一种新型的低温脂肪酶的制作方法【技术领域】[0001]本发明提供了ー种新型低温脂肪酶，提供了该低温脂肪酶的基因序列，经过对该低温脂肪酶的提取、分离纯化及酶学性质的研究确定了该低温脂肪酶的酶学性质:最适温度为30°C，在(TC仍具有65%的相对酶活；最适PH = 10.0，且在pH = 3.0-10.5范围内稳定性较好；60°C下保温40min,仍有65%剩余酶活,热稳定性好；蛋白分子量为36kDa ;最适作用底物为P-NPB等等，是ー种新的低温脂肪酶，可广泛应用于洗涤剂、食品エ业、造纸、医药、皮革及环境保护领域。同时还提供了该低温脂肪酶的发酵制备方法和发酵菌种的16SrRNA基因序列，属于生物[0002]脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)又称甘油三酰酯甘油水解酶(triacylglycerolacylhyrolase),能在油-水界面上催化其水不溶性的天然底物甘油三酰酯水解为脂肪酸和甘油[1]。在微水环境下，脂肪酶具有独特的性能，其催化反应具有可逆性，包括甘油酯及水不溶性酯类的水解、醇解、酸解以及酯化等反应。除了能分解脂肪外，脂肪酶还可催化其它酯水解的能力，因此脂肪酶具有底物多祥性的同时又具有高度立体异构专一性和化学选择性。[0003]脂肪酶广泛存在于自然界中，动、植物和微生物都能产生脂肪酶。按其作用pH的不同，可以将脂肪酶分为酸性、中性、碱性脂肪酶；而按其作用温度的高低则可以分为低温脂肪酶(cold-active lipase)、中温脂肪酶和高温脂肪酶。微生物脂肪酶是生物技术中应用酶类的重要组成部分，是继蛋白酶、糖化酶的第三大商业用酶，已被广泛应用于洗涤剂、食品エ业、造纸、医药、皮革等方面。[0004]在相继开发出中温脂肪酶、中高温碱性脂肪酶等的基础上，低温脂肪酶的研究和应用也引起了广泛关注。同中高温脂`肪酶相比，低温脂肪酶在低温下具有良好的催化活性和低温适应性。根据Margesin等人的定义,`把酶最适反应温度在30°C左右，0°C时仍有一定催化活性的脂肪酶称为低温脂肪酶，在最适反应温度下此类酶活性与其在0°C时活性的比值一般小于80。由于低温脂肪酶在低温环境下具有高催化活性而其活化能和反应最适温度较低，有利于节约能源和防止产物结构破坏，因此对于环境保护也有一定意义，所以生产和应用低温脂肪酶在某些领域中有着中高温脂肪酶不可比拟的优越性，具有广阔的应用前景，我们就是在这样的思想指导下，积极地研究和挖掘新的低温脂肪酶，经过多次的试验成功获得ー种新的低温脂肪酶。
[0005]本发明提供了ー种新型的低温脂肪酶，提供了该低温脂肪酶的基因序列并对该脂肪酶酶学性质研究确定:该脂肪酶的最适PH= 10.0，且在pH = 3.0-10.5范围内稳定性较好；最适温度为30°C，在0°C仍具有65%的相对酶活，60°C下保温40min，仍有60%剩余酶活，热稳定性好，具有一定的耐醇性；Na+、Mg2+对脂肪酶的活力有明显的促进作用，Cu2+和Zn2+对脂肪酶的活力有明显的抑制作用；非离子型表面活性剂Tween-40和Tween-60对脂肪酶活性有显著的的激活作用，Tween-80对脂肪酶的活性有一定的抑制作用；最适作用底物为 P-NPB5Kni 值为 0.120mmol/L,Vmax 为 400U/mg，Kcat 为 240 S^1 ;蛋白分子量为 36kDa，是一种新的低温脂肪酶。[0006]本发明的技术方案:用我们自己筛选得到的ー株产脂肪酶的野生菌种，进行种子培养和发酵产酶得到粗酶液，将粗酶液通过双水相系统、DEAE-cellulos52和SephadexG-75分子筛层析纯化得到的该低温脂肪酶进行酶学性质研究；经PCR扩增得到该低温脂肪酶基因，与Burkholderia相应基因具有很高同源性，该低温脂肪酶基因全长1095bp，可编码364个氨基酸残基；此克隆序列的氨基酸残基129-133处为脂肪酶的高度保守区域即活性中心序列GXSXG ;脂肪酶蛋白N端存在信号肽序列。エ艺为:[0007]1、脂肪酶的提取、分离纯化过程及酶学性质研究
[0008]发酵液制备一真空冷冻干燥一双水相萃取一透析脱盐一DEAE-cellulose离子交换层析一透析脱盐一Sephadex G-75 — SDS-PAGE鉴定。
