在解脂耶氏酵母中使用啤酒糖酵母suc2基因以利用蔗糖的制作方法[0001]本专利申请要求2010年12月30日提交的美国临时申请61/428，590的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。【技术领域】。更具体地，本发明属于具有使用蔗糖作为碳源的能力的转化的解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica),其中所述转化的解脂耶氏酵母还可任选地被工程化，以产生所关注的非天然产物，例如多不饱和脂肪酸(“PUFA”)。[0003]含油酵母如解脂耶氏酵母具有使用葡萄糖作为它们的唯一碳源的天然能力；然而，这种底物并不总是成本效益最好的碳源。使用蔗糖(单独地或与其它碳源组合地)作为碳源替代葡萄糖，可由于其成本而是有利的。[0004]解脂耶氏酵母不能利用蔗糖作为碳源，因为它没有编码转化酶的基因，转化酶催化蔗糖(二糖)向单糖葡萄糖和果糖的转化。多个在先的研究者已将信号序列融合至编码转化酶的异源性基因(例如，啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae) SUC2基因)，以将酵母工程化为分泌成熟的转化酶蛋白质至周围的培养基中，然后蔗糖能够在其中被水解。[0005]一种分离自解脂耶氏酵母的人们熟知的信号序列是可诱导的碱性胞外蛋白酶(“ΑΕΡ”) (EP0220864B1 ；Davidow 等人，J.Bacteriol.，169:4621-4629 (1987) ；Matoba 等人，Mol.Cell Biol.，8:4904-4916( 1988))。AEP是由解脂耶氏酵母中的XPR2基因编码的。此外，大量被天然地分泌至细胞外。[0006]Nicaud 等人(Current Genetics, 16:253-260 (1989) ;EP0402226A1)报道了啤酒糖酵母SUC2与解脂耶氏酵母XPR2启动子及其信号序列的嵌合表达，其在解脂耶氏酵母中导致了利用蔗糖的(SUC+)表 型。具体地，来自XPR2的23个N-末端氨基酸被融合至截短的SUC2 (其中所述截短移除了全长蛋白质的前4个氨基酸)。据报道约10%的转化酶活性在培养物肉汤中被观察到(即，通过胞外分泌)，而90%的活性用全细胞被回收(即，转化酶被分泌至周质)。因此，细胞外蔗糖水解的效率是相对低的。[0007]Nicaud等人描述的方法已被其它人在他们开发用蔗糖作为碳源生产柠檬酸的转化的解脂耶氏酵母菌株的努力中使用(Wojtatowicz, Μ.等人，Pol.J.Food Nutr.Sc1.，6/47 (4):49-54 (1997) ； Forster..A.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol., 75:1409-1417(2007)；Lazar,Z.等人，Bioresour.Technol.，102:6982-6989 (2011))。上文的 Foster 等人报道，大部分(60-70%)的转化酶活性被发现在细胞表面(S卩，在全细胞中可检测的细胞绑定的活性，而30-40%的转化酶是在无细胞的培养基中可检测的；来自生物质的最大的转化酶收率是110U/g生物质干重。最近，上文的Lazar等人鉴定了包含两个拷贝的包含解脂耶氏酵母XPR2启动子及其信号序列和啤酒糖酵母SUC2的融合的解脂耶氏酵母菌株，并且证明大部分的转化酶活性与细胞相关(2568至3736U/g是细胞的)，而约232至589U/g是细胞外的(即，仅5-20%的活性是细胞外的)。[0008]因此，工程化解脂耶氏酵母为具有提高的胞外转化酶活性是合乎期望的，因为其更好地利用蔗糖作为碳源。


[0009]在一个实施例中，本发明涉及转化的解脂耶氏酵母，其包含编码具有蔗糖转化酶活性的多肽的外源性多核苷酸，其中:
[0010]a)所述多肽包含与编码成熟蔗糖转化酶的多肽序列融合的信号序列；并且
[0011]b)所述信号序列选自:
[0012](i)Xpr2前导/前体(pre/pro)-区域和N-末端Xpr2片段；和
[0013](ii)蔗糖转化酶信号序列，其中所述蔗糖转化酶信号序列的第二个氨基酸能够是任何疏水性氨基酸；并且
[0014]c)基于CLUSTALW比对方法，所述编码成熟蔗糖转化酶的多肽序列与SEQ ID NO: 4(“m-ScSUC2”)进行比较时具有至少80%的序列同一性。
[0015]优选地，上文所述的蔗糖转化酶信号序列的第二个氨基酸选自:亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。
[0016]在第二个实施例中，所述编码成熟蔗 糖转化酶的多肽序列为SEQ ID NO:4(“m-ScSUC2”)中所示的。
[0017]在第三个实施例中，所述Xpr2前导/前体-区域和N-末端Xpr2片段来自解脂耶氏酵母，并且所述蔗糖转化酶信号序列来自啤酒糖酵母。优选地，所述Xpr2前导/前体-区域和N-末端Xpr2片段包含:
[0018](i)Xpr2前导/前体-区域，其包含碱性胞外蛋白酶前体的N-末端157个氨基酸；和
[0019](ii)N-末端Xpr2片段，其包含成熟碱性胞外蛋白酶的N-末端13个氨基酸。
[0020]优选地，所述Xpr2前导/前体-区域和N-末端Xpr2片段为SEQ IDN0:10[ “XPR2PP+13”]中所示的。
