专利名称：一种分泌脂肪酶的毕赤酵母共表达伴侣蛋白基因工程菌及其应用的制作方法脂肪酶又称三酰基甘油水解酶(EC 3. I. I. 3)是一种广泛应用的水解酶类，能够在水不溶性的底物酯和水的界面催化反应水解底物酯键。微生物脂肪酶被广泛应用于很多工业，如油脂工业、制药工业、食品工业和饲料工业等。但是，所有这些工业化应用能否成功的关键因素之一就是脂肪酶的高水平表达。本研究前期从浓香型大曲中筛选得到一株华根霉(CCTCC M201021)，从中克隆得到了一段脂肪酶基因，并在毕赤酵母中成功表达。喻晓蔚等发明设计的中国专利(CN201010287790. 8)公开了一种高产华根霉脂肪酶的基因工程菌和 构建方法。主要通过荧光定量的技术，筛选并鉴定了含有不同拷贝数脂肪酶基因的重组菌，通过该技术华根霉脂肪酶获得了高水平表达。为了进一步满足工业化生产华根霉脂肪酶的需求和进一步挖掘毕赤酵母表达华根霉脂肪酶的潜力，本发明欲采用共表达伴侣蛋白的策略加强胞内内质网中外源蛋白的合成速率以进一步提高华根霉脂肪酶的表达水平。通过同源建模获得了华根霉脂肪酶的立体结构，分析表明该脂肪酶的结构中存在三对二硫键。分子伴侣能够帮助蛋白质的正确折叠或纠正蛋白质的错误折叠，降低酶蛋白因错误折叠的降解率，伴侣分子不参与蛋白质的最终组成。在酵母中二硫键形成需要内质网氧化还原蛋白Ει·ο1ρ和蛋白质二硫键异构酶PDI协调作用，通过PDI来介导氧化平衡物从Erolp传递到折叠底物，这种氧化平衡物动态穿梭能促进内质网内快速完成二硫键形成，减少或重排错误二硫键链接。通过共表达伴侣蛋白能够促进某些蛋白的表达。针对华根霉脂肪酶富含二硫键这一特征，本发明拟采用共表达两种伴侣蛋白的策略，进一步加强胞内内质网中外源蛋白的折叠速率，从而提高脂肪酶的表达量。分子伴侣的概念早在1978年已被Laskey等人提出，它以其能够帮助蛋白质正确折叠、降低蛋白错误折叠和提高外源蛋白表达量的能力逐渐被人关注。国内外大多数研究主要集中于添加一种伴侣蛋白如PDI等提高外源蛋白的表达量及生物活性。有学者利用基因工程手段增加内质网内分子伴侣Kar2p (结合蛋白)和蛋白质二硫键异构酶(proteindisukfide isomerase,F1DI)的量,使得β -葡萄糖苷酶在酿酒酵母中的表达量提高了 60%;Damasceno等在毕赤酵母中表达Α33单链抗体(A33scFv)的同时，高效共表达免疫球重链结合蛋白质Bip，结果使得A33scFv表达分泌量提高了两倍左右。但是上述研究均忽视了内质网中催化蛋白质氧化折叠中蛋白质的相互联系，仅共表达其中一种伴侣蛋白，而本研究正是在对内质网中Erolp介导的氧化折叠模型细致分析的基础上，提出了共表达Ει·ο1ρ和PDI两种伴侣蛋白，从而显著提高了脂肪酶的表达量
本发明要解决的技术问题是提供一种在巴斯德毕赤酵母(P. pastoris GS115)中能够加速折叠分泌表达华根霉脂肪酶的基因工程菌法，以期运用该高产工程菌大规模的发酵生产华根霉脂肪酶。本发明提供的巴斯德毕赤酵母基因工程菌(Pichia pastoris)基因工程菌，于2012年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 6123。本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种发酵生产脂肪酶的方法，包括如下步骤I)接种所述基因工程菌到YPD培养基中，摇床30°C培养18小时左右，当种子液OD600达2 5后,完成摇瓶种子液的制备；2)然后转入7L发酵罐BSM基础盐培养基进行发酵，起始装液量为2L，在30°C、pH5. 