[0009]1.1双水相萃取
[0010]配制质量分数为40%磷酸盐溶液，4°C冰箱中保存备用。磷酸盐由K2HPO4和NaH2PO4组成，调节二者比例得到所需的pH。按重量配制双水相萃取体系，以20g为萃取体系总质量，取冻干酶粉4g，用少量蒸馏水溶解。按照比例称取一定量的醇类溶液和磷酸盐溶液，质量不足部分以水补足。l，500g离心5min使其充分分相。分别测定上下相的脂肪酶活力和总蛋白含量以及上下相的体积，按以下公式计算:相比R =上相体积/下相体积；分配系数K =上相脂肪酶比活力/下相脂肪酶比活力；萃取率S = RKバ1+RK)。
[0011]1.2 DEAE-cellulose 离子交换层析
[0012]双水相萃取得到的上相溶液，经透析以备上样。将装填有DEAE-cellulose阴离子交换介质的层析柱(1.6CmX30Cm)首先用pH 7.2,20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，直至流出液PH值达到7.2。将上述透析液过0.45 ii m膜，以2mL/min的流速上样，上样量为10mL。上样完全后，用相同的缓冲液洗脱1.5个柱体积，没有吸附上的蛋白即被洗脱出来，吸附上的蛋白则改用含lmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)进行线性洗脱，流速为2mL/min。收集脂肪酶酶活力高的洗脱液，透析，4°C贮存备用。
[0013]1.3Sephadex G-75 分子筛层析
[0014]将Sephadex G-75 分子筛层析柱(1.6cm X 60cm)首先用 pH 7.2, 20mmol/LTris-HCl缓冲液平衡，然后取2mL样品上柱，用相同的缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min。收集酶活高的部分，浓缩，4°C保藏备用。
[0015]1.4蛋白及同エ酶电泳图谱
[0016]SDS-PAGE浓缩胶浓度5 %，分离胶浓度12 %，考马斯亮蓝R-250染色，根据标准蛋白分子量曲线求得脂肪酶的分子量大小。
[0017]Native-PAGE:浓缩胶5%，分离胶12%，._SDS，电泳后，若考察发酵液中的蛋白质数量，则用考马斯 亮蓝R-250染色；若考察同エ酶酶谱，染色采用改良后的脂肪酶经典染色法:溶液A:200mg a -こ酸萘酯、200mg & -こ酸萘酯分别溶于IOmL丙酮，混合后加入pH7.0的Tris-HCl缓冲液定容至200mL。溶液B:5g铁氰化钾溶于IOOmL pH7.0的Tris-HCl缓冲液。将胶置于溶液A中，30°C染色15min后转移至溶液B复染。[0018]1.5pH值对脂肪酶的影响
[0019]分别将酶液置于pH 6.5-10.5的lOOmmol/L缓冲液中，测定脂肪酶活力，考察脂肪酶最适反应pH值。将酶液分别加入到pH 3.0-10.0的100mmol/L缓冲液中，4°C放置24h，以未处理酶液的活力计为100%，计算相对活力，考察脂肪酶的pH稳定性。
[0020]1.6温度对脂肪酶的影响
[0021]纯酶分别在不同温度(0_70°C )下，測定脂肪酶活力，考察脂肪酶的最适反应温度。将一定量的酶液溶解于20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，分别放置在40_70°C下保温，在最适温度下定期測定其残余酶活，以未保温酶液的酶活计为100%，计算相对酶活，考察脂肪酶的热稳定性。
[0022]1.7金属离子对脂肪酶的影响
[0023]在酶溶液中分别添加不同的金属离子，使其终浓度分别为I，5，IOmmoI/L，30°C保温IOmin后，測定脂肪酶活力，以未添加金属离子的酶液活力为100%，计算相对酶活。
[0024]1.8有机溶剂对脂肪酶的影响
[0025]在酶溶液中分别添加0-50% (v/v)的有机溶剂，測定不同浓度下有机溶剂对脂肪酶活力的影响，以未添加有机溶剂的酶液活力为100%，计算相对酶活。
[0026]1.9表面活性剂对脂肪酶的影响
