专利名称：米根霉rh1-5及其分离培养方法大曲作为浓香型曲酒的糖化发酵剂，在培养过程中经过一定富集、培养、自然筛选、驯化形成了特殊的微生物系，为曲酒生产发酵提供丰富而有益的微生物菌源，从而形成代谢产物的多样性，即香味成份的复杂性，同时大曲还是复合酶制剂，大曲中含有淀粉酶、糖化酶、酒化酶、酯化酶、蛋白酶等多种酶系，为形成复杂的香气成份提供催化剂。但受环境微生物的影响，大曲微生物菌系繁杂，其糖化力波动较大，直接影响大曲在酿酒过程中的糖化效果。
本发明的目的在于提供一种米根霉RH1-5及其分离培养方法，通过该分离培养方法获得米根霉RH1-5，分离培养方法工艺简单，米根霉RH1-5糖化力波动较小，稳定大曲在酿酒过程中的糖化效果。本发明的技术解决方案是该米根霉RH1-5菌株是从浓香中高温大曲中分离筛选而得，菌种已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种编号为=CGMCC No.5513,分类命名米根霉 Rhizopus oryzae。所述米根霉RH1-5的分离培养方法是取中高温大曲适量粉碎后称取10克，于装有90mL无菌水的三角瓶中，震荡30min获得菌悬液；用无菌吸管吸取菌悬液l.OmL，放入盛有9mL无菌水的试管中，依次用10倍法稀释至不同稀释度，取10 —2、10 —3、10 —4稀释度的样品各ImL加入直径为90_无菌培养皿中，分别采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、察氏培养基进行平板培养，摇匀后置于恒温培养箱中28°C _32°C倒置培养3-5天；挑取培养皿内形态规则的菌落，在麸皮汁固体斜面培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为霉菌后保藏于麸皮汁固体斜面培养基备用；将所得霉菌菌株点种于筛选培养基平板上，用透明圈法进行糖化霉菌初筛，筛出产糖化酶能力强的微生物，最终筛选出一株霉菌，经26S rDNA序列同源性分析鉴定为米根霉，命名腿-5。所述麸皮汁固体斜面培养基在I. OL麸皮汁中加入其质量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%琼脂，PH自然，121°C灭菌15min ;其中，麸皮汁制备加入5_6倍于麸皮重量的水，搅拌均匀煮沸30min，取出过滤得麸皮汁。所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)将200克马铃薯去皮切成小块，于锅中加水1000毫升煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加蔗糖或葡萄糖20克、琼脂10克，煮沸融化并补水至1000毫升。所述孟加拉红琼脂养基购于上海国药集团。所述察氏培养基三角瓶中加入硝酸钠3克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化钾O. 5克、硫酸亚铁O. 01克、蔗糖30克、琼脂10克、蒸馏水1000毫升，加热溶解得混合液，121°C杀菌20min，冷却后添加混合液质量的O. 05%去氧胆酸钠，再每IOOml培养基中加入IOOul链霉素。所述筛选培养基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KN03 lg、琼脂 IOg 组成，ρΗ7· 2-7. 4，121°C灭菌 30min。 本发明对大曲中的微生物进行分离筛选获得一株霉菌——米根霉，与实验室现有的保藏菌株进行性能对比试验，结果表明该菌株不仅糖化力高，而且耐酸、耐高温，适宜于 酿酒窖池发酵的酸性环境，有益于培养制作强化高温大曲，对提高出酒率具有重要的意义。 取中高温大曲适量粉碎后称取10克，于装有90mL无菌水的三角瓶中，震荡30min获得菌悬液；用无菌吸管吸取菌悬液I. OmL，放入盛有9mL无菌水的试管中，依次用10倍法稀释至不同稀释度，取10 —2、10 —3、10 —4稀释度的样品各ImL加入直径为90mm无菌培养皿中，分别采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、察氏培养基进行平板培养，摇匀后置于恒温培养箱中28°C倒置培养5天，每个稀释度同时做3个平行；挑取培养皿内形态规则的菌落，在麸皮汁固体斜面培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为霉菌后保藏于麸皮汁固体斜面培养基备用；将所得霉菌菌株按编号点种于筛选培养基平板上，用透明圈法进行糖化霉菌初筛，筛出产糖化酶能力强的微生物，最终筛选出一株霉菌，经26S rDNA序列同源性分析鉴定为米根霉，命名RH1-5。其中，所述麸皮汁固体斜面培养基在I. OL麸皮汁中加入其质量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%琼脂，PH自然，121°C灭菌15min ;其中，麸皮汁制备加入5倍于麸皮重量的水，搅拌均匀煮沸30min，取出过滤得麸皮汁。所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)将200克马铃薯去皮切成小块，于锅中加水1000毫升煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加蔗糖或葡萄糖20克、琼脂10克，煮沸融化并补水至1000毫升。所述孟加拉红琼脂养基购于上海国药集团。所述察氏培养基三角瓶中加入硝酸钠3克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化钾O. 5克、硫酸亚铁O. 01克、蔗糖30克、琼脂10克、蒸馏水1000毫升，加热溶解得混合液，121°C杀菌20min，冷却后添加混合液质量的O. 05%去氧胆酸钠，再每IOOml培养基中加入IOOul链霉素。所述筛选培养基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、琼脂 IOg 组成，ρΗ7· 2，121°C灭菌 30min。