[0021]在第四个实施例中，所述蔗糖转化酶信号序列为SEQ ID N0:8[“Suc2SS”]中所示的。
[0022]在第五个实施例中，所述包含与蔗糖转化酶编码序列融合的信号序列的多肽选自:SEQ ID N0:12[ “Suc2SS/m_ScSUC2” ]和 SEQ ID N0:20[ “XPR2PP+13/m_ScSUC2” ]。
[0023]在第六个实施例中，所述转化的解脂耶氏酵母能够在蔗糖为唯一碳源的条件下生长。
[0024]在第七个实施例中，所述转化的解脂耶氏酵母能够产生至少一种所关注的非天然产物。优选地，所述至少一种所关注的非天然产物选自:多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、氨基酸、维生素、留醇、类黄酮、有机酸、多元醇和羟基酯、醌衍生化合物和白藜芦醇。
[0025]在第八个实施例中，任何本发明的转化的解脂耶氏酵母在具有至少蔗糖作为碳源的培养基中生长，其中所述转化的解脂耶氏酵母能够向细胞外分泌至少80%的蔗糖转化酶。
[0026]在第九个实施例中，本发明涉及生产至少一种所关注的非天然产物的方法，所述方法包括使本发明的转化的解脂耶氏酵母在具有至少一种碳源的培养基中生长，所述碳源选自:
[0027]a)蔗糖；和
[0028]b)葡萄糖；
[0029]从而产生所述至少一种所关注的非天然产物，以及任选地，回收所述至少一种所关注的非天然产物。
[0030]优选地，所述至少一种所关注的非天然产物选自:多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、氨基酸、维生素、留醇、类黄酮、有机酸、多元醇和羟基酯、醌衍生化合物和白藜芦醇。
[0031]在第十个实施例中，所述转化的解脂耶氏酵母能够向细胞外分泌至少80%的蔗糖转化酶。
[0032]


[0033]图1提供了胞外转化酶表达构建体pYRH68 (SEQ ID NO: 13)、pYRH74 (SEQ IDN0:21)、pYRH69(SEQ ID NO: 18)和pYRH73(SEQ ID NO: 15)的图示性总结，以及当这些构建体在解脂耶氏酵母中表达时所得到的表型(即，蔗糖利用的(SUC+)或非蔗糖利用的(SUC_))。
[0034]图2A提供了啤酒糖酵母转化酶(“ScSUC2”)的N-末端部分的核苷酸和翻译的氨基酸的序列。更具体地，显示了 SEQ ID N0:2的氨基酸1-32 ;前19个氨基酸对应于本文作为Suc2SS (SEQ ID NO:8)示出的转化酶信号序列，而在空心框中显示的剩余的氨基酸代表成熟的转化酶蛋白质的N-末端，本文中命名为m-ScSUC2 (SEQ ID NO:4)。
[0035]图2B提供了由XPR2基因编码的解脂耶`氏酵母碱性胞外蛋白酶的部分的核苷酸和翻译的氨基酸序列。具体地，显示了碱性胞外蛋白酶前体(SEQ ID N0:6)的氨基酸145-192。其中，虚线框中显示的氨基酸145-157对应于Xpr2前导/前体-区域的C-末端，而氨基酸158-192对应于成熟蛋白质的N-末端Xpr2片段。带下划线的氨基酸对应于本文称为XPR2PP+13 (SEQ ID NO: 10)的Xpr2前导/前体-区域和N-末端Xpr2片段中存在的N-末端Xpr2片段的13个氨基酸。
[0036]图3提供了 pZSUC的质粒图谱。
[0037]图4提供了下列质粒的质粒图谱:(A) pYRH68和(B) pYRH70。
[0038]图5提供了下列质粒的质粒图谱:(A) pYRH73和(B) pYRH69。
[0039]图6是pYRH74的质粒图谱。
[0040]图7 显示了菌株 Y4184U+Suc2SS/m-ScSUC2
[0041]和Y4184 (对照)在葡萄糖和蔗糖培养基上的生长。
[0042]图 8 显示了 菌株 Z1978U+Suc2SS/m-ScSUC2、Z1978U+2_Suc2SS/m_ScSUC2、Z1978U+XPR2PP+13/m-ScSUC2, Z1978U+m_ScSUC2、Z1978U+XPR2PP+13/Suc2SS/m-ScSUC2 和Z1978 (对照)在包含下列的培养基上的生长:(A)葡萄糖；和化)蔗糖。
[0043]图9是pZKL3-9DP9N的质粒图谱。
[0044]下面的序列遵循37C.F.R.§ § 1.821-1.825 (“对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for Patent ApplicationsContaining Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-theSequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual PropertyOrganization) (WIPO)ST.25 标准(1998)以及 EPO 和 PCT 的序列表要求(规则 5.2 和 49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§ 1.822所示的规则。
[0045]SEQ ID NO:1至41是表I中鉴定的ORF编码基因、蛋白质(或它们的部分)、引物或质粒。
[0046]表1:核酸和蛋白质序列号简沭
[0047]