[0027]在酶溶液中分别添加不同的表面活性剂，使其终浓度分别为0.1,0.3,0.5%,30°C保温30min后，測定脂肪酶活力，以未添加金属离子的酶液活力为100%，计算相对酶活。
[0028]1.10脂肪酶动力学研究
[0029]在底物p-NPB浓度分别为0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、或1.0mmol/L条件下下测定脂肪酶活力。采用Lineweaver-Burk (双倒数)作图法,求出脂肪酶动力学常数Km和Vmax,以及催化常数Kcat。
[0030]1.11脂肪酶对不同底物的水解能力
[0031 ] 分别以p-NPB，p-NPA, p-NPC, p-NPP为底物测定纯化后脂肪酶的酶活以确定对不同长度碳链脂肪酸的水解能力。
[0032]2、低温脂肪酶基因的克隆及序列分析
[0033]2.1.引物设计
[0034]LIPF:ATGGTCAGAT CGATGCGTTC CAG
[0035]LIPR:CTGAAA ACGGAGGGCG TGTAG
[0036]2.2低温脂肪酶基因克隆
[0037]以基因组DNA为模板，LIPF和LIPR为上下游引物进行扩增。
[0038]25 ii L 的 PCR 反应体系含有:DNA 模板 I y L，dNTP 2 y L，引物 LIPFl y L，引物 LIPRI u L, 10XPCR buffer 2.5 u L, Taq 酶 0.5 y L，ddH20 17 y し
[0039]PCR 扩增条件为:94°C 4min, (94°C 30s，55°C 30s.,72°C 90s)共进行 30 个循环，16°C保存。
[0040]2.3脂肪酶基因序列的測定及分析
[0041]将经过PCR扩增的低温脂肪酶基因进行DNA序列測定，得到低温脂肪酶的基因序列，利用DNAMAN6.0软件对序列进行拼接和分析，将DNA测序的拼接结果以及推导的氨基酸序列在NCBI数据库中进行Blast比对。[0042]根据对脂肪酶酶学性质的研究及对脂肪酶基因序列的測定的分析，确定为ー种新的低温脂肪酶。
[0043]本发明的有益效果:
[0044]首先提供了ー种新型的低温脂肪酶，该低温脂肪酶与已发现的低温脂肪酶相比较具有如下特点:
[0045]1、热稳定性好。在40°C下保温60min仍能保持70%的酶活，60°C下保温40min，仍有60%剩余酶活。
[0046]2、具有一定的耐醇性在异丙醇浓度为12.5%时，脂肪酶分配系数和萃取率达到最大?
[0047]3、该酶在较宽的pH范围内pH(3.0-10.5)稳定性较好，适用PH范围广。
[0048]4、粗酶性质稳定。
[0049]5、低温环境下具有高催化活性，在0 °C时酶活仍有最大值的60 %左右，有广阔的应用前景。
[0050]由于低温脂肪酶在低温环境下具有高催化活性而其活化能和反应最适温度较低，有利于节约能源和防止产物结构破坏，因而在エ业应用上具有广阔的前景，同时对于环境保护也有一定意义。低温脂肪酶的催化特性是近年来酶学研究的ー个热点，其生物适冷机制、新菌种的收集鉴定与菌种系统发育分析以及新型生物活性物质的研究开发等方面也受到世界各国的重视。因此本发明ー种新型的低温脂肪酶将有广泛的エ业使用价值和较显著的经济效益前景。

[0051]实施例1
[0052]1、低温脂肪酶的提取、分离纯化及酶学性质:
[0053]1.1发酵液于4°C 10，800g离心20min，取上清液，即胞外脂肪酶粗酶液，经真空冷冻干燥制成粗酶粉，4°C冰箱保存。
[0054]1.2发酵液蛋白含量的测定采用Bradford检测法。在试管中加入0.1mL酶液，对照为IOOii L双蒸水替代相应的酶液，再加入4mL 0.01 %考马斯亮蓝G-250溶液，振荡摇匀。5min后测定595nm处吸光度。测量在Ih内完成。
[0055]1.3脂肪酶活性測定:以对硝基苯丁酸酯(p-NPB)为底物。将3.7mL 0.lmol/LTris-HCl (pH 9.0)缓冲液和 0.2mL IOmmoI/L p-NPB 组成的反应体系，30°C保温 15min 后加入0.1mL酶液,在405nm下测定吸光值。以Imin内催化产生Iiimol的对硝基酹(￡ =1.86 X IO4CnT1XM-1)所需的酶量为I个酶活力单位(U)。
