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分离自皮肤细胞的组合物及其使用方法

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    分离自皮肤细胞的组合物及其使用方法
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专利名称::分离自皮肤细胞的组合物及其使用方法::本发明涉及编码多肽的多核苷酸、在皮肤细胞中表达的多肽以及治疗患者的各种方法,所述治疗方法包括给予本发明的多肽或多核苷酸。发明背景皮肤是肌体的最大器官,并起保护层作用。在严重烧伤人员发生的皮肤损伤可能由于缺乏对抗外部微生物感染的屏障以及体温和体液的下降和流失而导致死亡。皮肤组织由若干层组成,最外层是由基底膜支撑并覆盖在真皮上面的表皮。真皮下面是疏松的结缔组织和覆盖肌肉或骨组织的筋膜。皮肤是自我更新组织,因为皮肤细胞不断形成和脱落。表皮最深层的细胞是基底细胞,其中富含能够复制的细胞。这种复制细胞被称为祖细胞或干细胞。复制细胞又产生称为‘移行放大细胞(transitamplifyiingcell)’的子细胞。随着这些细胞由基底层转移到表皮的更表面层而分化成熟为角质细胞(成熟皮肤细胞)。在此过程中,角质细胞发生角质化并最终由皮肤表面脱落。表皮中的其它细胞包括合成黑色素的黑素细胞,黑色素是负责抗日照的保护性色素。朗格汉斯细胞也位于表皮中,起着加工外源蛋白以呈递给免疫系统的细胞作用。真皮含有神经、血管和淋巴管、纤维组织和脂肪组织。在真皮中有成纤维细胞、巨噬细胞和肥大细胞。汗腺或皮脂腺以及毛囊穿过表皮和真皮。每根毛发都起源自一个毛囊。当拔出毛发时,毛发会在毛囊的真皮乳头控制下的上皮细胞再生出来。当皮肤表面破裂时,例如受伤时,干细胞增殖而子代角质细胞迁移至伤口重新弥合组织。因此皮肤细胞具有在创伤作用下激活的基因。这些基因的产物包括数种生长因子,例如介导皮肤细胞增殖的表皮生长因子。可以将在皮肤中激活的基因和这些基因的蛋白产物开发为治疗皮肤损伤的药物。皮肤细胞产生的其它生长因子也可以影响其它类型细胞的生长。因为皮肤癌是一种皮肤细胞生长性紊乱,所以皮肤产生的调节细胞生长的蛋白可以开发为治疗皮肤癌的药物。皮肤产生的调节黑色素产生的蛋白可以用作保护皮肤抵抗有害日照作用的药物。已知角质细胞分泌细胞因子并表达各种细胞表面蛋白。细胞因子和细胞表面分子是在抗感染的炎症反应以及累及皮肤的自身免疫疾病中起重要作用的蛋白。因此,皮肤细胞表达的基因及其蛋白产物可开发成治疗累及皮肤的炎症性疾病的药物。毛发是人体个性的重要部分。皮肤疾病可导致毛发受损。斑秃是一种特征为头皮毛发片状缺损的疾病。全秃是癌症药物治疗的副作用。毛发的生长发育是由在皮肤和真皮乳头中表达的基因的作用介导的。这样的基因及其蛋白产物可有效开发为治疗毛囊性疾病的药物。需要新型治疗法来促进皮肤伤口的愈合、防止脱发、增强毛发再生或去除毛发以及更有效而没有副作用地治疗自身免疫性皮肤病和炎症性皮肤病。还需要对皮肤癌的更有效治疗方法。因此本领域仍然需要鉴定和分离编码在皮肤中表达的蛋白的基因,用于开发治疗包括皮肤相关疾病在内的疾病的治疗药物。发明概述本发明提供在皮肤细胞中表达的多肽和编码这些多肽的多核苷酸、包含这些多核苷酸的表达载体和宿主细胞,以及它们的使用方法。在具体的实施方案中,提供分离多核苷酸,所述分离多核苷酸包含选自以下的DNA序列(a)SEQIDNO1-119、198-276、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464描述的序列;(b)SEQIDNO1-119、198-276、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464描述序列的互补序列;(c)SEQIDNO1-119、198-276、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464描述序列的反向互补序列;(d)SEQIDNO1-119、198-276、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464描述序列的反向序列;(e)与(a)-(d)序列相同的可能性为99%的序列;以及(f)与(a)-(d)序列的同一性至少为50%、75%或90%的序列。在其它实施方案中,本发明提供分离多肽以及编码这样的多肽的分离多核苷酸,所述分离多肽包含选自以下的氨基酸序列(a)SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465提供的序列;以及(b)与SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465提供序列的同一性至少为50%、75%或90%的序列。还提供包括含选自以下的氨基酸序列的多肽的至少一个功能部分的分离多肽(a)SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465提供的序列;以及(b)与SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465序列的同一性至少为50%、75%或90%的序列。在相关实施方案中,本发明提供包含上述多核苷酸的表达载体以及用所述载体转化的宿主细胞。进一方面,本发明提供刺激患者角质细胞生长和移动、抑制上皮性癌细胞生长、抑制肿瘤血管发生和血管形成或调节血管生长的方法,包括给予所述患者包含分离多肽的组合物,其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列(a)SEQIDNO187、196、342、343、395、397和398提供的序列;和(b)与SEQIDNO187、196、342、343、395、397和398提供序列的同一性为至少50%、75%或90%的序列。本发明还提供调节患者皮肤炎症的方法,该方法包括给予所述患者包含分离多肽的组合物,其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列(a)SEQIDNO338和347提供的序列;和(b)与SEQIDNO338和347提供序列的同一性至少为50%、75%或90%的序列。再一方面,本发明提供刺激患者上皮细胞生长的方法。所述方法包括给予所述患者包含分离多肽的组合物,所述分离多肽包括选自以下的氨基酸序列(a)SEQIDNO129和348提供的序列;和(b)与SEQIDNO129和348提供序列的同一性至少为50%、75%或90%的序列。再一方面,本发明提供抑制HIV-1结合患者白细胞、治疗炎性疾病或治疗癌症的方法,所述方法包括给予所述患者包含分离多肽的组合物,所述分离多肽包括选自以下的氨基酸序列(a)SEQIDNO340、344、345和346提供的序列;和(b)与SEQIDNO340、344、345和346提供序列的同一性至少为50%、75%或90%的序列。如下详述,本发明的分离多核苷酸和分离多肽可有效用于制备治疗皮肤疾病的治疗药物。参照以下更详细的描述可充分理解本发明的上述特征和其它特征以及获得它们的方法。如同每个参考文献都单独结合到本文中一样,本文公开的所有参考文献都通过引用整体结合到本文中。附图简述图1图示huTR1Mrna在人组织中分布的RNA分析结果。图解He,心脏;Br,大脑;Pl,胎盘;Lu,肺;Li,肝;SM,骨骼肌;Ki,肾;Sp,脾;Th,胸腺;Pr,前列腺;Ov,卵巢。图2图示muTR1a和huTR1a的MAP激酶测定结果。如正文所述加入MuTR1a(500ng/ml)、huTR1a(100ng/ml)或LPS(3pg/ml)。图3图示muTR1a对新生儿阴茎包皮角质细胞生长的刺激作用。图4图示muTR1a和huTR1a对转化的人角质细胞细胞系HaCaT生长的刺激作用。图5图示muTR1a和huTR1a对人上皮癌细胞系A431生长的抑制作用。图6图示KS2a抑制IL-2诱导的伴刀豆球蛋白A刺激的小鼠脾细胞生长。图7图示KS3a和脱铁运铁蛋白组合对大鼠肠上皮细胞(IEC-18)生长的刺激作用。图8图示说明TR-1(100ng/ml)、muKS1(100ng/ml)、SDF1α(100ng/ml)和fMLP(10μM)对人PBMC的氧化爆发作用。图9图示muKS1和SDF1α对THP-1细胞的趋化作用。图10图示在腹膜内注射muKS1(50μg)、GV14B(50μg)和PBS后在C3H/HeJ小鼠中诱导的细胞浸润。图11证实huTR1a在CV1/EBNA和HeLa细胞系中诱导ERK1和ERK2的磷酸化作用。图12图示用muTR1、huTR1、huTGFα和PBS(均为100ng/ml)刺激后huTR1mRNA在HeLa细胞中的表达。图13图示muTR1a在PC-12(图13A)和HaCaT(图13B)细胞中对SRE的激活作用。