专利名称：用于化妆品和医疗皮肤病学的结合了透明质酸钠片段和类维生素a的局部组合物的制作方法 透明质酸盐(HA)是细胞外基质的主要组分。与在所谓“硬”组织如软骨中存在的糖胺聚糖如软骨素硫酸相对，它特别地在所谓的“软”结缔组织中存在。因此，发现这种物质在皮肤中以显著量存在。HA是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的重复单元组成的非硫酸化线性糖胺聚糖(Tammi R.，Agren UM.，Tuhkanen AL.，Tammi M.Progress in Histochemistry & Hyaluronan metabolism in skin.29(2)1-81，1994)。在正常皮肤中，HA基本由真皮成纤维细胞和表皮角质化细胞合成(Tammi R.，已经引用的文献)。通过这些带有负电荷的残基，HA起水泵的作用，这种作用可以保持皮肤的弹性。HA的主要作用是控制结缔组织的食品废料、激素、维生素和无机盐的扩散，并清洁可诱导炎性反应的代谢废物。随年龄的增长，HA的数量和它的聚合度降低，导致结缔组织中保留的水量的降低。皮肤然后就经历老化过程，这个过程导致纤维化的增加，并导致弹性纤维含量的下降。在正常人皮肤中，HA以高分子量(600,000-1,000,000Da)的聚合物形式存在。皮肤中HA的生理降解通过(i)由角质化细胞通过CD44的内化和(ii)由透明质酸酶进行的细胞内断裂而变成适当尺寸片段(60,000-300,000Da)。断裂的HA由角质化细胞释放，通过基膜，并直接在淋巴管中释放(Tammi R.等人，已经引用的文献)。在发炎状况下，在动物中表现为具有低分子量的HA形式的累积。在发炎期间，血小板趋化因子如纤维蛋白刺激成纤维细胞的流入和活化，成纤维细胞通过透明质酸酶的分泌降解HA，导致小HA片段的高组织浓度。这些小HA片段的产生也通过不同的机理如通过粒细胞释放的氧反应性物质的解聚，或在由紫外线照射的皮肤中，或低分子量片段的重新合成。几个研究已经说明高和低分子量HA可对细胞和组织具有不同的生物效应(McKee CM.，Penno MB.，Cowman M.，BurdickMD.，Strieter RM.，Bao C.，Noble PW.Hyaluronan(HA)fragments inducechemokine gene expression in alveolar macrophages.The role of NA sizeand CD44.Journal of Clinical investigation.98(10)2403-13，1996Termeer CC.，Hennies J.，Voith U.，Ahrens T.，Weiss JM.，Prehm P.，SimonJC.Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells.Journal of Immunology.165(4)1863-70，2000；Fitzegerald KA.，BowieAG.，Skeffington BS.，O’Neil LA.，Ras，Protein kinase C zeta，and I kappaB kinases 1 and 2 are downstream effectors of CD44 during the activationof NF-kappa B by hyaluronic acid fragments in T-24 carcinoma cells.Journal of Immunology.164(4)2053-63，2000)。已经证明施用在鼠类和人皮肤上的中间分子量(50,000-250,000Da)的HA会通过表层和真皮层。在皮肤上施加HA之后2小时，降解产物在血清中出现。在血清中回收的HA的分子量略微小于在皮肤上施加的HA的分子量，这说明HA的经皮肤通过不仅仅限于较小尺寸的片段(100-10,000Da)(Brown TJ.，Alcorn D，Fraser JR.Absorption ofhyaluronan applied to theb surface of intact skin.Journal of investigativeDermatology.113(5)740-6，1999)。维生素A(视黄醇)及其天然和合成衍生物，统称为类维生素A，形成很多种不同的物质，这些物质显著地在胚胎发生、复制、视觉机理、生长调节和细胞分化现象中具有突出的效应(Blomhoff R.等人1991，Physiol.Rev.71951-990；Sporn M.B.等人(1994)在Retinoids，第2版，Raven Press，NY中)。天然类维生素A由如下通式(I)定义，如在(生物化学命名中的IUPAC-IUB联合委员会，在Eur.J.Biochem.(1982)，129，1-5中)中定义的那样
其中R＝CH2OH对应于视黄醇(ROL)R＝CHO对应于视黄醛(RAL)R＝COOH对应于视黄酸(RA)类维生素A的生物效应由它们与RAR(视黄酸受体)和RXR(视黄酸X受体)类型的核受体的相互作用调节。
在包括上皮细胞的许多细胞类型中，ROL代谢成视黄基酯。
类维生素A在皮肤病学中的重要性可追溯到在维生素A缺乏诱导的皮肤异常的动物中首次观察到的现象(Wolbach等人，J.exp.Med.43753)。
现在，已经合成了许多类维生素A。主要使用领域为皮肤病学适应症如光化角化病、痤疮和通常角质化病症如牛皮癣和达里埃病(Darier‘s)的局部或口服治疗。
