专利名称：脂肪酶smg1在单脂肪酸甘油酯制备中的应用的制作方法单脂肪酸甘油酯(简称单甘酯)，英文名monoglyceride，是一类重要的非离子型表面活性剂，一个亲油的长链烷基和两个亲水的羟基使单甘酯具有良好的表面活性。单甘酯被作为乳化剂广泛应用于食品和乳制品工 业中，作为组织改良剂应用于化妆品、牙膏和护发素等日用化学品中，还可作为防冻剂用于面包制作中。近年发现，单不饱和脂肪酸甘油酯可望进人化学保鲜剂行列。此外，单甘酯在医药、化妆品、塑料、纺织和高分子加工等行业中也有着重要的应用，如含有多不饱和脂肪酸(CLA、EPA、DHA)的单甘醋对心血管疾病具有预防作用。目前，单甘酯的合成方法有很多，在工业上应用最广泛的方法是化学催化法合成单甘脂，主要采用甘油醇解法和直接酯化法，目前已经广泛用于饱和脂肪酸单甘脂的生产。生物酶法合成单甘脂是一种新的工艺方法，其具有催化条件温和、绿色无污染的特点。专利CN200710055632. 8公开了一种固定化脂肪酸催化合成a -亚麻酸单甘酯的方法，该方法采用经特定工艺固定化的假丝酵母脂肪酶和铜绿假单胞菌脂肪酸为催化剂。脂肪酶均具有合成单甘酯的能力，常见的商品化的脂肪酶通常包括来源于根酶属、曲霉属、毛酶属、细菌和酵母菌来源的微生物脂肪酶、胰脂肪酶或酯酶。但是绝大多数脂肪酶催化合成不饱和脂肪酸单甘酯的过程中都伴随有大量的甘油二酯和甘油三酯的产生，影响产品的分离和纯度。
本发明目的在于提供一种脂肪酶SMGl在单脂肪酸甘油酯制备中的应用，生成更高纯度的单甘脂。本发明方法采用对单甘酯和甘油二酯具有很强水解活性，但是对甘油三酯不具有水解活性的脂肪酶为催化剂，催化脂肪酸和甘油酯化，可以生成更高纯度的单甘脂。本发明者进行了深入研究,意外地发现,来源于ifeJaMezia WoAiasa的SMGl (对应的DNA序列见GenBank登陆号DD210404)是一种选择性水解偏甘油酯的脂肪酶，即对单甘酯和甘油二酯具有很强水解活性，但是对甘油三酯不具有水解活性。利用该脂肪酶的特殊性质，可以催化脂肪酸和甘油合成高纯度的单甘脂。本发明目的通过以下技术方案来实现。脂肪酶SMGl在单脂肪酸甘油酯制备中的应用，编码所述脂肪酶SMGl的DNA序列的 GenBank 登陆号为 DD210404。具有所述脂肪酶SMGl活性的蛋白质,其氣基酸序列如SEQ ID N0:19所不。所述单脂肪酸甘油酯制备，具体包括以下步骤(1)在无溶剂体系中，将甘油、月旨肪酸供体和脂肪酶SMGl混合均匀，反应温度为5 50°C，反应2 48h ;每克反应底物的脂肪酶SMGl的加入量是50U/g 500U/g ；(2)反应产物经蒸馏获得单脂肪酸甘油脂。所述反应底物中的含水量是i°/rio%。所述反应温度为24 15°C。所述甘油与脂肪酸供体的摩尔比为1:广1:5。所述脂肪酸供体选自碳原子数为C2 C22的脂肪酸中的一种或两种以上的混合物。所述脂肪酶SMGl是通过克隆来源于JfeJa1S1Sezia的基因序列，并在毕赤酵母X33中的表达得到的，所述基因序列的Gen Bank登陆号为DD210404。所述蒸馏采用3段蒸馏，第一级温度为8(TlO(rC ;第二级温度为150 180°C ;第三级温度为190 220°C。所述脂肪酶SMGl的活力是橄榄油水解活力； 上述脂肪酶的活力测定采用碱滴定法。脂肪酶酶活力单位定义为每分钟释放出Iumol脂肪酸的酶量定义为I个脂肪酶活力单位(U)。具体方法为取三个100 mL锥形瓶，分别向空白瓶A和样品瓶B、C中，各加入橄榄油乳化液4 mL和PH6. 0的磷酸缓冲溶液5mL，再向A瓶中加入95 %乙醇15 mL，于恒温槽中20°C水浴预热5 min。将一定质量的酶制剂溶解在缓冲液中配成酶液，分别向三个瓶中各加入待测酶液ImL (由于空白瓶中预先加入了乙醇，酶液加入后脂肪酶将立即失活)，立即混匀计时，在预热温度下反应10 min后，向样品瓶中加入15mL 95%乙醇终止反应。向三个锥形瓶中各滴加3 5滴酚酞作为指示剂，用0. 05mol/L的NaOH标准溶液滴定水解产生的游离脂肪酸。上述脂肪酶催化反应中，脂肪酶SMGl可以是酶粉，也可以是固定化的。研究表明，无机类载体固定化ifeJaMezia globosa脂肪酶具有较好的表观活性,在无溶剂体系中,催化甘油和脂肪酸供体反应后，单甘酯含量可达70%以上。固定化脂肪酶可重复使用多次，具有较好的稳定性。