图14图示抗EGF受体抗体对huTR1a介导的HaCaT细胞生长的抑制作用。图15A利用单字母代码图示KS2cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO464)以及推断的氨基酸序列(SEQIDNO465)。用负数标示5′UTR。下划线的NH2-末端氨基酸为预期前导序列,***表示终止密码子。双下划线标示多腺苷酸化信号。图15B图示比较KS1的完整可读框(在图15B中称为KLF-1)与其人同源物BRAK和小鼠α-趋化因子mCrg-2、mMig、mSDF-1、mBLC、mMIP2、mKC和mLIX。对于趋化因子而言,以前尚未描述过在KS1和BRAK的半胱氨酸3和半胱氨酸4之间存在另外5个残基。发明详述一个方面,本发明提供分离自哺乳动物皮肤细胞的多核苷酸。本文使用的术语“多核苷酸”是指单链或双链的脱氧核糖核苷酸碱基聚合物或核糖核苷酸碱基聚合物,包括有义链和反义链的DNA和RNA分子。该术语包括cDNA、基因组DNA、重组DNA以及全部或部分合成的核酸分子。多核苷酸可以包括完整的基因或其部分。基因是编码功能蛋白或RNA分子的DNA序列。有效反义多核苷酸可以包括相应的多核苷酸片段,因此“多核苷酸”的定义包括所有有效的反义片段。反义多核苷酸以及涉及反义多核苷酸的技术是本领域众所周知的,例如Robinson-Benion等,“反义技术”,MethodsinEnzymol.254(23)363-375,1995;和Kawasaki等,Artific.Organs20(8)836-848,1996中有关于它的介绍。可以在合适的严格条件下,使用cDNA序列的全部或部分作为筛选合适文库的探针,通过标准DNA/DNA杂交技术完成对基因组DNA和异钟DNA的鉴定。或者,可以使用利用寡核苷酸引物的PCR技术扩增和鉴定基因组序列和cDNA序列,所述寡核苷酸引物是根据已知基因组DNA、cDNA和蛋白序列设计的。可以通过常规的合成方法生产相当于鉴定序列和变异体的合成DNA。正如本领域常规使用这些术语一样,本发明提供的所有多核苷酸都是分离纯化的。在具体实施方案中,本发明的多核苷酸包含选自以下序列的DNA序列SEQIDNO1-119、198-274、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464提供的序列以及SEQIDNO1-119、198-274、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464序列的变异体。还提供包括所述DNA序列的互补序列、反向互补序列或反向序列以及这些序列的变异体的多核苷酸。以下实例最清晰地阐述了本文使用的术语“互补序列”、“反向互补序列”和“反向序列”的定义。对于序列5′AGGACC3′,互补序列、反向互补序列和反向序列如下互补序列3′TCCTGG5′反向互补序列3′GGTCCT5′反向序列5′CCAGGA3′。另一方面,本发明提供由上述多核苷酸编码或部分编码的分离多肽。本文使用的术语“多肽”包含任意长度的氨基酸链,包括全长蛋白,其中所述氨基酸残基与共价肽键相连。本文使用的术语“多核苷酸编码的多肽”包括由包含本文提供的部分分离DNA序列的多核苷酸编码的多肽。在具体的实施方案中,本发明的多肽包括选自以下序列的氨基酸序列SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465提供的序列以及这些序列的变异体。本发明的多肽可以通过将编码所述多肽的DNA序列插入到表达载体中并在合适宿主中表达所述多肽而重组产生。可以使用本领域普通技术人员已知的各种表达载体中的任一种。表达可以在用包含编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的任何合适宿主细胞中进行。合适的宿主细胞包括原核生物细胞、酵母和高等真核细胞。优选使用的宿主细胞是大肠杆菌、昆虫、酵母或哺乳动物细胞系(诸如COS或CHO)。以此方式表达的DNA序列可以编码天然多肽、其部分或其其它变异体。在一个相关方面,提供至少包含多肽的功能部分的多肽,所述多肽具有选自以下序列的氨基酸序列SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465提供的序列及其变异体。本文使用的多肽的“功能部分”是包含影响所述多肽功能必需的活性部位的部分,例如能够结合一个或多个反应物的分子部分。所述活性部位可以由存在于一个或多个多肽链上的几个独立部分组成,一般具有高结合亲和力。首先通过化学或酶促消化多肽或突变分析编码多肽的多核苷酸以及随后表达获得的突变多肽制备多肽的片段,可鉴定所述多肽的各个功能部分。然后使用例如以下提供的典型测定,测试所述多肽片段或突变多肽,以确定哪个部分保留有生物活性。本发明多肽的各个部分和其它变异体也可以通过合成或重组方法产生。使用本领域一般技术人员周知的技术可以产生少于约100个氨基酸通常少于约50个氨基酸的合成多肽。例如,可以使用任何市售的固相技术,如氨基酸连续加入至增长的氨基酸链的Merrifield固相合成法,合成这种多肽。参见Merrifield,J.Am.Chem.Soc.852149-2146,1963。自动合成多肽仪器可从如PerkinElmer/AppliedBioSystems,Inc.(FosterCity,California)的供应商购买,并可按照生产商的说明书操作。可以使用标准诱变技术,如寡核苷酸定点特异性诱变(Kunkel,T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492,1985),制备天然多肽变异体。也可以使用允许制备截短多肽的标准技术除去DNA序列的若干部分。一般而言,本文公开的多肽制备成分离的大致纯的形式。所述多肽优选至少约80%纯度,更优选至少约90%纯度,而最优选至少约99%纯度。在下文详述的某些优选实施方案中,将所述分离的多肽加入到用于治疗皮肤病的药用组合物或疫苗中。本文使用的术语“变异体”包括与明确鉴定序列不同的核苷酸或氨基酸序列,其中缺失、取代或添加一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变异体可以是天然等位基因变异体或非天然变异体。变异体序列(多核苷酸或多肽)与本发明的序列的同一性优选为至少50%,更优选至少75%,而最优选至少90%。通过如下所述比较对比两个序列,确定对比部分的相同残基数目,将该数除以本发明(查询)序列的残基总数,并将结果乘以100,可测得同一性百分率。可以对多核苷酸或多肽序列进行序列对比,并可使用可公开得到的计算机算法测定具体区域相对于另一种多核苷酸或多肽的同一性百分率。两种对比和鉴定多核苷酸序列相似性的典型算法是BLASTN算法和FASTA算法。可以使用BLASTP和FASTP算法检测多肽序列的对比和相似性。BLASTX和FASTX算法比较全部读框中翻译的核苷酸查询序列与多肽序列。BLASTN、BLASTP和BLASTX算法可以/blast/executables/在NCBI匿名FTP服务器(ftp//ncbi.nlm.nih.gov)上获得。FASTA和FASTX算法可在Internet上的ftp站点ftp//tfp.virginia.edu/pub/获得。可使用FASTA算法确定多核苷酸变异体,该算法设置为文件管理介绍并随该算法配送的默认参数。随所述算法配送的FASTA和FASTX1.0x版的自述文件介绍了算法的使用和默认参数。FASTA和FASTX算法的使用在Pearson,WR和Lipman,DJ,“改进的生物序列分析工具”,PNAS852444-2448,1998;和Pearson,WR,“用FASTP和FASTA快速灵敏地对比序列”,MethodsinEnzymology18363-98,1990中也有介绍。优选使用BLASTN算法2.0.4版[1998年2月24日]确定本发明的多核苷酸变异体,该算法设置为文件管理介绍并随该算法配送的默认参数。优选使用BLASTP算法2.0.4版确定本发明的多肽变异体,该算法设置为文件管理介绍并随该算法配送的默认参数。URL为http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html的NCBIWeb站点和出版物Altschul,StephenF.等,“空位BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白质数据库检索程序”,NucleicAcidsRes.253389-3402,1997介绍了BLAST算法家族算法(包括BLASTN、BLASTP和BLASTX)的使用。