[0056]1.4脂肪酶酶的提取及分离纯化过程
[0057]发酵液制备一真空冷冻干燥一双水相萃取一透析脱盐一DEAE-cellulose离子交换层析一透析脱盐一Sephadex G-75 — SDS-PAGE鉴定。
[0058]1.4.1双水相萃取
[0059]配制质量分数为40%磷酸盐溶液，4°C冰箱中保存备用。磷酸盐由K2HPO4和NaH2PO4组成，调节二者比例得到所需的pH。按重量配制双水相萃取体系，以20g为萃取体系总质量，取冻干酶粉4g，用少量蒸馏水溶解。按照比例称取一定量的醇类溶液和磷酸盐溶液，质量不足部分以水补足。l，500g离心5min使其充分分相。分别测定上下相的脂肪酶活力和总蛋白含量以及上下相的体积，按以下公式计算:相比R =上相体积/下相体积；分配系数K =上相脂肪酶比活力/下相脂肪酶比活力；萃取率S = RKバ1+RK)。
[0060]1.4.2DEAE_celIulose 离子交换层析
[0061]双水相萃取得到的上相溶液，经透析以备上样。将装填有DEAE-cellulose阴离子交换介质的层析柱(1.6CmX30Cm)首先用pH 7.2,20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，直至流出液PH值达到7.2。将上述透析液过0.45 ii m膜，以2mL/min的流速上样，上样量为10mL。上样完全后，用相同的缓冲液洗脱1.5个柱体积，没有吸附上的蛋白即被洗脱出来，吸附上的蛋白则改用含lmol/LNaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)进行线性洗脱，流速为2mL/min。收集脂肪酶酶活力高的洗脱液，透析，4°C贮存备用。
[0062]1.4.3Sephadex G-75 分子筛层析
[0063]将Sephadex G-75 分子筛层析柱(1.6cm X 60cm)首先用 pH 7.2, 20mmol/LTris-HCl缓冲液平衡，然后取2mL样品上柱，用相同的缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min。收集酶活高的部分，浓缩，4°C保藏备用。
[0064]1.4.4蛋白及同エ酶电泳图谱
[0065]SDS-PAGE浓缩胶浓度5 %，分离胶浓度12 %，考马斯亮蓝R-250染色，根据标准蛋白分子量曲线求得脂肪酶的分子量大小。
[0066]Native-PAGE:浓缩胶5%，分离胶12%，._SDS，电泳后，若考察发酵液中的蛋白质数量，则用考马斯亮蓝R-250染色；若考察同エ酶酶谱，染色采用改良后的脂肪酶经典染色法:溶液A:200mg a -こ酸萘酯、200mg & -こ酸萘酯分别溶于IOmL丙酮，混合后加入pH7.0的Tris-HCl缓冲液定容至200mL。溶液B:5g铁氰化钾溶于IOOmL pH7.0的Tris-HCl缓冲液。将胶置于溶液A中，30°C染色15min后转移至溶液B复染。
[0067]L 5pH值对脂肪酶的影响
[0068]分别将酶液置于pH 6.5-10.5的lOOmmol/L缓冲液中，測定脂肪酶活力，考察脂肪酶最适反应pH值。将酶液分别加入到pH 3.0-10.0的100mmol/L缓冲液中，4°C放置24h，以未处理酶液的活力计为100%，计算相对活力，考察脂肪酶的pH稳定性。
[0069]1.6温度对脂肪酶的影响
[0070]纯酶分别在不同温度(0_70°C )下，測定脂肪酶活力，考察脂肪酶的最适反应温度。将一定量的酶液溶解于20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，分别放置在40_70°C下保温，在最适温度下定期測定其残余酶活，以未保温酶液的酶活计为100%，计算相对酶活，考察脂肪酶的热稳定性。
[0071]1.7金属离子对脂肪酶的影响
[0072]在酶溶液中分别添加不同的金属离子，使其终浓度分别为I，5，IOmmoI/L，30°C保温IOmin后，測定脂肪酶活力，以未添加金属离子的酶液活力为100%，计算相对酶活。
[0073]1.8有机溶剂对脂肪酶的影响
