专利名称：粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法稻谷、小麦是人类主要食物资源，在加工过程中会产生大量的副产品一一胚芽、麸皮、糠等，这些副产物含有丰富的营养物质，同时也富含脂肪酶、脂肪氧化酶等，在酶的催化作用下这些副产物很容易水解酸败，因而目前主要作为饲料出售，附加值较低。为了充分利用粮食资源，需要对粮食及其加工副产物的品质进行酶的钝化处理， 其中脂肪酶活力的准确测定是制定稳定化处理工艺的基础。谷物脂肪酶的活力测定一般分为三个步骤首先是从谷物中提取脂肪酶；然后往酶提取液中加入底物并均质化，培育游离脂肪酸；最后对生成的游离脂肪酸进行检测，求出酶活力。即先进行脂肪酶的提取与纯化，再将酶与底物的混合培育脂肪酸，最后进行脂肪酸的测定。人们已经开发了一系列谷物游离脂肪酸的测定方法，如滴定法、比色法和色谱法等，其中最为常用的是滴定法和比色法。比色法测定快速、灵敏度高且仪器价格便宜，受到人们青睐，尤其是铜皂比色法常用于测定样品中游离脂肪酸含量。迄今，该方法已历经了数次创新，Baker利用5%醋酸铜试剂与谷物中脂肪酸反应生成铜皂，通过吸光值求得谷物中游离脂肪酸含量；Dimcombe使用 Cu(NO3) ·3Η20和三乙醇胺为铜试剂和显色试剂；Lowry等使用乙酸铜一吡啶作为铜试剂，省去了显色试剂；Kwon等人用异辛烷取代苯提取游离脂肪酸，改进后的方法省去了溶剂蒸发步骤，简化了测定过程。综上，铜皂比色法用于粮食游离脂肪酸的测定已发展得较为成熟，但该法用于谷物脂肪酶活力的测定尚有两大限制因素。首先是谷物脂肪酶的提取与纯化过程繁琐；其次脂肪酶水溶液与水不溶性底物难以混合均勻。脂肪酶只能在油水接触面上起作用，水不溶性底物(如橄榄油)与酶液在混合反应时，由于均质条件的差异，其形成的乳化液往往不稳定，且乳液颗粒大小也不均衡，造成测定结果重现性差。2003年，Goffman等人先用磷酸盐缓冲溶液浸提米糠脂肪酶，然后将粗酶液加入橄榄油乳化液中培养18h，再用铜皂比色法测定脂肪酶活力。该法虽省去了脂肪酶的纯化步骤，但其培养时间过长，不能适应脂肪酶活力快速测定的要求。2003年，F. EI Amrani等发明了一种低水分体系下测定脂肪酶活度的方法，具体步骤如下图。该法将待测样品粉碎后，再与橄榄油混合，培养一段时间，然后采用滴定法测定游历脂肪酸含量。该法虽不用提取脂肪酶，但存在两个缺点培养时间72h，太费时，如此长时间的主要目的是为了产生足够数量的游离脂肪酸，这是因为电位滴定测定游离脂肪酸的灵敏度低(相对于铜皂比色法)；其二需要用到恒PH自动电位滴定仪(目前国内还没有厂家生产该类仪器，需进口)。粮食中游离脂肪酸是有机弱酸的混合物，其滴定终点突变不明显，同时在粮食游离脂肪酸提取过程中，部分色素进入提取液，进一步增加了终点判断的难度，使得个体间终点判断差异增大。该法通过精密电位滴定仪准确判定终点或色谱法，但仪器都比较昂贵。2006年，Devin等人发明了一种低水分体系下测定小麦和麸皮中脂肪酶活度的方法。该法无需提取及纯化脂肪酶，直接往脱脂小麦麸皮中加入水和底物，经过一段时间培养之后，通过铜皂比色法测定游离脂肪酸含量来计算脂肪酶活力。Devin的方法仅探讨了水和橄榄油添加量对小麦脂肪酶活力的影响，但未说明以下问题其一，Devin在测定麦麸脂肪酶活力时，其原始水分为15%，在此基础上实验得出优化的加水量，而原始含水量不同的谷物，该研究获得的绝对加水量便失去了参考价值；其二，样品、水和橄榄油三者混合程度对测定结果的重现性的影响极大，因为加入到待测样品中的水和橄榄油量相对很少，若采用常规方法难以充分混勻，这样会导致检测结果重现性差。而如何将样品、水和橄榄油有效混勻，研究人员没有明确指出。