一般情况下，优选添加基于脂肪酸供体质量240U/g 320U/g的脂肪酶，可以使得酯化反应可以在24h内达到平衡，减少生产成本。上述脂肪酶催化反应中，更适合的温度为5 15°C。在无溶剂反应体系中，通过控制反应体系在较低的温度下，可以使得首先生成的单甘酯在低温下凝固，从而很难参与甘油二酯的合成，这样有利于单甘酯的积累。当温度超过15°C时，生成的单甘酯逐渐会向甘油二酯转化，影响产物的纯度；当温度超过35°C时，会导致该脂肪酶活性的减弱。上述脂肪酶催化反应中，更适合的甘油和脂肪酸供体的摩尔比是1: 3 1: 5。当甘油和脂肪酸供体的摩尔比小于1:5时，随着甘油量的增加，反应的酯化速率也随之增大，之后再增加甘油量对酯化率的贡献不大。由于甘油量的增加会提高生产成本，故而需要根据实际的反应情况选择甘油和脂肪酸供体的摩尔比。上述脂肪酶催化反应中，更适合的加水量是基于脂肪酸供体质量19T5%的水分。因为微量的水分是保证脂肪酶活性所必需，但不宜超过5%，过量的水会导致酶中心内部水簇的生成，改变酶的活性结构，使酶活性降低。然而反应中会伴随水的产生，水积累还会促使反应向生产甘油二酯的方向进行，不利于单甘酯的生成，所以要不断除去反应过程中生成的水。脱水方式优选采用真空脱水，脱水属于常规的操作，具体操作条件不作限定，如，可以在反应流程中安装薄膜蒸发器或喷雾蒸发器用于脱水。上述脂肪酶催化反应完成后，生成的产物包括甘油二酯、脂肪酸、单甘酯和少量甘油，需要经过步骤(2)对步骤(I)中酯化产物进行分离，单甘酯的分离一般采用分子蒸馏或短程蒸馏，蒸馏的一般流程分为3段蒸馏，第一级脱气和脱水，温度一般为8(T10(TC左右；第二级脱除大部分脂肪酸和甘油，温度一般为150 180°C ;第三级分离出单甘酯，温度一般为190 220°C。分离完成后单甘酯的含量可达80%以上，回收率在60% 80%。尽管本处给出了一般的操作参数，实际实施时的蒸馏操作可不受本描述的限制。根据实际需要，可以增加分子蒸馏的级数，根据真空度的大小，可以灵活调整蒸馏温度。产物中单甘酯的纯度可以通过HPLC检测。上述脂肪酶催化反应中，脂肪酸供体为具有C2 C22个碳原子的脂肪酸中的一种或一种以上的混合物。本发明相对于现有技术所具有的优点 及有益效果。( I)采用脂肪酶作为催化剂，条件温和，易于实现，相对于化学合成法，更环保、节倉泛。(2)采用来源于JfeJa1S1Sezia globosa脂肪酶SMGl作为生物催化剂,制备单脂肪酸甘油酯，酯化能力强，产物组分单一，易于分离。(3)采用脂肪酶SMGl在低温下催化合成的单脂肪酸甘油酯，生成产物颜色浅、得率高。毕赤酵母X33购买于invitrogen公司，载体pGAPZ a A购买于invitrogen公司，载体pBluescript购买于stratagene公司，可以在代理商广州英韦创津生物科技有限公司购买的到。 Malassezia WoAiosa脂肪酶SMGl的制备方法采用现有技术已经公开的方法,例如文献“优化毕赤酵母X33重组表达球形马拉色菌脂肪酶LIP1”报道的方法。iWassezia脂肪酶SMGl基因去信号肽后通过两步重叠PCR法获得。利用DNAworks把基因拆分为18条引物(序列如SEQ ID N0:1 SEQ ID N0:18所示)，前面8段和后面10段分别合成大片段，最后两条大片段合成全长基因。把它克隆到pBluescript载体，得到pBluescript-SMGl，测序验证碱基序列，突变位点利用定点覆盖PCR法进行修复。序列正确的基因克隆到毕赤酵母穿梭表达载体pGAPZ a A上，得到pGAPZ a A-SMGl。质粒pGAPZ a A- SMGI经过限制性内切酶AvrII线性化之后，电击转化pichiapas tor is X33。挑取阳性克隆接到 3ml YPD (含 100 u g/ml Zeocin)中，在 30°C，200rpm条件下培养24h，然后接种到100ml YPD中，相同条件下培养72h。发酵液经4°C，12，OOOrpm离心4min去除酵母细胞。发酵液经浓缩冻干即得到SMGl脂肪酶。得到的脂肪酶SMGl氨基酸序列如SEQ ID NO 19所示。实施例I 将摩尔比为1:5的共轭亚油酸(CLA)和甘油，以及基于反应底物总质量1%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为400rpm的磁力搅拌器上反应，加入基于反应底物总质量320U/g的脂肪酶SMGl，通过培养箱控制在5°C下反应24h。反应结束后，反应产物进行分子蒸馏分离除去其中的脂肪酸和甘油二酯得到以单甘酯为主要成分的产物。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例2