5、溶氧50% 80%条件下进行甘油生长相培养；·3)当基础培养基中甘油消耗完，溶氧值大幅度上升，然后进入过渡相，流加50%甘油(含12mL/L PTMl )，使菌体浓度长至35 39g/L，停止甘油补加，饥饿O. 5h，然后进入诱导相，进行甲醇，每Kg甲醇含30ml PTMl流加，温度控制于26 28 V ;在甲醇诱导表达阶段，采用溶氧两段式控制策略，甲醇流加启动后，控制溶氧为初始溶氧值40% 50%，当菌体浓度达到100 110g/L，适当限制溶氧于10% 20%，整个诱导表达过程中，甲醇浓度维持于 O. 08 O. 12%。共表达两种伴侣蛋白与分别共表达Erolp或者PDI —种伴侣蛋白进行对比研究，共表达两种伴侣蛋白分别提高了 2. 13倍或者2倍。脂肪酶的活性测定方法橄榄油指示剂滴定法参考国家标准GBT 23535-2009脂肪酶制剂酶活在40°C、pH8. O条件下，Imin水解底物产生I μ mo I可滴定脂肪酸所需要的酶量(U/mL)。面包比容测定方法菜籽置换法测定面包体积并称重。面包比容(mL/g)=体积(mL) / 质量(g)。油脂含量测定采用索氏抽提法，溶剂为二氯甲烷，抽提时间6h ；油脂含量(%) =萃取的油脂质量/皮的绝干质量X 100% ；脱脂率(%)=(脱脂前皮的油脂含量-脱脂后皮的油脂含量)/脱脂前皮的油脂含量 X 100%O胶原含量测定采用Hyp法对胶原含量进行测定。用100目滤布过滤浸水废液，然后用10倍于废液量的6M HCl于110°C下水解废液10h，将胶原蛋白完全转化为氨基酸。再将盐酸驱除，蒸馏水定容后进行Hyp含量测定。本发明是利用毕赤酵母真核表达系统来生产华根霉脂肪酶，其表达量极高并可分泌到胞外。本发明的脂肪酶高产菌株的产量达到32000U/mL，远远高于国内外报道的根霉菌属脂肪酶的产量。并且国内外尚无报道利用伴侣蛋白EROlp和PDI两者的协同作用提高外源蛋白在毕赤酵母GS115中的表达水平。80mg/mL fast-blue RR 溶液0. 08g 固蓝 RR 盐溶于 ImL 二甲基亚讽。A液取360 μ L乙酸萘酯溶液和160 μ L fast-blue RR溶液溶于IOmL去离子水；B液取5mL去离子水(含O. 3g琼脂)，煮沸。实施例6基因工程菌的发酵法表达分别挑取数个显色最深的单克隆菌种进行7L发酵罐发酵，发酵方法如下接种单克隆到YPD培养基中，摇床30°C培养18小时左右，当种子液0D600达2 5后，完成摇瓶种子液的制备。然后转入7L发酵罐BSM基础盐培养基进行发酵，起始装液量为2L，在30°C、pH5. 5、溶氧50% 80%条件下进行甘油生长相培养。当基础培养基中甘油消耗完，溶氧值大幅度上升，然后进入过渡相，流加50%甘油(含12mL/L PTMl )，使菌体浓度长至35 39g/L，停止甘油补加，饥饿O. 5h，然后进入诱导相，进行甲醇(每Kg甲醇含30mlPTMl)流加，温度控制于26 28°C。在甲醇诱导表达阶段，采用溶氧两段式控制策略，甲醇流加启动后，控制溶氧为初始溶氧值40 % 50 %，当菌体浓度达到100 110g/L，适当限制溶氧于10% 20%，整个诱导表达过程中，甲醇浓度维持于O. 08 O. 12%。涉及的培养基YPD :蛋白粉20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/LBSM CaS04(cp) I. lg/L, K2S04(AR) 18. 2g/L,无水硫酸镁(AR) 7. 27g/L，KOH (AR) 4. 128g/L，甘油 40g/L, 85%H3P04 26. 7ml/LPTMl :五水硫酸铜6g/L，碘化钾0. 089g/L, 一水硫酸猛3. 0g/L,钥酸钠0. 