认为是心肌梗塞的一个独立危险因素。另外在2型糖尿病患者中也发现心肌梗塞并发者的DD纯合子频率显著增高，认为该基因型是心肌梗塞的风险因子。[0004]ApoE是由299个氨基酸构成的含磷脂糖蛋白，是血浆脂蛋白的重要组成部分并直接参与胆固醇代谢。ApoE主要有ε 2、ε 3和ε 4三种等位基因，分别编码Ε2、Ε3和Ε4三种不同的异构体。许多研究表明在心肌梗塞患者中ApoE ε 4/ ε 3基因型和ε 4等位基因频率均显著高于正常人群。因此，ApoE ε 4等位基因被认为是心肌梗塞的重要遗传标记。至于ApoE ε 4对心肌梗塞的具体作用机制尚不清楚，初步认为是由于改变了血脂水平所导致的。在心肌梗塞中，ApoE ε 4等位基因与ACE基因D等位基因有协同关系。[0005]综上所述，鉴于ACE基因和ApoE基因在心肌梗塞疾病中体现出来的疾病显著相关性，可以通过检测这些心肌梗塞发生相关基因单核苷酸位点基因型来及时筛查出易患心肌梗塞的高危人群，从而有针对性地预防和治疗，这对于降低心肌梗塞的发病率有非常重要的意义。
[0006]基于APOE 基因上 ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6基因上C-572G (rsl800796)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估心肌梗塞发病风险级别，本发明提供一种心肌梗塞基因无创检测试剂盒。[0007]该试剂盒包括:
检测 APOE 基因上 ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6基因上C-572G (rsl800796)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物。
[0008]PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)。
[0009]PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0010]DNA测序反应组件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0011]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0012]PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0013]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0014]本试 剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。

[0015]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0016]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0017]实施例1.检测试剂盒的使用。
[0018]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0019]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)正向引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’
APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)反向引物:5’ TGCCCATCTCCTCCATCC3’
(2)ACE (I/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
ACE (I/D)反向引物:5’ ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’
(3)IL-6 (C-572G)正向引物:5’CAGCAGCCAACCTCCTCTAA3’
IL-6 (C-572G)反向引物:5’CCAAGCCTGGGATTATGAAG3’。
[0020]PCR扩增的反应体系为:10 X PCR反应缓冲液2.5ml ；25mM的dNTP混合液
0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。[0021]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0022]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0023]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0024]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)测序引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’
(2)ACE (Ι/D)测序引物:5’CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
(3)IL-6 (C-572G)测序引物:5’ CAGCAGCCAACCTCCTCTAA3’。
[0025]反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0026]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0027]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去`上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0028]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0029]实施例2.为人群进行预防心肌梗塞基因无创检测的服务。
[0030]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0031]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的APOE基因上ε 2 ε 3 ε 4(rs429358，rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6 基因上 C-572G (rsl800796)的 3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0032]3.心肌梗塞高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具心肌梗塞风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 APOE 基因上 ε2ε3ε4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6基因上C-572G (rsl800796)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读心肌梗塞基因无创检测报告单。