采用加酶量为500U/g，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例3
采用摩尔比为1:3的共轭亚油酸(C LA)和甘油，采用加酶量为50U/g，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例4
采用摩尔比为1:1的共轭亚油酸(CLA)和甘油，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例5
采用加水量为5%，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例6
采用加水量为10%，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例7
采用反应温度为15°C，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例8
采用反应温度为50°C，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例9
采用反应时间为48h，其余操作条件同实施例I。反应产物组成、分子蒸馏后的MAG纯度和回收率见表I和表2。实施例10
将摩尔比为1:5的丁酸和甘油，以及基于反应底物总质量1%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为400rpm的磁力搅拌器上反应，加入基于反应底物总质量320U/g的脂肪酶SMGl，通过培养箱控制在5°C下反应。反应24h后，CLA的转化率达到了 85. 9%，其中MAG占73. 1%。分子蒸馏后得到的MAG纯度和回收率分别为80. 1%和72. 3%。实施例11
将摩尔比为1:5的油酸和甘油，以及基于反应底物总质量1%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为400rpm的磁力搅拌器上反应，加入基于反应底物总质量320U/g的脂肪酶SMGl，通过培养箱控制在5°C下反应。反应24h后，CLA的转化率达到了 88. 3%，其中MAG占76. 7%。分子蒸馏后得到的MAG纯度和回收率分别为81. 3%和71. 4%。实施例12
将摩尔比为1:5的共轭亚油酸(CLA)和甘油，以及基于反应底物总质量1%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为400rpm的磁力搅拌器上反应，加入基于反应底物总质量320U/g的脂肪酶SMGl，通过培养箱控制在15°C下反应，反应过程中不断抽真空。24h后，CLA的转化率达到了 86. 4%，其中MAG占75. 8%。分子蒸馏后得到的MAG纯度和回收率分别为80. 5%和68. 4%o实施例13
采用无机类载体固定化后的脂肪酶SMGl进行反应，将摩尔比为1:5的共轭亚油酸(CLA)和甘油，以及基于反应底物总质量1%的水，装入具塞三角瓶中混合均匀，并置于转速为400rpm的磁力搅拌器上反应，加入基于反应底物总质量320U/g的固定化脂肪酶SMGl，通过培养箱控制在5°C下反应。24h后，C LA的转化率达到了 80. 2%，其中MAG占73. 8%。分子蒸馏后得到的MAG纯度和回收率分别为80. 8%和67. 6%。表I


本发明涉及脂肪酶SMG1在单脂肪酸甘油酯制备中的应用，包括以下步骤(1)将甘油、脂肪酸供体，采用一种来源于Malasseziaglobosa偏甘油酯水解酶SMG1作催化剂，添加1%~5%的水，5～15℃催化甘油和脂肪酸供体反应；(2)分离，将(1)得到的产物除去脂肪酶、甘油，再分离除去甘油二酯、脂肪酸后，得到单脂肪酸甘油酯。本发明采用甘油和脂肪酸供体作原料，通过脂肪酶SMG1低温下催化甘油和脂肪酸供体的酯化反应生产单脂肪酸甘油酯，生成产物中副产物少、颜色浅、得率高。