以下工作参数优选用于使用BLASTN测定对比和相似性,得到多核苷酸的E值和同一性百分率Unix运行命令的默认参数如下blastall-pblastn-dembldb-e10-G0-E0-r1-v30-b30-iqueryseq-0results;而参数是-p程序名称[String];-d数据库[String];-e预期值(E)[Real];-G空位开放惩罚(cost)(0调用默认运行)[Integer];-E空位延长惩罚(0调用默认运行)[Integar];-r核苷酸匹配奖励(reward)(仅适用于blastn)[Integer];-v单行描述的数目(V)[Integer];-b显示的对比数目(B)[Integer];-i查询文件[FileIn];-oBLAST报告输出文件[FileOut]任选(Optional)。以下工作参数优选用于使用BLASTP测定对比和相似性,得到多肽的E值和同一性百分率blastall-pblastp-dswissprotdb-e10-Gl-E11-r1-v30-b30-iqueryseq-0results;而参数是-p程序名称[String];-d数据库[String];-e预期值(E)[Real];-G空位开放惩罚(0调用默认运行)[Integer];-E空位延长惩罚(0调用默认运行)[Integer];-v单行描述的数目(v)[Integer];-b显示的对比数目(b)[Integer];-I查询文件[FileIn];-oBLAST报告输出文件[FileOut]任选。由BLASTN、BLASTP、FASTA或相似算法获得的查询序列对一个或多个数据库序列的“命中”排列和鉴定序列的相似部分。根据相似度和序列重叠长度整理命中情况。对数据库序列的命中通常代表仅在查询序列的一部分序列长度上重叠。如下确定多核苷酸或多肽序列的相似性百分率分别使用设定为默认参数的合适算法,例如BLASTN或BLASTP,对比多核苷酸和多肽序列;鉴定对比部分相同的核酸或氨基酸数目;将相同的核酸或氨基酸数目除以本发明的多核苷酸或多肽的核酸或氨基酸的总数;然后再乘以100,得出相似性百分率。举例来说,在使用默认参数的BLSATN算法进行的对比中,具有220个核酸的查询多核苷酸在520个核酸的EMBL数据库中在23个核苷酸的序列段上命中了多核苷酸序列。命中的23个核苷酸包括21个相同的核苷酸、一个空位和一个不同核苷酸。因此,查询多核苷酸对EMBL数据库中的命中核苷酸的同一性百分率为21/220乘以100,或为9.5%。多肽序列相似性可以相似的方式确定。BLASTN和BLASTX算法还产生多核苷酸和多肽序列对比的“预期”值。预期值(E)表示在检索一定大小的数据库时,对于一定数目的连续序列,人们可“预期”偶然命中数。预期值用作测定对数据库的命中是否为真实相似性的显著性阈值。例如,一个多核苷酸命中测得的E值为0.1,其含义可解释为在一个EMBL数据库大小的数据库中,对于具有相似得分(score)的序列的对比部分,人们可以预期简单偶然匹配为0.1个。按此标准,序列的对比和匹配部分相同的可能性为90%。对于对比和匹配部分E值为0.01或0.01以下的序列,使用BLASTN算法在EMBL数据库中偶然发现匹配的可能性为1%或更小。使用各种多肽数据库,诸如SwissProt数据库,以相似的方式可测定多肽序列的E值。按照一个实施方案,相对于本发明的每个多核苷酸和多肽,“变异”多核苷酸和多肽最好含有这样的序列与本发明的多核苷酸和多肽相比,含有的核酸或氨基酸数目与本发明的多核苷酸和多肽相同或略少,并且产生的E值为0.01或0.01以下。即变异体多核苷酸或多肽是任何以下序列与本发明的多核苷酸和多肽相同的可能性至少为99%,使用设定为默认参数的BLASTN或BLASTX算法检测到其E值为0.01或0.01以下。按照一个优选实施方案,变异体多核苷酸是其核酸数目与本发明的多核苷酸相同或略少的序列,它与本发明的多核苷酸相同的可能性至少为99%,使用设定为默认参数的BLASTN算法检测到其E值为0.01或0.01以下。同样,按照一个优选实施方案,变异体多肽是其氨基酸数目与本发明的多肽相同或略少的序列,它与本发明的多肽相同的可能性至少为99%,使用设定为默认参数的BLASTP算法检测到其E值为0.01或0.01以下。变异体多核苷酸序列通常在严格条件下与所述多核苷酸序列杂交。本文使用的“严格条件”是指在6XSSC、0.2%SDS溶液中预清洗;在65℃、6XSSC、0.2%SDS下杂交过夜;然后在1XSSC、0.1%SDS中于65℃清洗两次,每次30分钟,并在0.2XSSC、0.1%SDS中于65℃清洗两次,每次30分钟。本文使用的以“x”具体值为基准的术语“x聚体”是指至少包含以下任何一种多核苷酸或多肽的特定数目(“x”)连续残基的多核苷酸或多肽SEQIDNO1-119、198-274、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464提供的多核苷酸;SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465多肽。根据具体序列x值可以为约20至约600。本发明的多核苷酸包括至少含下述任何一种多核苷酸或其变异体的特定数目连续残基(x-聚体)的多核苷酸SEQIDNO1-119、198-274、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464多核苷酸。本发明的多肽包括至少含下述任何一种多肽的特定数目连续残基(x-聚体)的多肽SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465多肽。按照优选实施方案,x值至少20,更优选至少40,再更优选至少60,最优选至少80。因此,本发明的多核苷酸包括含SEQIDNO1-119、198-274、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464提供的多核苷酸或其变异体的20聚体、40聚体、60聚体、80聚体、100聚体、120聚体、150聚体、180聚体、220聚体、250聚体的多核苷酸;或300聚体、400聚体、500聚体或600聚体的多核苷酸。本发明的多肽包括含SEQIDNO120-197、275-348、373-398、406-409、413-415、417、456-463和465提供的多肽或其变异体的20聚体、40聚体、60聚体、80聚体、100聚体、120聚体、150聚体、180聚体、220聚体、250聚体的多肽;或300聚体、400聚体、500聚体或600聚体的多肽。可以如以下实施例1所述,通过对哺乳动物皮肤细胞制备的cDNA文库进行高通量测序,分离本发明的多核苷酸。或者,可以合成基于SEQIDNO1-119、198-274、349-372、399-405、410-412、416、418-455和464所提供序列的寡核苷酸探针,并用于利用杂交或聚合酶链反应(PCR)技术鉴定哺乳动物皮肤细胞cDNA文库或基因组DNA文库中的阳性克隆。探针的长度可以短于本文提供的序列,但应当至少约10个核苷酸长,优选至少约15个核苷酸长,而最优选至少约20个核苷酸长。适用于所述寡核苷酸探针的杂交和PCR技术是本领域众所周知的(参见例如Mullis等,ColdSpringHarborSymp.QuantBiol.,51263,1987;Erlich等,PCRTechnology,StocktonPressNY,1989;(Sambrook,J,Fritsch,EF和Maniatis,T编著的MolecularCloningALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNewYork,1989)。可以通过限制酶消化、DNA测序等方法分析阳性克隆。另外,可以通过使用本领域熟知技术的合成方法产生本发明的DNA序列。自动合成寡核苷酸的设备可从诸如PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivision(FosterCity,California)的供应商处购得,并可按照生产商的说明书操作。因为本发明的多核苷酸序列得自皮肤,所以它们可能编码在皮肤生长发育以及皮肤对组织损伤和炎症以及各种疾病状态反应中起重要作用的蛋白。某些多核苷酸包含编码信号序列或跨膜结构域的序列,它们使蛋白产物鉴定为分泌分子或受体。这样的蛋白产物可能是生长因子、细胞因子或其关连受体。几个多肽序列与已知的生物重要蛋白的相似性超过25%,并因此可能为具有相似生物功能的蛋白。具体来说,本发明多肽在诸如以下的过程中起重要作用诱导毛发生长;使皮肤干细胞分化为特化细胞类型;细胞迁移;细胞增殖和细胞-细胞相互作用。所述多肽对于保持组织完整性很重要,因此在诸如伤口愈合的过程中起重要作用。某些公开多肽在免疫应答中起调节剂作用,尤其是在知道免疫细胞在组织损伤过程中浸润皮肤,引起皮肤细胞生长分化以后。此外,许多多肽具有免疫活性,这使它们在所有疾病状态(不但是皮肤,而且包括机体的其它组织)中成为重要的治疗标靶。抗本发明多肽的抗体和涉及本发明多肽的小分子抑制剂还可以按照本发明用于调节免疫应答和治疗疾病。一方面,本发明提供使用一种或多种本发明多肽或多核苷酸治疗患者疾病的方法。