共表达伴侣蛋白的米根霉脂肪酶生产菌种制作方法_喻晓蔚专利（脂肪酶,共表达,伴侣蛋白）-早鸽网

一种共表达伴侣蛋白的米根霉脂肪酶生产菌种制作方法

专利名称

一种共表达伴侣蛋白的米根霉脂肪酶生产菌种制作方法
发明者

喻晓蔚, 徐岩, 卢鑫
公开日

2013年1月16日
申请日期

2012年7月9日
优先权日

2012年7月9日
申请人

江南大学
文档编号

C12N1/19GK102876593SQ20121023413
关键字

脂肪酶共表达伴侣蛋白根霉
权利要求

1.一种共表达伴侣蛋白的米根霉脂肪酶生产菌种，于2012年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 6124，所述菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)2.权利要求I所述的生产菌种，其特征在于其共表达伴侣蛋白EROl和PDI基因3.应用权利要求I所述的菌种应用于高效发酵生产米根霉脂肪酶
技术领域

本发明涉及一种米根霉脂肪酶的生产菌株，特别是一种通过提高分泌效率加速积累脂肪酶的基因工程菌
背景技术
具体实施例方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作材料及试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR试剂(TaKaRa宝生物公司)，弓丨物(上海赛百盛基因技术有限公司)，DS 2000DNA Ladder Maker、E5000DNA Ladder Maker、E15000DNALadder Maker (广州东盛生物科技有限公司)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒(Bioflux)，Plasmid Mini Kit I (OMEGABIO-TEK)，其余试剂均为国产或进口分析纯酵母培养基MD-Zeocin YNB0. 0134g/mL, Biotin4X 10 7g/mL, DextroseO. 02g/mL,AgarO. 02g/mL, ZeocinlOO μ g/mLMM-ZeocinYNB0. 0134g/mL, Biotin4X lCT7g/mL, MethanolO. 005g/mL, AgarO. 02g/mL, ZeocinlOO μ g/mL实施例I两种伴侣蛋白基因EROl和roi的克隆及表达载体的构建通过NCBI网站查询，获得了毕赤酵母基因组中的两种伴侣蛋白基因EROl (GenBank FN392319. I)和 PDI (GenBank AJ302014. I)的基因序列，采用化学合成的方法构建首尾相连的表达盒，连接到表达载体pPICZ上，操作过程参照Multi-CopyPichia Expression Kit, Invitrogen, Version F”,得到共表达两种伴侣蛋白的表达质粒pP ICZ-EROI-PD I ;此外，还将EROl和PDI基因分别连接到表达载体pPICZ上，得到表达伴侣蛋白Erolp的表达质粒pPICZ-EROl，以及表达伴侣蛋白PDI的表达质粒pPICZ-PDI实施例2共表达Erolp和PDI的米根霉脂肪酶基因工程菌的构建将5-101^质粒？？