[0074]在酶溶液中分别添加0-50% (v/v)的有机溶剂，測定不同浓度下有机溶剂对脂肪酶活力的影响，以未添加有机溶剂的酶液活力为100%，计算相对酶活。
[0075]1.9表面活性剂对脂肪酶的影响
[0076]在酶溶液中分别添加不同的表面活性剂，使其终浓度分别为0.1,0.3,0.5%,30°C保温30min后，測定脂肪酶活力，以未添加金属离子的酶液活力为100%，计算相对酶活。
[0077]1.10脂肪酶动力学研究
[0078]在底物p-NPB浓度分别为0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、或1.0mmol/L条件下下测定脂肪酶活力。采用Lineweaver-Burk (双倒数)作图法,求出脂肪酶动力学常数Km和Vmax,以及催化常数Kcat。
[0079]1.11脂肪酶对不同底物的水解能力
[0080]分别以p-NPB，p-NPA, p-NPC, p-NPP为底物测定纯化后脂肪酶的酶活以确定对不同长度碳链脂肪酸的水解能力。
[0081]经过上述实验、比较、分析，我们确定新型的低温脂肪酶的酶学性质如下:
[0082]1、分子量为 36kDa。
[0083]2、最适pH为10.0，属于碱性脂肪酶。其中:
[0084]2.1PH对酶活性的影响表现为pH 10.5时仍保有pH 10.0时90%的酶活；pH8.0时的酶活仅为pH 10.0时的20%。
[0085]2.2PH对酶稳定性的影响则在pH 3.0-10.5的范围内均表现比较稳定，pH适应范
围比较广。
[0086]3、该脂肪酶酶活在0_30°C之间随着温度的增加而增加,在30°C时达到最大。此外，在0°C时酶活仍有最大值的65%左右，属于低温脂肪酶。在70°C还保持50%左右的酶活。
`[0087]4、Na+、Mg2+对脂肪酶的活力有明显的促进作用，在IOmmoI/L金属盐离
[0088]子浓度时，可提高近一倍的酶活力；Cu2+和Zn2+对脂肪酶的活力有明显的抑制作用。
[0089]5、非离子型表面活性剂Tween-40和Tween-60对脂肪酶活性有显著的的激活作用Jween-SO对脂肪酶的活性有一定的抑制作用；其他表面活性剂对脂肪酶的催化活性改善作用不明显。
[0090]6、低浓度こ醚、异戊醇及正丁醇能刺激酶活的升高，随浓度的升高，产生抑制的影响，仍能但酶活仍能保持90%以上；2_丁酮、丙酮对脂肪酶酶活有很强的抑制作用。可以看出该脂肪酶对弱极性有机溶剂有较好的耐受性。
[0091]7、脂肪酶的 Km 值为 0.120mmol/L，最大反应速度 Vmax 为 400U/mg，Kcat 为 240S—1。
[0092]8、脂肪酶对底物p-NPB，p-NPA, p-NPC, p-NPP表现出不同的水解能力；以p_NPB、P-NPC(C4-C8)为底物测定时表现较高的酶活，而以P-NPA(C2)和P-NPP(C16)为底物測定吋，酶活较低，可见该脂肪酶对中长链脂肪的水解能力较强。
[0093]2、低温脂肪酶基因的克隆、表达及序列分析
[0094]2.1.引物设计
[0095]LIPF:ATGGTCAGAT CGATGCGTTC CAG
[0096]LIPR:CTGAAA ACGGAGGGCG TGTAG
[0097]2.2低温脂肪酶基因克隆
[0098]以基因组DNA为模板，LIPF和LIPR为上下游引物进行扩增。
[0099]25 ii L 的 PCR 反应体系含有:DNA 模板 I u L，dNTP 2 y L，引物 LIPFl y L，引物 LIPRI u L, IOXPCR buffer 2.5 u L, Taq 酶 0.5 y L，ddH20 17 y し[0100]PCR 扩增条件为:94°C 4min, (94°C 30s, 55°C 30s.,72°C 90s)共进行 30 个循环，16°C保存。
[0101]2.3脂肪酶基因序列的測定及分析
[0102]将经过PCR扩增的低温脂肪酶基因进行DNA序列測定，得到低温脂肪酶的基因序列(见序列表)，利用DNAMAN6.0软件对序列进行拼接和分析，将DNA测序的拼接结果在NCBI数据库中进行Blast比对。
[0103] 根据对脂肪酶酶学性质的研究及对脂肪酶基因序列的測定的分析，确定为ー种新的低温脂肪酶。