本文使用的“患者”是指任何恒温动物,优选人类。在此方面,所述多肽或多核苷酸一般存在于药用组合物或疫苗中。药用组合物可以包含一种或多种多肽,其中每一种都可以包含一个或多个上述序列(或其变异体)以及生理学上可接受的载体。疫苗可以包含一种或多种上述多肽和非特异性免疫应答增强剂,诸如所述多肽搀入到其中的佐剂或脂质体。另一方面,本发明的疫苗或药用组合物可以含有编码一种或多种上述多肽的DNA,使得所述多肽可原位产生。在这样的疫苗和药用组合物中,所述DNA可以存在于本领域一般技术人员已知的各种传递系统中的任一种中,包括核酸表达系统以及细菌和病毒表达系统。合适的核酸表达系统包含在患者体内表达的必需DNA序列(诸如合适的启动子信号和终止子信号)。细菌传递系统包括给予在其细胞表面表达所述多肽的免疫原性部分的细菌(诸如Bacillus-Calmette-Guerin)。在一个优选实施方案中,可以使用病毒表达系统(例如痘苗病毒或其它痘病毒、反转录病毒或腺病毒)引入所述DNA,病毒表达系统可能涉及使用非致病性病毒或缺陷型可复制病毒。将DNA加入到所述表达系统中的技术是本领域众所周知的。所述DNA还可以是“裸”DNA,见例如Ulmer等,Science2591745-1749,1993介绍和Cohen,Science2591691-1692,1993的综述。可以通过将所述DNA包被在有效转运至细胞中的生物降解珠上,增加裸DNA的吸收。给予途径和频率以及给予剂量各个体之间不同。一般而言,所述药用组合物和疫苗可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如吸入)和口服给予。一般来说,一剂中的多肽量(或一剂所述DNA原位产生的多肽量)为每kg宿主体重约1pg-约100mg,通常为每kg宿主体重约10pg-约1mg,优选为每kg宿主体重约100pg-约1μg。合适的剂量范围将根据所述患者大小而有所变化,但通常为约0.1ml-约5ml。尽管可以在本发明的药用组合物中使用本领域一般技术人员已知的任一合适载体,但载体的类型将根据给予方式而有所变化。对于胃肠外给予,诸如皮下注射,所述载体优选包括水、盐水、醇、脂质、蜡或缓冲液。对于口服给予,可以使用以上载体中的任一种或固体载体,如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。还可以使用生物降解微球(例如聚乳酸半乳糖苷(galactide))作为本发明药用组合物的载体。合适的生物降解微球公开于例如美国专利第4,897,268和5,075,109号。在本发明的疫苗中可以使用各种佐剂中的任一种,以非特异性增强免疫应答。大多数佐剂包含设计用来保护抗原免受快速分解代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)和免疫应答的非特异性刺激剂(诸如类脂A、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)或结核分支杆菌(M.tuberculosis))。合适的佐剂可市售获得,如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(DifcoLaboratories,Detroit,Michigan),以及Merck佐剂65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,NewJersey)。其它合适的佐剂包括明矾、生物降解微球、单磷酰脂质A和QuilA。本发明的多核苷酸还可在遗传疾病的鉴定中用作组织标记、用作染色体标志或标记,以及用于设计寡核苷酸,以使用本领域周知技术(诸如Synteni(PaloAlto,California)提供的微阵列技术)检测表达模式。通过例如使用基于本发明序列的杂交探针或PCR引物筛选DNA表达文库,可利用本文公开的部分多核苷酸序列获得全长基因。另外,本发明提供的多核苷酸可用在检测生物活性、产生抗体、分离相应的配体或受体的测定中,用在定量检测作为抗炎药物的蛋白或相关对应配体或受体水平的测定中,以及用在用于皮肤、结缔组织和/或神经组织生长或再生的组合物中。实施例1从皮肤细胞表达文库中分离cDNA序列通过对构建自表1所示的特化啮齿类或人类皮肤细胞的cDNA表达文库进行高通量测序,获得本发明的cDNA序列。表1文库皮肤细胞类型来源DEPA真皮乳头大鼠SKTC角质细胞人HNFF新生儿包皮成纤维细胞人MEMS胚胎皮肤小鼠KSCL角质形成细胞干细胞小鼠TRAM移行放大细胞小鼠如下所述制备这些cDNA文库。真皮乳头的cDNA文库(DEPA)使得自大鼠触须(腮须)的真皮乳头细胞在培养基中生长,并使用确立的方案由这些细胞提取总RNA。采用Poly(A)QuikmRNA分离试剂盒(Stratagene,LaJolla,California),按照生产商的说明书,用利用TRIzol试剂(BRLLifeTechnologies,Gaithersburg,Maryland)分离的总RNA获得mRNA。然后通过使用λZAPcDNA文库合成试剂盒(Stratagene)经反转录合成由所述mRNA制备cDNA表达文库。角质细胞的cDNA文库(SKTC)使得自人类新生儿包皮的角质细胞(Mitra,R和Nikoloff,B,载于HandbookofKeratinocyteMethods,第17-24页,1994)在无血清KSFM(BRLLifeTechnologies)中生长,并与分化细胞(108细胞)一起收获。通过以10%的终浓度向培养基中加入胎牛血清使角质细胞分化,并在48小时后收获细胞。用TRIzol试剂(BRLLifeTechnologies)从两个细胞群中分离总RNA,并采用Poly(A)QuikmRNA分离试剂盒(Stratagene)由总RNA中获得mRNA。使用PCR-选择cDNA扣除试剂盒(Clontech,PaloAlto,California)富集分化角质细胞表达的cDNA。简而言之,由未分化角质细胞(“驱动者mRNA(drivermRNA)”)或分化角质细胞(“测试者mRNA(testermRNA)”)中获得mRNA,并用于合成cDNA。用RsaI分别消化两个cDNA群获得较短的平端分子。通过在所述cDNA末端连接不同的接头产生两个测试者群,用过量驱动者cDNA进行两轮连续杂交。所述接头只允许分化表达序列进行PCR扩增,然后所述序列连接入T-tailedpBluescript(Hadjeb,N和Berkowitz,GA,BioTechniques2020-221996)中,使得可对包含具有插入片段的载体的细胞进行蓝/白选择。分离白色细胞并利用其获得用于测序的质粒DNA。人类新生儿成纤维细胞的cDNA文库(HNFF)在培养基中培养得自人类新生儿包皮移植物的成纤维细胞,并使用确立的方案由这些细胞中提取总RNA。使用Poly(A)QuikmRNA分离试剂盒(Stratagene,LaJolla,California)并按照生产商的说明书由用TRIzol试剂(BRLLifeTechnologies,Gaithersburg,Maryland)分离的总RNA获得mRNA。然后使用λZAPcDNA文库合成试剂盒(Stratagene)由所述mRNA经反转录酶合成制备cDNA表达文库。小鼠胚胎皮肤的cDNA文库(MEMS)显微解剖交配后13天的Balb/c小鼠胚胎皮肤。在磷酸缓冲盐水中清洗胚胎皮肤,并利用QuickPrepMicromRNA纯化试剂盒(Pharmacia,Sweden)直接分离小鼠胚胎皮肤mRNA。然后使用mRNA按照以上DEPA文库制备所述制备cDNA文库。小鼠干细胞(KSCL)和移行放大(TRAM)细胞的cDNA文库从产后1-2天的新生Balb/c小鼠获取毛皮,清洗并在胰蛋白酶(BRLLifeTechnologies)中温育,以分离表皮和真皮。破坏表皮组织以分散细胞,然后在生长培养基中重悬浮,并在按照生产商(Pharmacia,Sweden)的方案制备的Percoll密度梯度上离心。使用罗丹明123(BertoncelloI,HodgsonGS和BradleyTR,ExpHematol,13999-1006,1985)标记沉淀细胞,用流式细胞仪(EpicsEliteCoulterCytometry,Hialeah,Florida)进行分析。然后用交叉反应抗大鼠CD29生物素单克隆抗体(Pharmingen,SanDiego,California;克隆Ha2/5)标记罗丹明标记的小鼠角质细胞的单细胞悬浮液。清洗细胞并与结合抗小鼠CD45藻红蛋白的单克隆抗体(Pharmingen;克隆30F11.1,10μg/ml)温育,然后用链霉抗生物素光谱红(SouthernBiotechnology,Birmingham,Alabama)标记。使用表格型(listmode)数据定义分选门(sortgate),鉴定了4个细胞群CD29明亮罗丹明灰暗CD45阴性细胞;CD29明亮罗丹明明亮CD45阴性细胞;CD29灰暗罗丹明明亮CD45阴性细胞;和CD29灰暗罗丹明灰暗CD45阴性细胞。