专利名称：一种脂肪酶高产菌的筛选方法脂肪酶即三酰甘油酰基水解酶，它催化底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶被广泛应用于食品加工及风味改革中。乳脂肪(稀奶油、奶油、黄油或无水奶油等)是乳品风味的重要来源，乳脂肪在乳制品风味形成过程中所起的作用是其他脂肪所无法替代的。乳脂肪是迄今为止已知的组成和结构最复杂的脂质，乳脂的风味很难用化学合成的物质模拟。由不同方法制得的风味物质的组分差别很大，其中由乳脂肪酶解后制备的风味物质香气自然、柔和，留香持久，对加 香产品的内在品质有明显的改善和提升，能够赋予加香产品天然的乳品香气。因而，越来越多的人们开始关注乳脂肪来源的风味添加剂。乳脂肪中的脂肪酸甘油三酯等被酶解成饱和及不饱和脂肪酸、酮酸等风味物质和风味物质前体，可作为天然来源的风味物质，应用于焙烤食品、乳制品、糖果等食品中，以达到增强产品的奶油、乳酪等香气、标准化不同生产批次广品的感官特性等效果。脂肪酶种类繁多，广泛存在于动植物和微生物体内，尤以在微生物界种类更丰富。脂肪酶的作用具有底物专一性，不同来源的脂肪酶具有不同的催化特性。因此，针对不同的应用目的需要使用不同的脂肪酶。目前国内还没有关于以食品作为脂肪酶产生菌筛选源的报道，更没有以自筛菌所产脂肪酶用于酶解乳脂肪后增强乳品香气的相关报道。
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种所产生的脂肪酶酶解乳脂肪后的产物可以用于增香的脂肪酶高产菌的筛选方法，特别提供了一种将食品作为脂肪酶高产菌的筛选源的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的—种脂肪酶高产菌的筛选方法，包括如下步骤(I)将筛选源样品添加到富集培养基中进行富集培养，得到富集培养液；所述的筛选源样品选自天然干酪、巴氏稀奶油和黄油中的任一种或多种；(2)用无菌水稀释富集培养液，先通过选择性平板培养基筛选产脂肪酶的菌，挑取带有荧光圈的单菌落，然后通过纯化培养获得纯化菌株；(3)将筛选出的纯化菌株在产酶培养基中培养并收获培养产物；(4)离心培养产物，收集含脂肪酶的上清液；(5)将含脂肪酶的上清液进行酶活检测，对酶活力高的菌株进行风味验证后获得目标菌株。本发明中，步骤(I)是将筛选源样品添加到富集培养基中进行富集培养，得到富集培养液；所述的筛选源样品选自天然干酪、巴氏稀奶油和黄油中的任一种或多种。其中，所述的筛选源样品为高脂乳品，可以选自天然干酪、巴氏稀奶油和黄油中的任一种或多种，优选天然干酪。所述的天然干酪为除霉菌干酪和酵母干酪之外的天然干酪，优选切达干酪、大孔干酪、帕莫森干酪、黄波干酪、奶油干酪和古老耶干酪中的任一种或多种。较佳地，所述天然干酪的脂肪含量为10 45%;更佳地，所述天然干酪的脂肪含量为28 45%，成熟期在I个月以上。所述筛选源样品若为固态，则在添加到富集培养基中之前还需将样品切成小丁，置于无菌水中震荡溶解。在自然界中，细菌都是混杂生长在一起的。从自然界特定的筛选源中筛选分离具有某些特性的微生物已有较常规的方法和步骤，通常都需要先进行富集培养。富集培养基的基本构成需求是，能够诱导生长某种特性的菌，同时最大限度抑制其他菌的生长。现有的中、英文文献披露了在筛选脂肪酶高产菌时，由于几乎全部是用于生物柴油方向，因此，培养基中的油脂几乎都采用橄榄油，个别采用其他植物油。而本发明的最终作用底物是乳脂肪，鉴于乳脂肪和植物脂肪结构的差异性、以及脂肪酶的底物专一特性，本发明特将培养基中的油脂改为稀奶油。至于培养基中的碳源、氮源、无机盐，则是常规使用的、能保证菌体生长的最少量物质。 本发明中，步骤(I)所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②无机盐和③乳化稀奶油。所述的无机盐为常规，较佳地选自氯化钠、氯化钙、硫酸镁和磷酸氢二钾中的任一种或多种。较佳地，所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨0. 2 0. 8%，②酵母浸膏0 0. 8%，③氯化钠0 0. 05%，④氯化钙0 0. 01%和⑤乳化稀奶油2. 5 3. 75%，上述各组分的百分比均为质量百分比。