实施例2 :依以下步骤分离培养米根霉RH1-5 取中高温大曲适量粉碎后称取10克，于装有90mL无菌水的三角瓶中，震荡30min获得菌悬液；用无菌吸管吸取菌悬液I. OmL，放入盛有9mL无菌水的试管中，依次用10倍法稀释至不同稀释度，取10 —2、10 —3、10 —4稀释度的样品各ImL加入直径为90mm无菌培养皿中，分别采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、察氏培养基进行平板培养，摇匀后置于恒温培养箱中30°C倒置培养4天，每个稀释度同时做3个平行；挑取培养皿内形态规则的菌落，在麸皮汁固体斜面培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为霉菌后保藏于麸皮汁固体斜面培养基备用；将所得霉菌菌株按编号点种于筛选培养基平板上，用透明圈法进行糖化霉菌初筛，筛出产糖化酶能力强的微生物，最终筛选出一株霉菌，经26S rDNA序列同源性分析鉴定为米根霉，命名RH1-5。所述麸皮汁固体斜面培养基在I. OL麸皮汁中加入其质量1%葡萄糖、O. 5%酵母 膏、1%琼脂，PH自然，121°C灭菌15min;其中，麸皮汁制备加入5. 5倍于麸皮重量的水，搅拌均匀煮沸30min，取出过滤得麸皮汁。所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)将200克马铃薯去皮切成小块，于锅中加水1000毫升煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加蔗糖或葡萄糖20克、琼脂10克，煮沸融化并补水至1000毫升。所述孟加拉红琼脂养基购于上海国药集团。所述察氏培养基三角瓶中加入硝酸钠3克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化钾O. 5克、硫酸亚铁O. 01克、蔗糖30克、琼脂10克、蒸馏水1000毫升，加热溶解得混合液，121°C杀菌20min，冷却后添加混合液质量的O. 05%去氧胆酸钠，再每IOOml培养基中加入IOOul链霉素。所述筛选培养基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、琼脂 IOg 组成，ρΗ7· 3，121°C灭菌 30min。实施例3 :依以下步骤分离培养米根霉RH1-5 取中高温大曲适量粉碎后称取10克，于装有90mL无菌水的三角瓶中，震荡30min获得菌悬液；用无菌吸管吸取菌悬液I. OmL，放入盛有9mL无菌水的试管中，依次用10倍法稀释至不同稀释度，取10 —2、10 —3、10 —4稀释度的样品各ImL加入直径为90mm无菌培养皿中，分别采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、察氏培养基进行平板培养，摇匀后置于恒温培养箱中32°C倒置培养3天，每个稀释度同时做3个平行；挑取培养皿内形态规则的菌落，在麸皮汁固体斜面培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为霉菌后保藏于麸皮汁固体斜面培养基备用；将所得霉菌菌株按编号点种于筛选培养基平板上，用透明圈法进行糖化霉菌初筛，筛出产糖化酶能力强的微生物，最终筛选出一株霉菌，经26S rDNA序列同源性分析鉴定为米根霉，命名RH1-5。所述麸皮汁固体斜面培养基在I. OL麸皮汁中加入其质量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%琼脂，PH自然，121°C灭菌15min ;其中，麸皮汁制备加入6倍于麸皮重量的水，搅拌均匀煮沸30min，取出过滤得麸皮汁。所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)将200克马铃薯去皮切成小块，于锅中加水1000毫升煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加蔗糖或葡萄糖20克、琼脂10克，煮沸融化并补水至1000毫升。所述孟加拉红琼脂养基购于上海国药集团。所述察氏培养基三角瓶中加入硝酸钠3克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化钾O. 5克、硫酸亚铁O. 01克、蔗糖30克、琼脂10克、蒸馏水1000毫升，加热溶解得混合液，121°C杀菌20min，冷却后添加混合液质量的O. 05%去氧胆酸钠，再每IOOml培养基中加入IOOul链霉素。
所述筛选培养基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、琼脂 IOg 组成，ρΗ7· 4，121°C灭菌 30min。实施例4 :菌种性能对比优化试验
将实施例1-3获得的菌株与实验室保藏的四株糖化菌株从试饭糖化力、糖化力、液化力及酯化力指标进行性能对比试验。接种培菌糖化米饭灭菌后，冷却至35 40°C，以无菌操作接入霉菌孢子悬浮液，充分摇勻，于不同温度和不同pH培养不同时间，中间隔IOh左右摇瓶I次；取出后测其水分、试饭酸度、试饭糖化力、糖化力、液化力、酯化力指标；查阅资料得知试饭糖分无法真实的反应曲的质量好坏，因为试饭糖分测定值未考虑接种量及时间的影响，试饭糖化力可以相对准确地反应曲的质量。试饭糖化力mg/gh
试饭糖化力=试饭糖分+ (菌种对米饭的接种量X试饭时间)X1000糖化酶活力结果以I克绝干曲在Ph4. 6溶液中，35°C糖化可溶性淀粉I小时所产生的葡萄糖毫克数(mg/gh)
液化酶活力在35°C、Ph4. 6溶液时，I克绝干曲在I小时液化可溶性淀粉的质量(g/gh)，α-淀粉酶作用于α-1，4葡萄糖苷键。(I)、不同培菌糖化温度
表I不同培菌糖化温度指标测定


本发明公开了一种米根霉RH1-5及其分离培养方法，通过该分离培养方法获得米根霉RH1-5，该米根霉RH1-5菌株是从浓香中高温大曲中分离筛选而得，菌种已于2011年11月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种编号为CGMCCNo.5513。本发明的分离培养方法工艺简单，米根霉RH1-5糖化力波动较小，稳定大曲在酿酒过程中的糖化效果。