分离、沉淀细胞,快速冷冻后储存在-80℃。此方案实施多次,以获得每种细胞群的足够制备cDNA文库的细胞数。已知皮肤干细胞和移行放大细胞表达CD29—整联蛋白β1链。白细胞特异性抗原CD45在分离皮肤干细胞和移行放大细胞时用作排除细胞的标记。角质细胞干细胞比移行放大细胞更有效地排出罗丹明染料。分选CD29明亮罗丹明灰暗的CD45阴性细胞群(推定为角质细胞干细胞;称为KSCL)和CD29明亮罗丹明明亮的CD45阴性细胞群(角质细胞移行放大细胞,称为TRAM),使用QuickPrepMicromRNA纯化试剂盒(Pharmacia,Sweden)由每个细胞群直接分离mRNA。然后使用所述mRNA按照以上DEPA文库的描述制备cDNA文库。使用PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivisionPrism377测序仪对上述cDNA文库进行高通量测序,获得cDNA序列。实施例2分离cDNA序列的特征使用计算机算法FASTA和/或BLASTN比较分离的cDNA序列和EMBLDNA数据库序列。使用计算机算法FASTX和/或BLASTP比较对应的推测蛋白序列(6个读框中的每一个读框的DNA都被翻译成蛋白)和SwissProt数据库序列。1998年3月21日对SEQIDNO1-119提供的DNA序列与EMBLDNA数据库序列进行对比(使用FASTA),以及SEQIDNO120-197提供的氨基酸序列与SwissProt数据库序列进行对比(使用FASTX)。1998年10月7日对SEQIDNO198-274提供的DNA序列与EMBLDNA数据库序列进行对比(使用BLASTN),以及SEQIDNO275-348提供的氨基酸序列与SwissProt数据库序列进行对比(使用BLASTP)。1999年1月23日对SEQIDNO349-372提供的DNA序列与EMBLDNA数据库序列进行对比(使用BLASTN),以及SEQIDNO373-398提供的氨基酸序列与SwissProt数据库序列进行对比(使用BLASTP)。2000年4月23日对SEQIDNO418-455提供的多核苷酸序列与EMBLDNA数据库序列进行对比(使用BLASTN),以及SEQIDNO456-463提供的多肽序列与SwissProt数据库序列进行对比(使用BLASTP)。用计算机分析分离的cDNA序列及其对应的推测蛋白序列中存在的鉴定分泌分子的信号序列。SEQIDNO1-44、198-238、349-358、399、418-434和440-449提供在序列推测起始位点具有信号序列的分离cDNA序列。使用上述FASTA或BLASTN计算机算法测定SEQIDNO1-6、198-199、349-352、354、356-358和440的cDNA序列与EMBL数据库序列的同一性小于75%(如上所述测定)。使用上述FASTX或BLASTP计算机算法测定SEQIDNO120-125、275-276、373-380和382的推测氨基酸序列与SwissProt数据库序列的同一性小于75%(如上所述测定)。对某些分离的部分cDNA序列的进一步测序使得分离了SEQIDNO7-14、200-231、372、418-422、441-448的全长cDNA序列。分别以SEQIDNO126-133、277-308和396提供由SEQIDNO7-14、200-231和372的cDNA序列编码的氨基酸序列。SEQIDNO418-422的cDNA序列与SEQIDNO7和11-14的cDNA序列编码相同的氨基酸序列,分别为SEQIDNO126和130-133。使用上述计算机算法FASTA或BLASTN比较所述全长cDNA序列和EMBL数据库序列,结果显示与已知序列的同一性小于75%(如上所述测定)。使用上述计算机算法FASTX或BLASTP比较SEQIDNO126-133和277-308提供的氨基酸序列与SwissProt数据库序列,结果显示与已知序列的同一性小于75%(如上所述测定)。使用计算机算法FASTA数据库比较对应于SEQIDNO15-23的cDNA序列的推测氨基酸序列和EMBL数据库序列,结果显示与已知序列的同一性小于75%(如上所述测定)。SEQIDNO134-142提供这些推测的氨基酸序列。对某些分离的部分cDNA序列的进一步测序使得分离出SEQIDNO24-44、232-238、423-434和449全长cDNA序列。分别以SEQIDNO143-163、309-315和456提供由SEQIDNO24-44、232-238和429的cDNA序列编码的氨基酸序列。SEQIDNO423-428、430-434和449的cDNA序列与SEQIDNO27-29、34、35、37、40-44和238的cDNA序列编码相同的氨基酸序列,分别为SEQIDNO146-148、153、154、156、159-163和315。如上所述使用计算机算法FASTX测定这些氨基酸序列与SwissProt数据库已知序列的同一性小于75%。对与已知表达序列标志(EST)或公共数据库中的其它DNA序列的同一性小于75%的分离cDNA序列,或其对应的与已知蛋白序列的同一性小于75%的推测蛋白序列,用计算机分析其存在的编码推定膜结合分子的跨膜结构域。SEQIDNO45-63、239-253、359-364、400-402、435、436、450-452和455提供在序列中具有一个或多个跨膜结构域的分离cDNA序列。使用FASTA或BLASTN计算机算法发现SEQIDNO45-48、239-249、359-361、363、450、451和455的cDNA序列与EMBL数据库序列的同一性小于75%(如上所述测定)。使用FASTX或BLASTP数据库发现由SEQIDNO45-48、239-249、359-361、363、450和451的cDNA序列编码的氨基酸序列(分别以SEQIDNO164-167、316-326、383、385-388、407-408、460和461提供)与SwissProt数据库序列的同一性小于75%(如上所述测定)。SEQIDNO455的cDNA序列与SEQIDNO359的cDNA序列编码相同的氨基酸序列,即SEQIDNO383。比较对应于SEQIDNO49-63、250-253、436和452cDNA序列的氨基酸序列与SwissProt数据库序列,结果显示与已知序列的同一性小于75%(如上所述测定)。分别以SEQIDNO168-182、327-330、457和462提供这些推测氨基酸序列。使用自动化检索程序筛选编码据报道具有治疗和/或诊断用途的分子的序列,测定如以上实施例1所述分离的某些cDNA序列,其编码的推断蛋白序列似乎是已知蛋白家族成员。在本文中家族成员定义为翻译多肽与蛋白家族的已知蛋白或成员的同一性至少为25%。SEQIDNO64-76、254-264、365-369、403、437-439、453和454提供这些cDNA序列。分别以SEQIDNO183-195、331-341、389-393、409、458、459和463提供由SEQIDNO64-76、254-264、365-369、403、438、439和453的cDNA序列编码的氨基酸序列。SEQIDNO437和454的cDNA序列与SEQIDNO68和262的cDNA序列编码相同的氨基酸序列,分别为SEQIDNO187和339。使用FASTA或BLASTN计算机算法显示SEQIDNO64-68、254-264、365-369、453和454的cDNA序列与EMBL数据库序列的同一性小于75%(如上所述测定)。同样,显示SEQIDNO183-195、331-341、389-393、458、459和463的氨基酸序列与SwissProt数据库序列的同一性小于75%。根据与已知蛋白的相似性,以下提供由SEQIDNO64-76、254-264、365-369、403、438、439、453和454的DNA序列编码的各蛋白功用。表2新型蛋白的功能因此,这些分离序列编码影响几种细胞类型的生长、分化和活化的蛋白。通常可以将它们开发成治疗和诊断皮肤损伤、癌症、生长发育缺陷以及炎症性疾病的药物。SEQIDNO77-117、265-267和404-405的多核苷酸序列在角质细胞干细胞(KSCN)或移行放大细胞(TRAM)中差异表达,其根据是这些序列独自出现在以上两个文库任一个中的次数;在一个文库中超过9次,而在另一个文库中没有(AudicS.和ClaverieJ-M,GenomeResearch,7986-995,1997)。使用上述计算机算法FASTA或BLASTN测定,SEQIDNO77-89、265-267和365-369的序列与EMBL和SwissProt数据库序列的同一性小于75%。这些多核苷酸序列编码的蛋白用作鉴定和分离这些细胞类型的标志,而抗这些蛋白的抗体可有效用于从细胞的复杂混合物中分离和富集这些细胞。