为了克服现有方法在测定谷物脂肪酶活力时，脂肪酶的提取与纯化过程繁琐，测定体系内各组分混合不勻导致结果重现性差，无法适应不同原始含水量的样品，耗时长等缺陷，本发明立足于水分活度这个对酶活力起重要作用的影响因子，提供一种在低水分体系下快速测定谷物脂肪酶活力的方法，可推广到粮食加工企业与储藏企业，用于粮食加工及其副产物品质的实时评估。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是首先将粮食及其加工副产物等待测样品用有机溶剂进行部分脱脂，并根据其原始水分含量大小加入适量蒸馏水(或30°c以下低温烘干)，调节至一定水分活度，然后往其中加入适量橄榄油，并混合均勻，培养一段时间后，最后由铜皂比色法测定其增加的游离脂肪酸量，换算得到粮食及其加工副产物中脂肪酶的活力。本发明的方法具体按照下述步骤进行(1)待测粮食及其加工副产物样品经粉碎后，过30目筛，取筛下物，加入5 10倍体积的有机溶剂置于气浴摇床中，以100 250rpm振荡脱脂20 120min ；(2)倾斜倒出脱脂的溶酶后，将样品置于烘箱中，20 60°C热风烘干0.5 池去除残余溶酶，取出放入干燥器中；(3)称取步骤2干燥后的样品适量，分别置于两试管中，一只空白Ai,另一只为Af，往每只试管中分别加入0 2. 5倍质量的蒸馏水(或30°C以下低温烘干0. 5 他)，调节其水分活度为0. 6 0. 9，优选0. 7 0. 8 ；再加入0. 2 2. 5倍质量的橄榄油，将三者充分搅拌均勻；(4)取步骤3空白管Ai中的试样，立即加入广10倍体积的有机溶剂，涡旋振荡30秒， 然后5000rpm离心3min，上清液倒入圆底烧瓶中，反复提取2 3次；
(5)取步骤3样品管Af中的试样，25 75°C下，优选30 55°C，培养1 他，优选2 4h后，取出，加入1 10倍体积的有机溶剂，振荡30秒，然后5000rpm转速下离心3min，上清液倒入圆底烧瓶中，反复提取2 3次；
(6)将步骤4、5得到的提取液在40°C以下减压蒸发，除去有机溶剂。剩余固形物溶于0. 5 3倍样品质量的异辛烷后，加入1 2倍异辛烷体积的5%醋酸铜溶液(用吡啶调节其至pH5. 5 6. 5)，振荡lmin，4000rpm离心2 lOmin，获得有机相与水相；
(7)经过步骤(6)获得的有机相，在715nm下测其吸光度值，试样吸光值与油酸异辛烷标准溶液的吸光值做比较；
(8)将步骤(7)中得到的吸光度值，代入下式计算脂肪酶活力


本发明涉及一种稻米、小麦及其加工副产物中脂肪酶活力的快速检测方法，涉及粮食精深加工领域。首先将米糠等待测样品进行部分脱脂，并根据其原始水分含量大小加入适量蒸馏水、调节至一定水分活度，然后往其中加入适量橄榄油，培养一段时间，最后由铜皂比色法测定其增加的游离脂肪酸量，换算得到米糠脂肪酶活力。该方法省去了脂肪酶的提取及纯化步骤，操作简便，结果准确，可广泛应用于粮食加工企业、仓储企业及粮油检测机构的粮油品质检验与控制。