专利名称：体内筛选试验的制作方法
本文公开了用于各种体内试验的方法和组合物，用以鉴定能有效阻断L0XL2酶的促结缔组织增生和纤维化活性的L0XL2抑制剂。因此，本文提供I.用于鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括用测试分子处理动物，其中所述动物包含一处或多处纤维化，且其中能缓解纤维化症状的测试分子被鉴定为L0XL2活性的抑制剂。2.如实施方式I所述的方法，其中所述纤维化是肝纤维化。3.如实施方式2所述的方法，其中所述纤维化由CCl4处理诱发。4.如实施方式I所述的方法，其中所述纤维化是肺纤维化。5.如实施方式4所述的方法，其中所述纤维化由博来霉素处理诱发。6.用于鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括用测试分子处理动物，其中所述动物包含一处或多处关节炎，且其中能缓解关节炎症状的测试分子被鉴定为L0XL2活性的抑制剂。7.如实施方式6所述的方法，其中所述关节炎由注射胶原蛋白诱发。8.用于鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括用测试分子处理动物，其中所述动物包含通过外科原位移植肿瘤细胞产生的一种或多种实验性肿瘤，且其中能减小肿瘤体积的测试分子被鉴定为L0XL2活性的抑制剂。9.如实施方式8所述的方法，其中所述肿瘤细胞是MDA-MB435细胞。10.如实施方式8所述的方法，其中所述实验性肿瘤是肺肿瘤。11.用于鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括用测试分子处理动物，其中所述动物包含通过血管内注射肿瘤细胞产生的实验性转移，且其中能减轻转移程度的测试分子被鉴定为L0XL2活性的抑制剂。12.如实施方式11所述的方法，其中所述肿瘤细胞是MDA-MB231细胞。13.用于鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括用测试分子处理动物，其中所述动物包含外源基底膜，且其中能减少外源基底膜的血管生成的测试分子被鉴定为、L0XL2活性的抑制剂。14.实施方式13所述的方法，其中所述外源基底膜包含基质胶(Matrigel)。15.用于鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括用测试分子处理动物，其中所述动物包含一处或多处结缔组织增生，且其中能缓解结缔组织增生症状的测试分子被鉴定为L0XL2活性的抑制剂。16.如实施方式15所述的方法，其中结缔组织增生症状的缓解由胶原蛋白交联减少来证明。17.如实施方式15所述的方法，其中结缔组织增生症状的缓解由α-平滑肌肌动蛋白的表达减少来证明。18.如实施方式1、6、8、11、13或15中任一项所述的方法，其中所述测试分子是多肽。19.如实施方式18所述的方法，其中所述多肽是抗体。20.如实施方式19所述的方法，其中所述抗体是抗-L0XL2抗体。21.如实施方式1、6、8、11、13或15中任一项所述的方法，其中所述测试分子是核酸。22.如实施方式21所述的方法，其中所述核酸是siRNA。发明详述除非另有说明，本文的实施采用细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域中的标准方法和常规技术，所述方法和技术在本领域技术范围内。这些技术描述于文献中并因而本领域技术人员可用。参见例如Alberts, B.等“Molecular Biology of the Cell (《细胞分子生物学》)”第5版，纽约州纽约市的加兰德科学出版社(Garland Science), 2008 ；Voet, D.