2g/L，硼酸0. 02g/L,七水硫酸锌42. 2g/L，七水硫酸亚铁65g/L，生物素0. 2g/L，六水氯化钴0. 5g/L，硫酸5ml/L。发酵水平如下非共表达伴侣蛋白的基因工程菌原始酶活为12000U/mL ;表达伴侣蛋白Erolp的基因工程菌酶活为15000U/mL ;表达伴侣蛋白PDI的基因工程菌酶活为16000U/mL;共表达两种伴侣蛋白PDI和Erolp的基因工程菌酶活为32000U/mL。可见共表达两种伴侣蛋白显著提高了华根霉脂肪酶的活性，两个伴侣蛋白的综合使用获得了意想不到的技术效果。实施例7华根霉脂肪酶的面包烘焙中的应用小麦粉100%，食盐1%，白砂糖8%，黄油8%，酵母L 5%，水62%(以小麦粉质量计)，脂肪酶的添加量为1000U/kg。将上述原料于搅拌机中搅拌lOmin，后静置lOmin，分割成IOOg/块，搓圆，静置20min，装盘，于38°C、相对湿度85%的条件下醒发90min，烘焙15min (上火170°C、下火210°C)，添加脂肪酶后面包的比容增加了 122. 68%。实施例8脂肪酶处理造纸白水去除胶粘物质模拟抄纸循环白水系统在实验室制备机械浆白水试样。分别取一定量杨木机械浆(碱性过氧化氢机械浆，APMP)，加水浸泡，浆浓3%，搅拌一定时间后收集滤液制得一段白水；然后，另称取新浆样放入上述一段白水中浸泡，浆浓3%，搅拌一定时间后，收集得到二段白水；如此重复一次，获得三段白水，即做为实验用造纸白水试样。加入华根霉脂肪酶处理杨木白水，酶的添加量为20U/100mL白水，反应时间为I. 5h。杨木APMP白水空白样的阳离子需求量(CD)很大，为4. 445meq/L，经华根霉脂肪酶处理后⑶降低了 9. 88%。相同条件下，经诺维信脂肪酶处理后⑶降低了 9. 85%，二者效果相近。阳离子需求量造纸系统中阴离子垃圾含量一般可用阳离子需求量(cationicdemand,⑶)来表示,用颗粒电荷测定仪测定。标准阳离子滴定液为PDADMAC(polydimet hyldiallyl ammonium chloride)。实施例9脂肪酶应用于皮革脱脂脂肪酶浸水工序的工艺液比I. 5，加Na2CO3和食盐(调波美度=5，pH=9)，重组脂肪酶 O. 02%,转 30/30minX 2，杀菌剂 O. 1%，JFC O. 2%,转 30/30min,转 5/55min 至过夜，总浸水 24h。对比工艺液比I. 5，脱脂剂O. 2%，杀菌剂O. 2%，渗透剂JFC O. 3%，加Na2CO3和食盐(调波美度=5，pH=9. 5)，转30/30minX2，转5/55min至过夜，总浸水24h。由表I可见，华根霉脂肪酶的脱脂效果较脱脂剂的好，脱脂率为37. 9%，而且用脂肪酶脱脂的浸水废液Hyp浓度较小，说明废液中胶原含量低，脂肪酶对皮中胶原的损伤不大，具有良好的工业化使用前景。表I华根霉脂肪酶与脱脂剂的效果比较 WM脱脂率(％)~Hyp浓度(mg/L)~脂肪酶浸水工艺3T9IOJ 对比工艺(脱脂剂)32.711.1 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。


本发明公开了一种分泌脂肪酶的毕赤酵母共表达伴侣蛋白基因工程菌及其应用，本发明运用了分子生物学技术在表达华根霉脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌中插入两种伴侣蛋白ERO1和PDI基因。通过在两种伴侣蛋白的协同作用下，加速了外源蛋白的合成速度，从而增加了外源蛋白脂肪酶的分泌速率，其胞外酶活力达到32000U/mL；该酶在面包烘焙、造纸工业中树脂障碍控制、皮革脱脂中具有很好的应用前景。