更佳地，所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨0. 5%，②酵母浸膏0. 5%，③氯化钠0.05%，④氯化钙0. 005%和⑤乳化稀奶油2.5%，上述各组分的百分比均为质量百分比。所述乳化稀奶油是用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得。所述富集培养的方法为常规，较佳地是在23 28°C、150 250rpm条件下，摇床培养48 72小时。本发明中，步骤(2)是用无菌水稀释富集培养液，先通过选择性平板培养基筛选产脂肪酶的菌，然后通过纯化培养获得纯化菌株。所述的选择性平板培养基为罗丹明选择性平板培养基，包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②乳化稀奶油，③凝固剂和④罗丹明。较佳地，所述的选择性平板培养基包括下列各组分①牛肉膏0 0. 8 %，②蛋白胨0. 2 0. 8 %，③乳化稀奶油2. 5 3. 75 %，④琼脂L 0 1.75%和⑤罗丹明0. 04 0. 06%，上述各组分的百分比均为质量百分比。更佳地，所述的选择性平板培养基包括下列各组分①牛肉膏0.5%，②蛋白胨0.5%，③乳化稀奶油2.5%，④琼脂I. 5%和⑤罗丹明0. 05%，上述各组分的百分比均为质量百分比。所述乳化稀奶油是用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得。所述筛选的方法为用无菌水将步骤(I)制得的富集培养液稀释成各浓度梯度，取一定量均匀涂布于选择性平板培养基上后培养48 72小时，培养温度为23 28°C ;较佳地，所述筛选的方法为用无菌水将步骤(I)制得的富集培养液富集培养液稀释105、106、107、108倍至各浓度梯度，分别取100 u I均匀涂布于选择性平板培养基，23 28°C培养48 72小时。所述纯化培养的方法为常规，只要能够培养得到纯化菌株即可，较佳地是采用PDA平板培养基、YPD平板培养基、麦芽汁培养基和察氏培养基中的任一种对产脂肪酶的菌进行纯化培养，获得纯化菌株。本发明中，步骤(3)是将筛选出的纯化菌株在产酶培养基中培养并收获培养产物。所述的产酶培养基包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖中的任一种或多种，③无机盐和④乳化稀奶油。所述的无机盐为常规，较佳地选自氯化钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钾中的任一种或多种。较佳地，所述的产酶培养基包括下列各组分①蛋白胨0. 2 0. 8 %，②酵母浸膏0. 2 0. 8 %，③氯化钠0. 05 0. 5 %，④可溶性淀粉0. 05 0. I %，⑤磷酸氢二钾0. 05 0. 25 %和⑥乳化稀奶油2. 5 3. 75%，上述各组分的百分比均为质量百分比。更佳地，所述的产酶培养基包括下列各组分①蛋白胨0.5%，②酵母浸膏0. 15%，③氯化钠0.5%，④可溶性淀粉0. 1%,⑤磷酸氢二钾0. 25%和⑥乳化稀奶油2. 5%，上述各组分的百分比均为质量百分比。所述乳化稀奶油是用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得。所述的培养方法为常规，较佳地是在23 28°C、150 250rpm条件下，摇床培养48 72小时。本发明中，步骤(4)是离心培养产物，收集含脂肪酶的上清液。所述收获脂肪酶的方法为常规，较佳地是将步骤(3)的培养产物在8000 20000rpm、10 15min的条件下进行离心，收集上清液，更佳地是将步骤(3)的培养产物在10000rpm、10min的条件下进行离心,收集上清液。本发明中，步骤(5)是将含脂肪酶的上清液进行酶活检测，对酶活力高的菌株进行风味验证后获得目标菌株。所述的酶活检测方法为常规，较佳地是采用三丁酸甘油酯法和滴定法对步骤(4)所收获的脂肪酶进行酶活测定。所述风味验证的方法包括如下操作步骤①将酶活较高的菌株接种至灭菌稀奶油中并在23 28°C、150 250rpm条件下，摇床培养48 72小时将发酵稀奶油进行灭酶处理将②中制得的酶解产物加入至脱脂奶中，经过搅拌、均质、杀菌和冷却后，品尝风味改变方向和改变程度，从而选择最终的目标菌。