10241 01- 01用限制性内切酶5&1 I酶切，回收后浓缩毕赤酵母感受态细胞制备参考Invitrogen公司操作手册“Multi-Copy Pichia ExpressionKit, Invitrogen, Version F”进行将线性化质粒与80 μ L毕赤酵母感受态(发明专利ZL201010578626中公开的米根霉脂肪酶基因工程菌)混匀，转至O. 2cm电击杯中；电压1500V,电容25 μ F，电阻200 Ω，进行电击；电击完毕后，立即加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液，混匀；30°C静置Ih实施例3表达Erolp的米根霉脂肪酶基因工程菌的构建将5_1(^8质粒？？10241 01用限制性内切酶5&1 I酶切，回收后浓缩毕赤酵母感受态细胞制备参考Invitrogen公司操作手册“Multi-Copy Pichia ExpressionKit, Invitrogen, Version F”进行将线性化质粒与80 μ L毕赤酵母感受态(发明专利ZL201010578626中公开的米根霉脂肪酶基因工程菌)混匀，转至0. 2cm电击杯中；电压1500V,电容25 μ F，电阻200 Ω，进行电击；电击完毕后，立即加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液，混匀；30°C静置Ih实施例4表达roi的米根霉脂肪酶基因工程菌的构建将5-10 μ g质粒pPICZ-PDI用限制性内切酶Sal I酶切，回收后浓缩毕赤酵母感受态细胞制备参考Invitrogen公司操作手册“Multi-Copy Pichia ExpressionKit, Invitrogen, Version F”进行将线性化质粒与80 μ L毕赤酵母感受态(发明专利ZL201010578626中公开的米根霉脂肪酶基因工程菌)混匀，转至0.2cm电击杯中；电压1500V,电容25 μ F，电阻200 Ω，进行电击；电击完毕后，立即加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液，混匀；30°C静置Ih实施例5Fast-blue顶层琼脂显色法筛选基因工程菌将电转液涂布在MD-Zeocin平板上，30°C培养3天，将平板上长出的转化子复制影印到MM-Zeocin平板上,30°C培养3-4天,然后进行fast-blue顶层琼脂显色法显色具体操作如下，将Fast-blue RR染色液A液与B液混合后倾倒于MM-Zeocin平板上,于2min内观察菌落变色情况，在MD-Zeocin平板上挑取MM-Zeocin板上变色最深的克隆子Fast-blue RR 染色液配方20mg/mL乙酸萘酯溶液0. 02g乙酸萘酯溶于lmLN，N- 二甲基甲酰胺；80mg/mL fast-blue RR 溶液0. 08g 固蓝 RR 盐溶于 ImL 二甲基亚讽A液取360 μ L乙酸萘酯溶液和160 μ L fast-blue RR溶液溶于IOmL去离子水；B液取5mL去离子水(含0. 3g琼脂)，煮沸实施例6基因工程菌的发酵法表达分别挑取数个显色最深的单克隆菌种进行7L发酵罐发酵，发酵方法如下接种单克隆到YPD培养基中，摇床30°C培养18小时左右，当种子液0D600达2 5后，完成摇瓶种子液的制备然后转入7L发酵罐BSM基础盐培养基进行发酵，起始装液量为2L，在30°C、pH5. 5、溶氧50% 80%条件下进行甘油生长相培养当基础培养基中甘油消耗完，溶氧值大幅度上升，然后进入过渡相，流加50%甘油(含12mL/L PTM1)，使菌体浓度长至35 39g/L，停止甘油补加，饥饿0. 5h，然后进入诱导相，进行甲醇(每Kg甲醇含30mlPTMl)流加，温度控制于26 28°C在甲醇诱导表达阶段，采用溶氧两段式控制策略，甲醇流加启动后，控制溶氧为初始溶氧值40°/Γ50%，当菌体浓度达到10(Tll0g/L，适当限制溶氧于10°/Γ20%，整个诱导表达过程中，甲醇浓度维持于0. 08、. 12%