干细胞群独有的分离多核苷酸及其相应蛋白可用作药物靶,以改变对皮肤细胞生长和分化的调节,或用于基因打靶以将特异性治疗分子转运至皮肤干细胞。实施例3分离和表征muTR1的人类同源物如以上实施例1所述获得muTR1(SEQIDNO68)的人同源物,通过筛选50,000pfu寡脱氧胸苷引导的Hela细胞cDNA文库进行分离。使用标准分子生物学技术(Sambrook,J,Fritsch,EF和Maniatis,T编著,MolecularCloningALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNewYork,1989)进行噬菌斑转移、杂交和筛选。SEQIDNO118提供测定的分离人同源物(huTR1)cDNA序列,SEQIDNO196提供对应的推测氨基酸序列。使用对应于SEQIDNO118编码区的核苷酸1-459的[α32P]-dCTP标记的双链cDNA探针筛选所述文库。huTR1多核苷酸序列具有类似于转化生长因子-α的区,表明该蛋白功能类似于表皮生长因子(EGF)。此EGF样蛋白用于刺激角质细胞生长和迁移以及抑制上皮性癌细胞生长。因此这种新基因及其编码蛋白可用作治疗创伤的药物和上皮性癌细胞的调节剂。应用RNA印迹分析RNA转录物通过用包含SEQIDNO118的核苷酸96-273并用[α32P]-dCTP放射性标记的探针探测人组织mRNA印迹(Clontech),进行RNA分析,以测定huTR1mRNA的大小和分布。如Sambrook等(同上)所述进行预杂交、杂交、清洗和探针标记。huTR1mRNA的大小为3.5-4kb,观察到其在心脏和胎盘中最丰富,而在脾、胸腺、前列腺和卵巢中观测到的表达水平较低(图1)。huTR1mRNA在心脏和胎盘中的高丰度表明huTR1在血管形成或保持中起作用,因为与机体的其它组织相比心脏和胎盘组织的血管丰度增加,因此内皮细胞丰度也增加。这再次证明huTR1在肿瘤血管发生和血管形成方面的作用。其支持依据是转化生长因子-α和EGF能够诱导血管重产生(Schreiber等,Science2321250-1253,1986)并刺激内皮细胞合成DNA(Schreiber等,Science2321250-1253,1986)及其在各种人类肿瘤中的过量表达。纯化muTR1和huTR1将编码muTR1氨基酸53-103(SEQIDNO342)的muTR1多核苷酸177-329(SEQIDNO268)以及编码huTR1的氨基酸54-104(SEQIDNO343)的huTR1多核苷酸208-360(SEQIDNO269)克隆入细菌表达载体pProEXHT(BRLLifeTechnologies),该载体含有一个细菌前导序列和N末端6×组氨酸标记。按照Sambrook等所述(同上)将这些构建物转化入感受态XL1-Blue大肠杆菌中。在包含100μg/ml氨苄青霉素的Terrific肉汤培养基中于37℃过夜培养这些重组XL1-Blue大肠杆菌的引子培养物。使培养物旋转减慢并将其接种到500ml包含100μg/ml氨苄青霉素的Terrific肉汤培养基。培养物生长至细胞OD595达到0.4至0.8之间,然后加入IPTG至1mM。过夜诱导所述细胞,离心收集细菌。muTR1多肽(SEQIDNO342,称为muTR1a)和huTR1多肽(SEQIDNO343,称为huTR1a)二者都表达在不溶性包涵体中。为了纯化muTR1a多肽和huTR1a多肽,在裂解缓冲液(20mMTris-HClpH8.0,10mMβ巯基乙醇,1mMPMSF)中重悬浮细菌细胞沉淀。向裂解细胞中加入1%NP40,并在冰上温育所述混合物10分钟。进一步在冰上以95W、4×15秒超声波破碎裂解物,然后以14,000rpm离心15分钟沉淀包涵体。获得的沉淀物在包含0.5%CHAPS(w/v)的裂解缓冲液中重悬浮,在冰上超声5-10秒。将该混合物储存在冰上1小时,以14,000rpm于4℃离心15分钟,弃去上清液。如前所述,使沉淀物再次重悬浮在包含0.5%CHAPS(w/v)的裂解缓冲液中、超声、离心和去除上清液。沉淀物在增溶缓冲液(6M盐酸胍、0.5MNaCl、20mMTrisHCl、pH8.0)中重悬浮,以95W、4×15秒超声处理,然后以14,000rpm于4℃离心20分钟以除去碎片。上清液在用前储存于4℃。使用镍螯合琼脂糖凝胶柱(AmershamPharmacia,Uppsala,Sweden)并按照生产商推荐的方法,利用包含在细菌前导序列中的N末端6×组氨酸标记纯化muTR1a和huTR1a多肽。为了重折叠纯化后的蛋白,在1小时内于4℃将所述蛋白溶液加入至其5倍体积的重折叠缓冲液(1mMEDTA、1.25mM还原谷胱甘肽、0.25mM氧化谷胱甘肽、20mMTris-HCl,pH8.0)中。在这段时间内快速搅拌重折叠缓冲液,并且于4℃持续搅拌过夜。然后使用标准方法经超滤浓缩重折叠蛋白。muTR1a和huTR1a多肽的生物活性muTR1和huTR1是EGF家族(包括EGF、TGFα、epiregulin等)的新成员。已知这些生长因子起EGF受体配体的作用。EGF受体激活途径有许多文献资料证明。配体与EGF受体一旦结合,则发生一连串事件,包括已知为MAP激酶的蛋白的磷酸化。因此MAP激酶磷酸化可用作EGF受体激活的标记。存在识别2种MAP激酶蛋白-ERK1和ERK2磷酸化形式的单克隆抗体。为了检测纯化的muTR1a和huTR1a多肽是否起EGF受体配体的作用,将人表皮癌细胞系A431(美国典型培养物保藏中心,No.CRL-1555,Manassas,Virginia)细胞接种到6孔培养板中,血清饥饿24小时,然后在无血清条件下用纯化的muTR1a或huTR1a刺激5分钟。作为阳性对照,以相同的方式用10-100ng/ml的TGF-α或EGF刺激细胞。作为阴性对照,用包含不同量LPS的PBS刺激细胞。立即裂解细胞,用Bradford测定法检测裂解液蛋白浓度。将15μg各样品蛋白加样于12%SDS-PAGE凝胶。然后使用标准技术将所述蛋白转移至PVDF膜。对于蛋白质印迹,在封闭缓冲液(10mMTris-HCl、pH7.6,100mMNaCl,0.1%Tween-20,5%脱脂奶)中于室温温育膜1小时。在封闭缓冲液中加入兔抗活性MAP激酶pAb(Promega,Madison,Wisconsin)至50ng/ml,并于4℃温育过夜。在无脱脂奶的封闭缓冲液中清洗膜30分钟,然后在室温下与在封闭缓冲液中稀释3500倍的抗兔IgG-HRP抗体温育1小时。在无脱脂奶的封闭缓冲液中清洗膜30分钟,然后在无脱脂奶和0.1%Tween-20的封闭缓冲液中再清洗5分钟。然后把膜在ECL试剂中暴露2分钟,接着放射自显影5-30分钟。如图2所示,发现muTR1a和huTR1a二者均相对于本底水平诱导ERK1和ERK2磷酸化,这表明muTR1和huTR1起细胞表面受体配体的作用,激活MAP激酶信号转导途径,可能是EGF受体。如图11所示,还证实与阴性对照相比,huTR1a诱导培养CV1/EBNA肾上皮细胞的ERK1和ERK2磷酸化。如上所述进行这些测定。表明huTR1a起细胞表面受体配体的作用,激活MAP激酶信号转导途径,可能是HeLa和CV1/EBNA细胞的EGF受体。如下测定muTR1a刺激新生儿阴茎包皮(NE)角质细胞生长的能力。在补加牛垂体提取物(BPE)和表皮生长因子(EGF)的KSFM(BRLLifeTechnologies)中培养取自外科手术废弃物的NF角质细胞。在96孔平底板中于0.1ml未补加的KSFM中进行测定。将MuTR1a、人转化生长因子α(huTGFα)或PBS-BSA滴定至板中,并向每孔中加入1×103NF角质细胞。在5%CO2气氛下于37℃温育所述板5天。如前所述(J.Imm.Meth.93157-165,1986)通过MTT染料还原测定细胞生长的程度。如图3所示,muTR1a和阳性对照人TGFα二者都刺激NF角质细胞生长,而阴性对照PBS-BSA没有此作用。如下测定muTR1a和huTR1a刺激转化人角质细胞系HaCaT生长的能力。在96孔平底板中于0.1ml补加0.2%FCS的DMEM(BRLLifeTechnologies)中进行测定。将muTR1a、huTR1a和PBS-BSA滴定至板中,并向每孔中加入1×103HaCaT细胞。在含10%CO2的大气中于37℃温育所述板5天。如前所述(J.Imm.Meth.93157-165,1986)通过MTT染料还原测定细胞生长的程度。如图4所示,muTR1a和huTR1a二者都刺激HaCaT细胞生长,而阴性对照PBS-BSA没有此作用。如下测定muTR1a和huTR1a抑制A431细胞生长的能力。如前所述(J.Cell.Biol.931-4,1982)滴定多肽MuTR1a(SEQIDNO342)和huTR1a(SEQIDNO343)以及PBS-BSA,并如前所述(J.Imm.Meth.93157-165,1986)用MTT染料还原测定细胞死亡。发现muTR1a和huTR1a二者都抑制A431细胞的生长,而阴性对照PBS-BSA不能(图5)。