等 “Fundamentals ofBiochemistry Life at the Molecular Level (《基础生物化学分子水平的生命》)”，第3版,新泽西州霍博肯的约翰威利父子出版社(John Wiley & Sons), 2008 ;Sambrook, J.等“Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆实验室手册》)”,第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2001 ；Ausubel, F.等 “CurrentProtocols in Molecular Biology (《新编分子生物学实验指南》)”纽约的约翰威利父子出版社，1987,定期更新；Freshney, R. I. “Culture of Animal Cells A Manual of BasicTechnique (《动物细胞培养基本技术手册》)”，第4版，新泽西州萨默塞特的约翰威利父子出版社，2000 ,Methods in Enzymology (《酶学方法》)”丛书，学术出版社(AcademicPress),加利福尼亚州圣地亚哥。用于L0XL2抑制剂的体内试验近来已描述赖氨酰氧化酶样-2蛋白(L0XL2)在纤维化、肿瘤结缔组织增生和肿瘤间质内成纤维细胞活化中的作用。参见共有的2009年8月21日所提交美国专利申请序列号61/235，852和共有的与本发明同日所提交题为“Therapeutic Methodsand Compositions (治疗方法和组合物)”的美国专利申请序列号，其代理人案卷号为ARBS-Ol I，客户参考号为Al I-USl。前述申请的公开通过弓I用全文纳入本文用于描述L0XL2在肿瘤生成、转移和纤维化，特别是在结缔组织增生与成纤维细胞活化中作用的目的。由于很多L0XL2抑制剂不能减轻或缓解结缔组织增生和/或纤维化的症状，需要更有效的试验。因此，本文公开了可用于鉴定L0XL2的治疗有效抑制剂的多种体内试验。这些试验可从头与任意测试物质一起使用，也可用于筛选已由另一方法鉴定的L0XL2结合分子(例如，抗-L0XL2抗体)中治疗有效的那些分子。 外科原位移植(SOI)模型所述试验最便于在啮齿动物模型如大鼠或小鼠中进行，但可使用任意哺乳动物模型系统。例如，根据需检查的肿瘤类型使用适当的小鼠品系。裸小鼠(NCr:nu/nu)适用于很多目的。通常用5-6周龄的健康小鼠。根据所研究的肿瘤使用合适的性别。例如，用雄性小鼠研究前列腺肿瘤，用雌性小鼠研究乳腺肿瘤。首先建立通过皮下注射来自肿瘤细胞系的培养细胞而衍生的实验性肿瘤。为此，将足以诱发肿瘤的培养细胞量(例如，I-IOx IO6个细胞)皮下注入小鼠胁部。注射所用细胞为悬浮细胞，例如悬浮于0. Iml PBS中，并用例如装有27G针头的Iml结核菌素注射器注射。对于本领域技术人员而言，显然可以用任意肿瘤细胞系来提供细胞用于建立实验性肿瘤。参见例如，弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection, Manassas VA)的产品目录。当肿瘤尺寸达到10_15mm或所述肿瘤成为坏死性时，如下传代所述肿瘤。切出所述肿瘤，去除坏死组织，并将所述肿瘤在MM培养基中切成约l_2mm3大小的碎片。同时，将动物麻醉(例如，用氯胺酮混合物如盐酸氯胺酮/赛拉嗪/PromAce)，并在麻醉下在其胁部造一约0. 5cm长的切口。将2-3块切好的肿瘤组织(如上)插入所述切口。闭合所述切口并使所述动物恢复。所得肿瘤可以用切出肿瘤、去除坏死组织、切碎肿瘤并将碎片重新植入新宿主的同一过程再传代。传代最多进行3次。对于原位植入，切出第二或第三代肿瘤，去除坏死组织，在MM培养基中切碎所述肿瘤至1-2_3的碎片。