专利名称：人脂肪干细胞无血清基础培养基的制作方法人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖I倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析CD9，CD10, CD 13, CD29, CD44, CD49d, CD49e, CD54, CD55, CD59, CD90, CD105, CDl 17，CD146, CD166, STRO-1 均为阳性，而⑶31，⑶34，⑶45均为阴性。最大的区别是ADSCs表达⑶49d，不表达⑶106，而正好相反，BMSCs表达CD106,不表达CD49d。目前常用的ADSCs培养是利用饲养层细胞与采用含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢，更要紧的是使用饲养层细胞和动物血清容易导致干细胞污染，特别是动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒将对人体健康构成极大地风险，这样培养出的干细胞不适于直接应用于临床。
本发明的目的是提供一种人脂肪干细胞无血清基础培养基，克服使用血清制备细胞培养基的缺点和风险。在细胞培养中使用血清的缺点有很多例如血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，使血清有如下几个明显的缺点对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态；血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成；大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵,是构成动物细胞培养生产成本的主要部分之一。一种人脂肪干细胞无血清基础培养基使用血清替代剂，由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、a-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、a-酮戊二酸和硒组成。人血清白蛋白优选浓度为0. 25 2. Omg/mL、转铁蛋白优选浓度为I. 25 10. 0 u g/mL、牛磺酸优选浓度为0. 25 3. Oug/mL、还原型谷胱甘肽优选浓度为2 15 u g/mL、铜蓝蛋白优选浓度为0. f 0. 35U/mL、L-抗坏血酸-2-硫酸酯优选浓度为KTlSOyg/mL、a -生育酚琥珀酸单酯优选浓度为l(Tl5X10-7mOl/L、亚油酸优选浓度为I. 25 10. 5 ii g/mL、a-酮戊二酸优选浓度为1父10-5 210-411101/1和硒优选浓度为I. 25 10. Ong/mL。人血清白蛋白最优浓度为I. 25mg/mL,转铁蛋白最优浓度为6. 25 u g/mL,牛磺酸最优浓度为I. 25 u g/mL,还原型谷胱甘肽最优浓度为10 U g/mL,铜蓝蛋白最优浓度为0. 25U/mL, L-抗坏血酸_2_硫酸 酯最优浓度为50 V- g/mL, a -生育酹琥拍酸单酯最优浓度为9X 10_7mol/L,亚油酸最优浓度为5. 35 u g/mL, a -酮戍二酸最优浓度为IX 10_4mol/L,硒最优浓度为6. 25ng/mL。其中各组分作用如表I :表I :本发明使用的试剂及其作用本申请公开了一种人脂肪干细胞无血清基础培养基。本培养基使用血清替代剂，由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、α-酮戊二酸和硒组成。无血清基础培养基因能免除常规含血清培养基中动物血清给人体健康带来的潜在威胁，其培养的脂肪干细胞更适于临床应用。