这些结果表明muTR1和huTR1刺激角质细胞生长和迁移、抑制上皮性癌细胞的生长,并在肿瘤血管发生和血管形成中起作用。因此该新基因与其编码蛋白可开发成治疗创伤、血管发生的药物和上皮性癌症的调节物。上调huTR1和mRNA表达在10厘米培养皿中以每皿1×106细胞的浓度接种HeLa细胞(人宫颈腺癌)。培养过夜后,去除培养基并更换为包含100ng/ml的muTR1、huTR1、huTGFα或作为阴性对照的PBS的培养基。18小时后,去除培养基并在2mlTRIzol试剂(GibcoBRLLifeTechnologies,Gaithersburg,Maryland)中裂解细胞。按照生产商的说明书分离总RNA。为鉴定cDNA样品的huTR1mRNA水平,在标准PCR反应中使用1μlcDNA。30个循环后,由每个PCR反应取出5μl,在1.5%琼脂糖凝胶上进行分离。通过溴化乙锭染色对条带显色。由图12可见,与用阴性对照PBS刺激的细胞相比,小鼠TR1和人TR1都上调huTR1mRNA水平。而且,TGFα也可以上调huTR1mRNA水平。这些结果表明,TR1能够维持其自身的mRNA表达以及随后的蛋白表达,因此预期其能对高水平细胞因子表达参与疾病病理学的疾病(如牛皮癣)发展起作用。而且,因为TGFα可以上调huTR1表达,所以TR1mRNA的上调对于TGFα的作用模式可能是关键性的。血清效应元件报导基因测定血清效应元件(SRE)是生长调节许多细胞立即早期基因必需的启动子元件。已有研究证实,MAP激酶信号转导途径可调节SRE活性。本实验室开发了两个细胞系,即包含8个SV40启动子上游SRE和荧光素酶报导基因的PC12(大鼠嗜铬细胞瘤-神经瘤)和HaCaT(人转化角质细胞)。在96孔板的每孔中等分5×103细胞,并使它们在其各自的培养基中生长24小时。在5%胎牛血清(FBS)的D-MEM中培养HaCaTSRE细胞,其中在D-MEM中补加2mML-谷氨酸盐(Sigma,St.Louis,Missouri)、1mM丙酮酸钠(BRLLifeTechnologies)、0.77mML-天冬酰胺(Sigma)、0.2mM精氨酸(Sigma)、160mM青霉素G(Sigma)、70mM二氢链霉素(RocheMolecularBiochemicals,Basel,Switzerland)和0.5mg/ml遗传霉素(BRLLifeTechnologies)。在5%胎牛血清的HamF12培养基中培养PC12SRE细胞,其中HamF12培养基补加0.4mg/ml遗传霉素(BRLLifeTechnologies)。然后将培养基改变为0.1%FBS并再温育24小时。然后从1μg/ml起逐步增加TR1刺激细胞。使用单一剂量的100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(R&DSystems,Minneapolis,Minnesota)或10ng/ml的表皮生长因子(BRLLifeTechnologies)作为阳性对照。在存在muTR1或阳性对照的情况下温育细胞6小时,在PBS中清洗两次,并用40μl裂解缓冲液(Promega)裂解细胞。转移10μl至96孔培养板,并利用Victor2荧光计(Wallac)经直接注射将10μl荧光素酶底物(Promega)加入每孔中,震摇所述板并以3×1秒的间隔读取每孔的发光。使用以下方程计算SRE诱导倍数SRE诱导倍数=激动剂平均相对发光/阴性对照平均相对发光。如图13所示,muTR1激活PC-12(图13A)和HaCaT(图13B)细胞二者的SRE。这表明HaCaT和PC-12细胞能够对muTR1蛋白产生反应并激发反应。在HaCaT细胞的情况下,该反应是一种生长反应。在PC-12细胞的情况下,该反应可以是生长、生长抑制、分化或迁移反应。因此,TR1对于神经细胞发育或其分化为专化神经亚群可能很重要。TR1可能对于神经肿瘤的发生和发展也很重要。EGF受体抑制测定如前所述进行HaCaT生长测定,但是进行了以下改进。在所述培养基中加入EGF和TR1的同时,以62.5ng/ml的浓度加入抗-EGF受体(EGFR)抗体(Promega,Madison,Wisconsin)或阴性对照抗体小鼠IgG(PharMingen,SanDiego,California)。由图14可见,阻断EGFR功能的抗体抑制TR1对HaCaT细胞的促有丝分裂性。这表明EGFR对于TR1促有丝分裂信号传递到HaCaT细胞是至关重要的。TR1可以直接结合EGF受体。TR1也可以结合能够与EGFR异二聚化的EGFR家族任何其它成员(例如ErbB-2、-3和/或-4)。HuTR1的剪接变异体按照相同方法由与huTR1相同的文库分离huTR1变异体。称为huTR1-1的序列(也叫做TR1δ)是huTR1的剪接变异体,由去除氨基酸15-44和87-137的huTR1ORF组成。这些缺失导致缺失了部分信号序列和其后的氨基末端接头序列、EGF基元的第二个半胱氨酸残基之后的残基以及随后的跨膜结构域。然而,半胱氨酸残基147(huTR1ORF编号)可以替代缺失的半胱氨酸并因此可能使二硫桥未受影响。因此,huTR1-1是huTR1的胞内形式。它起huTR1或其它EGF家族成员(包括EGF和TGFα)的激动剂或拮抗剂作用。SEQIDNO412给出了huTR1-1的测定核苷酸序列,而对应的氨基酸序列以SEQIDNO415提供。利用标准方法由HeLa细胞分离的RNA制备cDNA,通过PCR由所述cDNA的第一条链分离huTR1的其它4种剪接变异体。huTR1的这些剪接变异体称为TR1-2(也叫做TR1β)、TR1-3(也叫做TR1γ)、TR1ε和TR1φ。TR1-2由去除氨基酸95-137的huTR1ORF组成。该缺失导致缺失了跨膜结构域。因此TR1-2是huTR1的一种分泌形式,并以等于或高于huTR1的亲合性结合TR1受体,因为EGF结构域保持完整。它起huTR1或其它EGF家族成员(包括EGF和TGFα)的激动剂或拮抗剂作用。SEQIDNO410给出了TR1-2的测定cDNA序列,而SEQIDNO413提供对应的氨基酸序列。TR1-3由去除氨基酸36-44和86-136的huTR1ORF组成。这些缺失导致缺失了部分氨基酸末端接头序列、EGF基元的第二个半胱氨酸之后的残基以及随后的跨膜结构域。然而,半胱氨酸残基147(huTR1ORF编号)可以替代缺失的半胱氨酸并因此可能使二硫桥未受影响。因此,TR1-3也是huTR1的一种分泌形式,并起huTR1或其它EGF家族成员(包括EGF和TGFα)的激动剂或拮抗剂的作用。SEQIDNO411给出了TR1-3的测定cDNA序列,而对应的氨基酸序列为SEQIDNO414。TR1ε由去除氨基酸86-136的huTR1ORF组成。该缺失导致缺失了EGF基元第二个半胱氨酸之后的残基和跨膜结构域。然而,半胱氨酸残基147(huTR1ORF编号)可以替代缺失的半胱氨酸并因此可能使二硫桥未受影响。因此,TR1ε也是huTR1的一种分泌形式,并起huTR1或其它EGF家族成员(包括EGF和TGFα)的激动剂或拮抗剂的作用。SEQIDNO371给出了TR1ε的测定cDNA序列,而对应的推测氨基酸序列由SEQIDNO395提供。TR1φ由去除氨基酸36-44和95-136的huTR1ORF组成。这些缺失导致缺失了部分氨基末端接头序列和跨膜结构域。因此,TR1φ是huTR1的一种分泌形式,并以等于或高于huTR1的亲合性结合TR1受体,因为EGF结构域保持完整。它起huTR1或其它EGF家族成员(包括EGF和TGFα)的激动剂或拮抗剂的作用。SEQIDNO416给出了TR1φ的测定核苷酸序列,而对应的推测氨基酸序列由SEQIDNO417提供。实施例4鉴定、分离和表征DP3使用标准细胞生物学技术分离大鼠真皮乳头和爪垫成纤维细胞,使用得自培养的所述细胞的mRNA通过差异展示RT-PCR(改良自LiangP和PardeeAB,Science257967-071,1992)鉴定叫做DP3的部分cDNA片段。用[α32P]-dCTP标记该双链cDNA,并使用其通过筛选400,000pfu寡脱氧胸苷引导的大鼠真皮乳头cDNA文库鉴定全长DP3克隆。SEQIDNO119提供测定的全长DP3cDNA序列,而对应的氨基酸序列由SEQIDNO197提供。使用标准分子生物学技术进行噬菌斑转移、杂交和筛选。实施例5分离和表征KS1通过RNA印迹分析RNA转录物通过用由muKS1的核苷酸268-499组成、用[α32P]-dCTP放射性标记的探针探测小鼠组织mRNA印迹,进行RNA分析,以测定muKS1(SEQIDNO263)mRNA的大小和分布。如Sambrook等(同上)所述进行预杂交、杂交、清洗和探针标记。muKS1mRNA的大小为1.6kb,并观察到其在大脑、肺或任何肌肉以及心脏中最丰富。还可在下消化道(lowerintestine)、皮肤、骨髓和肾脏中检测到表达。睾丸、脾、肝、胸腺、胃未见可检测信号。muKS1的人类同源物使用muKS1(SEQIDNO263)检索EMBL数据库(Release50,1998年六月更新),以鉴定人EST同源物。