如上所述将实验用小鼠麻醉，并适当放置用于进行外科操作。对于多数腹部外科手术(例如，结肠、胰脏、膀胱、前列腺、卵巢)和头颈部肿瘤移植，将小鼠限制在仰卧位。对于移植入肺、肾或胁部，将小鼠限制在侧仰卧位。在外科操作及术后恢复期间维持体温，例如，利用等温垫(如Deltaphase等温垫，马萨诸塞州布伦特里的布伦特里科学有限公司(Braintree Scientific, Inc.))。在移植手术过程中采用标准无菌操作(例如，用碘水剂和/或乙醇或异丙醇消毒所述面积)。肿瘤组织小块移植入合适器官或组织后，闭合切口，并观察动物的内稳态和恢复正常行为。可选地，为避免术后感染，可以给予抗生素(例如，溶于饮用水的0. 0008%氨苄青霉素)。为了提供外科原位移植试验的一种示例，如下移植乳腺肿瘤组织。沿雌性小鼠第二乳头内侧造出小切口。通过钝性分离暴露皮下的乳腺脂肪垫，在脂垫上造出小切口，将所述切口钝性扩展形成小袋。将2-3块如上所述制备的切块乳腺肿瘤组织用8-0尼龙缝合线缝入所述小袋并用6-0丝缝线闭合切口。如前文所述，所述SOI试验可在任何动物模型系统如哺乳动物中进行。本文描述小鼠系统仅作为示例。成纤维细胞和肿瘤细胞的共培养物的异种移植为提供肿瘤相关结缔组织增生的模型系统，将肿瘤细胞和成纤维细胞共同注入小鼠。本领域技术人员已知小鼠异种移植模型系统，且本文“实施例”部分描述了几种鼠模型系统。该试验可用的肿瘤细胞包括但不限于HT29(从结肠腺癌建立的细胞系)，MDA-MB-231 (从乳腺癌建立的细胞系)，MDA-MB-435 (从黑色素瘤建立的细胞系)，SK0V3 (从卵巢癌建立的细胞系)和BxPC3 (从胰腺肿瘤建立的细胞系)。示例性成纤维细胞是人包皮成纤维细胞(HFF)和NIH 3T3细胞。 收集均生长于培养物中的成纤维细胞和肿瘤细胞，确定细胞数量，以I : 1(细胞细胞)比例混合所述成纤维细胞和肿瘤细胞。将所述细胞混合物接种入测试动物(例如，通过皮下注射入小鼠胁部，可选免疫缺陷型小鼠如裸小鼠)。观察有和没有测试化合物时的肿瘤生长及可选的转移，以评估所述测试化合物对于例如胶原蛋白沉积、胶原蛋白交联、成纤维细胞活化、血管发生、血管生成等过程的影响。成纤维细胞活化肿瘤结缔组织增生可由成纤维细胞活化引起，所述活化为正常成纤维细胞向“肿瘤相关成纤维细胞”或“肌成纤维细胞”的转化。肿瘤相关成纤维细胞(TAF)可以根据其产生和/或分泌多种因子来鉴定，所述因子包括表10所述的那些因子(见实施例12)，这些标记物中的任一个或任意组合的表达可在本文所述任意体内试验中用作试验终点。血管生成试验关于体内血管生成试验的信息可参见Auerbach等(2003)Clinical Chemistry49 :32-40 和 Norrby (2006) J. Cell. Mol. Med. 10 :588-612 ;其公开通过引用全文纳入本文用于描述血管生成试验的目的。还可参见共有的2009年8月21日所提交美国临时专利申请号61/235，796和共有的与本申请同日所提交名为“In vitro Screening Assays (体外筛选试验)”的美国专利申请，其代理人案卷号为ARBS-013，客户参考号为A13-US1 ;这两项申请通过弓I用全文纳入本文用于所有目的。赖氨酰氧化酶型酶本文所用术语“赖氨酰氧化酶型酶”指催化赖氨酸和羟赖氨酸残基的ε-氨基氧化脱氨的蛋白家族成员，该氧化脱氨导致肽基赖氨酸转变成肽基-α -氨基己二酸-S -半醛(醛赖氨酸)并释放化学计量量的氨和过氧化氢本文公开了利用体内试验鉴定LOXL2活性抑制剂的方法。例如，所述试验包括CCL4-诱发的肝纤维化，博来霉素诱发的肺纤维化，胶原蛋白诱发的关节炎，外科原位移植培养肿瘤细胞后的肿瘤生长，心内注射培养肿瘤细胞后的转移，肿瘤异种移植模型，和植入异源基底膜后的血管发生和/或血管生成。