其中，较佳地，②是将发酵稀奶油在80 95°C下保温5 30min，进行灭酶处理；③是将②中制得的酶解产物以0.5 1% (v/v)的添加量，加入至90%的脱脂奶中，经过搅拌、均质、杀菌和冷却后，品尝风味改变方向和改变程度，选择令人愉悦的、明显提高了乳品相关风味的发酵菌株作为本发明最终的目标菌。因此，本发明的积极进步效果在于I、提供了一种筛选分解乳脂肪活力高的脂肪酶高产菌的方法；2、拓展了脂肪酶高产菌的筛选源，特别是将某些食品作为脂肪酶高产菌的筛选源属于首创；3、将分解乳脂肪活力高、且酶解产物风味独特的脂肪酶，用于乳品、烘焙食品、糖果等产品中增强奶油、乳酪等相关香气，从而扩宽了脂肪酶的应用领域、提高了脂肪酶产生菌的价值；4、为工业微生物的开发，特别是为工业化生产脂肪酶提供了新的菌种来源。5、为拥有自主知识产权的脂肪酶奠定了基础。下面用实施例来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中，所用原料的来源为稀奶油、黄油、90%脱脂奶光明乳业股份有限公司乳品二厂；商品化脂肪酶帝斯曼(中国)有限公司；其余均为市售获得。实施例I :从天然干酪(除以酵母、霉菌为发酵剂以外的干酪)里筛选对乳脂专一性强的脂肪酶高产菌I、目标菌的富集 以成熟期半年以上的切达干酪、大孔干酪、帕莫森干酪为样品，分别取样，切成0. 5cm3的小丁，置于无菌水中剧烈振荡溶解后取5ml至IOOml富集培养基中培养。富集培养的条件为摇床培养，150rpm，28°C，72小时。上述富集培养基的配方是蛋白胨0. 8 %，酵母浸膏0.5%，氯化钠0.05%，氯化钙
0.005%，乳化稀奶油2. 5% (用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。2、目标菌的分离纯化用无菌水将3个样品的富集培养液分别稀释105、106、107、108倍至各个浓度梯度，各取100 ill均匀涂布于罗丹明选择性平板培养基上，23°C培养72小时，以筛选能够产脂肪酶的菌。筛选原理为菌株生长代谢产生的脂肪酶可降解选择性平板培养基中的油脂生成脂肪酸，罗丹明B的阳离子能与脂肪酸发生反应，在紫外光照射下菌落有橙黄色的荧光。本实施例所用罗丹明选择性平板培养基以稀奶油乳化液作为唯一的碳源，该培养基营养缺乏，含油量极高，一般的菌株很难生长，对于产脂肪酶菌株的筛选具有很强的选择性。挑取罗丹明选择性培养基上长出的带有荧光圈的单个菌落，于YPD平板培养基上进行多次纯化，即挑选单菌落划线于YPD平板培养基上培养，再挑选长出的单菌落继续划线培养，多次重复，直至平板上的菌落状态达到一致。将纯化后的菌落通过革兰氏染色镜检进行纯度确认，纯和菌株在显微镜下，各个菌的形态特征一致。本实施例最终获得了 6株产脂肪酶的纯化菌株。上述选择性平板培养基的配方是牛肉膏0. 8%，蛋白胨0. 2%，琼脂I. 5%，罗丹明0. 04%，乳化稀奶油2. 5% (用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。3、酶活测定本实施例的酶活测定采用三丁酸甘油酯法和滴定法。三丁酸甘油酯法验证酶活三丁酸甘油酯平板打孔，将上清液加入小孔内，28°C培养24 72小时，测透明圈大小，取圈大清晰者测定酶活力。上述三丁酸甘油酯平板的配方是=Tris-HCL缓冲液(pH8. 0)与三丁酸甘油酯乳化液(3% (w/v)的聚乙烯醇溶液中加入10% (v/v)的三丁酸甘油酯，制成乳化液)以9 : I比例混合，琼脂1.5%。滴定法测酶活将稀奶油乳化液作为反应的底物。取2个锥形瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶⑶中加底物溶液40ml和磷酸缓冲液50ml。向A瓶中加入浓度95%乙醇15ml，于40°C水浴预热5min后，向2瓶中各加入IOml离心后的上清液，立刻混匀计时，在40°C水浴中准确反应15min，在B瓶中立刻补加浓度95%乙醇15ml终止反应，取出；向空白和样品溶液中各加酚酞指示液2滴，用0. 05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直到微红色并保持30s不褪色为终点,记录消耗0. 