前三个同源物为以下EST登录号AA643952、HS1301003和AA865643。它们285个核苷酸、283个核苷酸和285个核苷酸的同源性分别为92.63%、93.64%和94.035%。翻译时鉴定AA643952和HS1301003中的移码。组合全部三个EST鉴定huKS1(SEQIDNO270)和翻译的多肽SEQIDNO344。对比muKS1和huKS1多肽显示96个氨基酸的同一性为95%。鉴定KSCL009274cDNA序列由未成熟小鼠角质细胞构建直接克隆的cDNA文库,并对其进行高通量测序。命名为KDCL009274克隆的序列数据显示,与大鼠巨噬细胞炎性蛋白-2B(MIP-2B)在72个氨基酸上的同一性为35%,而与其鼠类同源物在72个氨基酸上的同一性为32%。1633bp的插入片段(SEQIDNO464;图15A)包含一个300bp的可读框和202bp的5′非翻译区以及1161bp的3′非翻译区。聚腺苷酸信号AATAAA存在于聚腺苷酸尾上游的19个碱基对。预期成熟多肽(SEQIDNO465)长度为77个氨基酸,包含4个无ELR基序的保守半胱氨酸。根据疏水性情况预测了GLY22和Ser23之间的推定信号肽切割位点。此推定趋化因子与KS1相同。使用BLAST程序对EMBL数据库筛选全长序列,结果显示在核苷酸水平上分别与人EST克隆AA643952、AA865643和HS1301003具有一定的同一性。近来描述的人CXC趋化因子BRAK在蛋白质水平上与KS1具有一定的同一性。图15B对比了KS1(在图15B中叫做KLF-1)、BRAK和其它鼠α-趋化因子。使用Phylip程序确定KS1和其它α-趋化因子家族成员之间的系统发育关系。KS1和BRAK显示与其它α-趋化因子的高度趋异性,这支持在多重对比中显示的较低同源性。muKS1和huKS1的细菌表达和纯化将编码muKS1多肽的氨基酸23-99(SEQIDNO345)的muKS1多核苷酸269-502(SEQIDNO271)以及编码huKS1多肽的氨基酸19-95(SEQIDNO346)的huKS1多核苷酸55-288(SEQIDNO272)克隆入细菌表达载体pET-16b(Novagen,Madison,Wisconsin),该载体含有一个细菌前导序列和N末端6×组氨酸标记。按照Sambrook等所述(同上)将这些构建物转化入感受态XL1-Blue大肠杆菌中。在包含100μg/ml氨苄青霉素的NZY肉汤培养基(Gibco-BRLLifeTechnologies)中于37℃培养包含SEQIDNO271(muKS1a)和SEQIDNO272(huKS1a)的重组BL21(DE3)大肠杆菌(Novagen)的引子培养物。使培养物旋转减慢,将其接种到800mlNZY肉汤培养基和100μg/ml氨苄青霉素中。培养物生长至细胞OD595达到0.4至0.8之间。用1mMIPTG诱导细菌表达3小时。细菌表达产生约15kDa的muKS1a和huKS1a诱导条带。muKS1a和huKS1a都表达在不溶性包涵体中。为了纯化所述多肽,在裂解缓冲液(20mMTris-HClpH8.0,10mMβ巯基乙醇,1mMPMSF)中重悬浮细菌细胞沉淀。向裂解细胞中加入1%NP-40,并在冰上温育所述混合物10分钟。在冰上以95W、4×15秒超声波进一步破碎裂解物,然后以18,000rpm离心15分钟,以沉淀所述包涵体。在包含0.5%CHAPS(w/v)的裂解缓冲液中重悬浮包含所述包涵体的沉淀,超声5-10秒。将该混合物保存在冰上1小时,以14,000rpm于4℃离心15分钟,并弃去上清液。如前所述,沉淀物再一次在包含0.5%CHAPS(w/v)的裂解缓冲液中重悬浮、超声、离心和去除上清液。沉淀在增溶缓冲液(6M盐酸胍、0.5MNaCl、20mMTrisHCl、pH8.0)中重悬浮,以95W、4×15秒超声处理,并以18,000rpm和4℃离心10分钟以除去碎片。上清液储存于4℃。使用镍螯合琼脂糖凝胶柱(AmershamPharmacia,Uppsala,Sweden)并按照生产商的方法,利用包含在所述细菌前导序列中的N末端6×组氨酸标记纯化muKS1a和huKS1a。蛋白在所述柱上纯化两次,以降低内毒素污染。为了纯化后蛋白重折叠,于4℃将所述蛋白溶液在4M-2M尿素梯度的20mMtris-HClpH7.5+10%甘油溶液中透析过夜。然后将所述蛋白对2升20mMTris-HClpH7.5+10%(w/v)甘油再透析两次。获得的制备物经SDS-PAGE测定,其纯度超过95%。用鲎变形细胞溶解物检测试剂盒(BIOWhittaker,Walkersville,MD)测定纯化蛋白的内毒素污染情况。内毒素水平小于0.1ng/μg蛋白。对KS1胰蛋白酶肽进行内部氨基酸测序。通过在HEK293T细胞中表达产生Fc融合蛋白。用35μgKLF-1plGFcDNA转染每瓶6×106细胞,产生200ml含Fc的上清液。使用AffiprepA蛋白树脂(0.3ml柱,Biorad)通过层析分离所述Fc融合蛋白。上样后,用15mlPBS清洗柱,接着用5ml50mM柠檬酸钠pH5.0清洗。然后用6柱体积的50mM柠檬酸钠pH2.5洗脱蛋白,用含60μl2MTris-HClpH8.0的试管收集0.3ml流分。通过SDS-PAGE分析流分。对muKS1和huKS1的肽测序在聚丙烯酰胺凝胶上分离细菌表达的muKS1和huKS1,并鉴定出15kDa的诱导条带。muKS1的预测大小为9.4kDa。为获得15kDa条带的氨基酸序列,通过SDS-PAGE分离20μg重组muKS1和huKS1,并电印迹在ImmobilonPVDF膜(Millipore,Bedford,Massachusetts)上。由新西兰奥克兰大学的蛋白质测序小组对muKS1和huKS1胰蛋白酶肽进行内部氨基酸测序。SEQIDNO397和398分别给出了muKS1和huKS1的测定氨基酸序列。这些氨基酸序列证实,所述测定序列与由cDNA序列推定的氨基酸序列相同。以前报导了其它趋化因子的大小差异(RichmondA,BalentienE,ThomasHG,FlaggsG,BartonDE,SpiessJ,BordoniR,FranckeU,DerynckR,“结构上与β-血小板球蛋白相关的生长因子的黑素瘤生长刺激活性的分子特征和染色体作图”,EMBOJ.72025-2033,1988;LiaoF,RabinRL,YannelliJR,KoniarisLG,VanguriP,FarberJM,“人Nig趋化因子生物化学和功能特征”,J.Exp.Med.1821301-1314,1995)。使用DNASIS(HITACHISoftwareEngineering,SanFrancisco,California)预测这些蛋白的等电聚焦点为10.26。表达并用A蛋白亲合层析柱纯化的重组Fc标记KS1是一种均一蛋白,分子量为42kDa。氧化爆发测定氧化爆发测定用于测定反应细胞类型。将1×107PBMC细胞重悬浮在5mlHBSS、20mMHEPES、0.5%BSA中,并于37℃和5μl5mM二乙酸二氯-二氢荧光素(H2DCFDA,MolecularProbes,Eugene,Oregon)温育30分钟。将2×105H2DCFDA标记的细胞加样于96孔平底培养板的每个孔中。同时向平底板的孔中加入每种激动剂各10μl,使得最终的浓度为100ng/ml(使用的fMLP为10μM)。然后用Victor21420多标记计数器(Wallac,Turku,Finland)以485nm的激发波长和535nm的发射波长对所述板读数。在60分钟内以5分钟的间隔检测相对荧光。在PBMC中鉴定出明显的呼吸爆发,对照处理细胞(TR1)和100ng/mlmuKS1之间相差2.5倍(图8)。使用人基质衍生因子-1α(SDF1α)(100ng/ml)和10μM甲酰-Met-Leu-Phe(fMLP)作为阳性对照。趋化性测定使用48孔Boyden室(NeuroProbeInc.,CabinJohn,Maryland)按照生产商的方法测试muKS1作用下的细胞迁移。简而言之,在HBSS、20mMHEPES、0.5%BSA中稀释激动剂,并将其加入趋化室的底孔中。在相同的缓冲液中以3×105细胞/50μl重悬浮THP-1细胞。用无PVP聚碳酸酯滤膜分开顶孔和底孔,滤膜孔径为5μm(单核细胞)或3μm(淋巴细胞)。将细胞加入到顶孔,所述室在5%CO2湿润培养箱中于37℃温育2小时(单核细胞)和4小时(淋巴细胞)。温育后,固定滤膜,从上表面刮下细胞。然后用Diff-Quick(DadeInternationalInc.,Miami,Florida)染色滤膜,并在5个随机选择的高倍视野中计数迁移细胞。结果表示为迁移指数(测试迁移细胞数除以对照迁移细胞数)。使用此测定,测试muKS1对T细胞和THP
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