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法律状态

专利名称：一种共表达伴侣蛋白的米根霉脂肪酶生产菌种的制作方法脂肪酶又称三酰基甘油水解酶(EC3. I. I. 3)是一种广泛应用的水解酶类，能够在水不溶性的底物酯和水的界面催化反应水解底物酯键。微生物脂肪酶被广泛应用于很多工业，如油脂工业、制药工业、食品工业和饲料工业等。但是，所有这些工业化应用能否成功的关键因素之一就是脂肪酶的闻水平表达。喻晓蔚等发明设计的中国专利(专利授权号ZL201010578626),公开了一种高产米根霉脂肪酶的基因工程菌和构建方法。为了进一步满足工业化生产米根霉脂肪酶的需求和进一步挖掘毕赤酵母表达米根霉脂肪酶的潜力，本发明欲采用共表达伴侣蛋白的策略加强胞内内质网中外源蛋白的合成速率以进一步提高米根霉脂肪酶的表达水平。通过米根霉脂肪酶的结构中存在三对二硫键。分子伴侣能够帮助蛋白质的正确折叠或纠正蛋白质的错误折叠，降低酶蛋白因错误折叠的降解率，伴侣分子不参与蛋白质的最终组成。在酵母中二硫键形成需要内质网氧化还原蛋白Erolp和蛋白质二硫键异构酶PDI协调作用，通过PDI来介导氧化平衡物从Erolp传递到折叠底物，这种氧化平衡物动态穿梭能促进内质网内快速完成二硫键形成，减少或重排错误二硫键链接。通过共表达伴侣蛋白能够促进某些蛋白的表达。针对米根霉脂肪酶富含二硫键这一特征，本发明拟采用共表达两种伴侣蛋白的策略，进一步加强胞内内质网中外源蛋白的折置速率，从而提闻脂肪酶的表达量。分子伴侣的概念早在1978年已被Laskey等人提出，它以其能够帮助蛋白质正确折叠、降低蛋白错误折叠和提高外源蛋白表达量的能力逐渐被人关注。国内外大多数研究主要集中于添加一种伴侣蛋白如PDI等提高外源蛋白的表达量及生物活性。有学者利用基因工程手段增加内质网内分子伴侣Kar2p (结合蛋白)和蛋白质二硫键异构酶(proteindisukfide isomerase,F1DI)的量,使得β -葡萄糖苷酶在酿酒酵母中的表达量提高了 60%;Damasceno等在毕赤酵母中表达Α33单链抗体(A33scFv)的同时，高效共表达免疫球重链结合蛋白质Bip，结果使得A33scFv表达分泌量提高了两倍左右。但是上述研究均忽视了内质网中催化蛋白质氧化折叠中蛋白质的相互联系，仅共表达其中一种伴侣蛋白，而本研究正是在对内质网中Erolp介导的氧化折叠模型细致分析的基础上，提出了共表达Ει·ο1ρ和PDI两种伴侣蛋白，从而显著提高了脂肪酶的表达量。
本发明要解决的技术问题是提供一种在毕赤酵母(P. pastoris GS115)中能够加速折叠分泌表达米根霉脂肪酶的基因工程菌法，以期运用该高产工程菌大规模的发酵生产米根霉脂肪酶。本发明提供的巴斯德毕赤酵母基因工程菌(Pichia pastoris),于2012年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 6124。脂肪酶的活性测定方法橄榄油指示剂滴定法参考国家标准GBT23535-2009脂肪酶制剂酶活在40°C、pH8. O条件下，Imin水解底物产生I μ mo I可滴定脂肪酸所需要的酶量(U/mL)。共表达两种伴侣蛋白与分别共表达Erolp或者PDI —种伴侣蛋白进行对比研究，非共表达伴侣蛋白的基因工程菌原始酶活为7062. 5U/mL ;共表达伴侣蛋白Erolp的基因工程菌酶活为8500U/mL ;共表达伴侣蛋白PDI的基因工程菌酶活为9000U/mL;共表达两种伴侣蛋白PDI和Erolp的基因工程菌酶活为16000U/mL。可见共表达两种伴侣蛋白显著提高了米根霉脂肪酶的活性。本发明是利用毕赤酵母真核表达系统来生产米根霉脂肪酶，其表达量极高并可分泌到胞外。本发明的脂肪酶高产菌株的产量达到16000U/mL，远远高于国内外报道的米根霉脂肪酶的产量。并且国内外尚无报道利用伴侣蛋白EROlp和PDI两者的协同作用提高外源蛋白在毕赤酵母GS115中的表达水平。涉及的培养基YPD :蛋白粉20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/LBSM CaS04(cp) I. lg/L, K2S04(AR) 18. 2g/L,无水硫酸镁(AR) 7. 27g/L，KOH (AR) 4. 128g/L，甘油 40g/L，85%Η3Ρ0426· 7ml/LPTMl :五水硫酸铜6g/L，碘化钾O. 089g/L, 一水硫酸猛3. Og/L,钥酸钠O. 2g/L，硼酸O. 02g/L,七水硫酸锌42. 2g/L，七水硫酸亚铁65g/L，生物素O. 2g/L，六水氯化钴O. 5g/L，硫酸5ml/L。发酵水平如下非共表达伴侣蛋白的基因工程菌原始酶活为7062. 5U/mL ;共表达伴侣蛋白Erolp的基因工程菌酶活为8500U/mL ;共表达伴侣蛋白PDI的基因工程菌酶活为9000U/mL;共表达两种伴侣蛋白PDI和Erolp的基因工程菌酶活为16000U/mL。可见共表达两种伴侣蛋白显著提高了米根霉脂肪酶的活性，酶活提高了一倍，取得了意想不到的·技术效果。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

本发明公开了一种共表达伴侣蛋白的米根霉脂肪酶生产菌种，本发明运用了分子生物学技术在表达米根霉脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌中插入两种伴侣蛋白ERO1和PDI基因。通过在两种伴侣蛋白的协同作用下，加速了外源蛋白的合成速度，从而增加了外源蛋白脂肪酶的分泌速率，其胞外酶活力达到16000U/mL。

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