05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。X = (B-A) Xc/0. 05X50X 1/15Xn = 200/3X (B-A) XcXn式中，X为样品的酶活力，单位为U/g ；B为 滴定样品时消耗氢氧化钠的体积，单位为ml ；A为滴定空白时消耗氢氧化钠的体积,单位为ml ；c为氢氧化钠标准溶液浓度,单位为mol/L ；0. 05为氢氧化钠标准溶液浓度折算系数；50为IOOml 0. 05mol/L氢氧化钠溶液相当于50 u mo I脂肪酸；1/15为反应时间15min以Imin计；n为稀释倍数。Iml酶液于40°C、pH值7. 5的条件下，水解脂肪每分钟生成I U mol脂肪酸定义为I个酶活力单位。将获得的6株菌分别接种于液体产酶培养基，摇床培养，150rpm, 23°C，72小时。之后将发酵液在lOOOOrpm，IOmin条件下离心后收集上清液。将获得的各上清液加入至三丁酸甘油酯平板的孔中，选取所得透明圈较大的菌株同时用滴定法测酶活力。在三丁酸甘油酯平板上透明圈较大、酶活力较高的2株菌，酶活分别为4. 00U/mL、
3.68U/mL，从而得到脂肪酶高产菌。上述的液体产酶培养基配方是蛋白胨0. 5%，酵母浸膏0. 2%，氯化钠0. 5%，可溶性淀粉0.1%，磷酸氢二钾0.25%，乳化稀奶油2.5% (用3倍体积2 % (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。4、筛选菌株酶解乳脂肪后的风味验证将高产脂肪酶的3株菌分别接种至灭菌稀奶油中，摇床培养，150rpm，23°C，72小时后，95°C水浴保温5min灭酶。将酶解产物分别以0.5% (v/v)的添加量加入至90%脱脂奶中，依次经过搅拌、均质、杀菌和冷却，品尝风味改变方向和改变程度，记录结果。其中，菌株I明显增强了奶油的香甜味，其余菌株风味方向与乳品偏差较大或较对照风味改变不大，弃用。5、菌种鉴定菌株I由16S rDNA同源序列比较和生理生化特性鉴定为短小芽孢杆菌(该菌非所选用天然干酪的发酵剂菌种)。目前国际上没有短小芽孢杆菌高产脂肪酶的报道，更没有将此脂肪酶用于增强乳品相关风味的报道。实施例2 :从天然干酪(除以酵母、霉菌为发酵剂以外的干酪)里筛选对乳脂专一性强的脂肪酶高产菌I、目标菌的富集以成熟期半年以上的黄波干酪、奶油干酪、古老耶干酪为样品，分别取样，切成
0.5cm3的小丁，置于无菌水中剧烈振荡溶解后取5ml至IOOml富集培养基中培养，培养条件为:摇床培养，250rpm，23°C，48小时。上述富集培养基的配方是蛋白胨0. 2%，牛肉膏0. 2%，氯化钙0. 01 %，乳化稀奶油3. 75% (用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。2、目标菌的分离纯化
用无菌水将3个样品的富集培养液分别稀释105、106、107、108倍至各个浓度梯度，各取100 ill均匀涂布于罗丹明选择性平板培养基上，23°C培养72小时，以筛选能够产脂肪酶的菌。挑取罗丹明选择性培养基上长出的带有荧光圈的单个菌落，于察氏平板培养基上进行多次纯化，即挑选单菌落划线于察氏平板培养基上培养，再挑选长出的单菌落继续划线培养，多次重复，直至平板上的菌落状态达到一致。将纯化后的菌落通过革兰氏染色镜检进行纯度确认，纯和菌株在显微镜下，各个菌的形态特征一致。本实施例最终获得了 6株产脂肪酶的纯化菌株。上述选择性平板培养基的配方是蛋白胨0.8%，琼脂I. 75%，罗丹明0.06%，乳化稀奶油3. 75% (用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。3、酶活测定(方法同实施例I)将获得的6株菌分别接种于液体产酶培养基，摇床培养，250rpm, 28°C，48小时。之后将发酵液在20000rpm，IOmin条件下离心后收集上清液。将获得的各上清液加入至三丁酸甘油酯平板的孔中，选取所得透明圈较大的菌株同时用滴定法测酶活力。在三丁酸甘油酯平板上透明圈较大、酶活力较高的2株菌，酶活分别为3. 10U/mL、
3.24U/mL，从而得到脂肪酶高产菌。上述液体产酶培养基的配方是蛋白胨0. 2 %，酵母浸膏0. 8 %，氯化钠0. 05 %，硫酸镁0.1%，可溶性淀粉0.05%，葡萄糖0.05%，磷酸氢二钾0.05%，乳化稀奶油3. 75 %(用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。4、筛选菌株酶解乳脂肪后的风味验证将高产脂肪酶的2株菌分别接种至灭菌稀奶油中，摇床培养，250rpm，28°C，48小时后，95°C水浴保温5min灭酶。将酶解产物分别以0.5% (v/v)的添加量加入至90%脱脂奶中，依次经过搅拌、均质、杀菌和冷却，品尝风味改变方向和改变程度，记录结果。其中，菌株a明显增强了奶油的香甜味，其余菌株风味方向与乳品偏差较大或较对照风味改变不大，弃用。5、菌种鉴定菌株a由16S rDNA同源序列比较和生理生化特性鉴定为短小芽孢杆菌(该菌非所选用天然干酪的发酵剂菌种)。目前国际上没有短小芽孢杆菌高产脂肪酶的报道，更没有将此脂肪酶用于增强乳品相关风味的报道。实施例3 :从巴氏稀奶油、无盐黄油中筛选对乳脂专一性强的脂肪酶高产菌I、目标菌的富集将无盐黄油切成0. 5cm3的小丁，置于无菌水中剧烈振荡后取5ml至IOOml富集培养基中；吸取稀奶油3ml至IOOml富集培养基中，摇床培养，180rpm，28°C，72小时。上述富集培养基的配方是蛋白胨0. 2 %，酵母浸膏0.5%，氯化钠0.05%，氯化钙
0.005%，乳化稀奶油2. 5% (用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。2、目标菌的分离纯化用无菌水将2个样品的富集培养液分别稀释至10-5、10-6、10-7、10-8各个梯度，各取100 u I均匀涂布于选择性平板培养基上，23°C培养48小时。挑取带有荧光圈的单个菌落，于PDA平板培养基上进行多次纯化，将纯化后的菌落进行革兰氏染色镜检以确认纯度，最终获得了 4株菌。上述选择性平板培养基的配方为蛋白胨0. 2%，牛肉膏0. 8%，琼脂I. 0%，罗丹明0. 05%，乳化稀奶油3. 5% (用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。3、酶活测定(方法同实施例I)将获得的4株菌分别接种于液体产酶培养基，摇床培养，250rpm, 28°C，48小时。之后将发酵液在SOOOrpm，15min条件下离心后收集上清液。将获得的各上清液加入至三丁酸甘油酯平板的孔中，选取所得透明圈较大的菌株同时用滴定法测酶活力。

在三丁酸甘油酯平板上透明圈较大、酶活力较高的2株菌，酶活分别为2. 89U/mL、
2.20U/mL，从而得到脂肪酶高产菌。上述液体产酶培养基的配方为蛋白胨0.8%，酵母浸膏0.2%，氯化钠0.05%，可溶性淀粉0.1%，磷酸氢二钾0.25%，乳化稀奶油3. 75 % (用3倍体积2 % (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得)。筛选菌株酶解乳脂肪后的风味验证将高产脂肪酶的2株菌分别接种至灭菌稀奶油中，摇床培养，250rpm，28°C，48小时后，80°C水浴保温30min灭酶。将酶解产物分别以I. 0%添加量，加入至90%脱脂奶中，依次通过搅拌、均质、杀菌和冷却，品尝风味改变方向和改变程度，通过风味验证，菌株A明显增强了脱脂奶的奶香气，而另外一支则风味不佳，弃用。4、菌种鉴定菌株A通过16S rDNA同源序列比较和生理生化特性鉴定为乳酸乳球菌乳脂亚种，目前国际上没有乳球菌高产脂肪酶的报道，更没有将此脂肪酶用于增强乳品相关风味的报道。


本发明公开了一种所产生的脂肪酶酶解乳脂肪后的产物可以用于增香的脂肪酶高产菌的筛选方法，包括如下步骤(1)将筛选源样品添加到富集培养基中进行富集培养，得到富集培养液；(2)用无菌水稀释富集培养液，通过选择性平板培养基筛选产脂肪酶的菌，后经纯化培养获得纯化菌株；(3)将筛选出的纯化菌株在产酶培养基中培养并收获培养产物；(4)离心培养产物，收集含脂肪酶的上清液；(5)将含脂肪酶的上清液进行酶活检测，对酶活力高的菌株进行风味验证后获得目标菌株。本发明拓展了脂肪酶高产菌的筛选源，特别是将某些食品作为脂肪酶高产菌的筛选源属于首创，同时为工业化生产脂肪酶提供了新的菌种来源。