此外，许多与类维生素A的组合和结合是已知的-对细胞分子和免疫调节起作用的分子组合，例如类维生素A和化学疗法在皮肤淋巴瘤中的组合(Thestrup-Petersen等人，Br.J.Dermatol.118811-818)，-类维生素A和光线疗法组合例如与补骨脂素结合(Saurat等人，Dermatologica177218-224)，-与影响类维生素A代谢的分子的组合。这是例如抑制类维生素A的代谢和使活性激素的细胞内速率增加的维生素D衍生物与唑类之间的相互作用情形(Kato等人，Biochem.J.(1992)286755-760，Jugert等人，Skin Pharmacol.1998)。
另外，已知在局部施加期间类维生素A的一种主要次级效应是诱导的刺激。此效应对观察治疗来说可能是无效的。
视黄醛(RAL)，类维生素A族的一员，是维生素A的天然代谢物，目前用于人类中的局部施加。已经证明RAL通过诱导表皮增生而在皮肤中产生生物活性，以及C57BL/6和无毛SKH1鼠(无毛SKH1)的滤泡和滤泡间表皮中CD44和HA表达的明显增加。也可通过视黄酸(RA)和视黄醇(ROL)的局部施加观察到这些效应。然而，与采用RA或ROL治疗相比，CD44和HA的表达在采用RAL治疗的鼠中更强烈地增加了。
CD44是多形性经膜糖蛋白，它具有由选择性拼接和翻译后改性产生的几个构型(isoform)。在近来的研究中，我们证明CD44在鼠类皮肤中的两个主要功能是(i)响应于细胞外刺激来调节角质化细胞增殖和(ii)保持HA的局部内环境稳定(Kaya G，Rodriguez I.，Jorcano JL.，VassalliP.，Stamenkovic I.Selective suppression of CD44 transgene driven by atissue-specific promoter disrupts hyaluronate metabolism in the skin andimpairs keratinocyte proliferation.Genes & Development.11(8)996-1007，1997)。我们也观察到在患有硬化-萎缩苔藓的患者中表皮CD44表达的降低，这极有可能引起HA的真皮沉积和此疾病中的表皮萎缩(Kaya G，Augsburger E.，Stamenkovic K.，Saurat JH.Decrease in epidermal CD44expression as a potential mechanism for dermis in lichen sclerosus andatrophicus.Journal ofInvestigate Dermatology.115(6)1054-8，2000)。
CD44涉及细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用。近来的研究显示由CD44和HA片段形成的配对(CD44-HAF)是有丝分裂和HA新合成的诱导物(Larent TC，Laurent UB，Fraser JR.The structure andfunction of hyaluronan综述.Immunol.Cell Biol.74(2)1-7，1996)。因此，HA和RAL的表皮和真皮效应看来应由CD44介导的。
目前，存在包含高分子量HA无机盐的药物和化妆品制剂，优选为喜朗(Healon)，海尔根(Hyalgan)，Provisc，Vitrax和在马西德尔完全药物参考中引用的那些，第32版，1999，The Pharmaceutical PressEditor。
然而，如果HA的分子量高，则其很难穿过皮肤。
这就是为什么在国际申请WO02/076470A1中，作者提出将N-乙酰基-葡糖胺与类维生素A结合的组合物。采用此组合，体外透明质酸的合成可以通过表皮细胞协同地增加。但是没有提及在体内施加该制剂之后所获得的结果。
日本申请11279042描述了基于硫酸化透明质酸片段的组合物，该片段优选地具有的分子量为1,000-50,000Da，且硫酸根基团占据分子式中R1，R2，R3和R4取代基总体的10-90％。这些低分子量片段对于保持皮肤弹性和避免角质化是非常活性的。相反，非硫酸化透明质酸片段在测试中经证明是非活性的。


现在，本发明人令人惊奇地发现水解成分子量为50,000-750,000Da片段的非硫酸化HA对皮肤具有生物活性，当这些片段与类维生素A结合时这种生物活性增强。
因此，本发明涉及可用于局部施加的组合物，其特征在于它们包括作为活性成分的一种或多种50,000-750,000Da低分子量的透明质酸盐片段。
在本发明的优选实施方案中，透明质酸盐片段的分子量为50,000-250,000Da或250,000-750,000Da。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种类维生素A。
分子量为50,000-750,000Da的透明质酸盐片段与类维生素A的组合对由角质化细胞进行的透明质酸合成有协同效应。
在本发明的意义上，类维生素A表示视黄醇或它的异构体、视黄醛、视黄酸或它的异构体，或视黄酸酯。
透明质酸盐表示任何盐，优选为透明质酸钠。
本发明的局部组合物也可包含染料、硅油、类维生素A或彩色颜料、防腐剂、植物油、抗氧剂、矿物盐、增稠剂、pH改进剂、吸收紫外射线的试剂、维生素或任何其它药用和皮肤病学可接受的赋形剂。
本发明的组合物可用于美容学和皮肤病，以预防或改进起皱纹皮肤，干燥皮肤，并且可以用它们保持皮肤的紧实度和湿度。
本发明的组合物可用于局部制剂中，用于皮肤病学或美容学的领域，目的在于预防或治疗与皮肤组织萎缩相关的皮肤病，并且它必须能改善皮肤的润湿状态，以降低在例如肾上腺皮质类脂醇治疗次级效应中的皮肤萎缩，减少皱纹，对抗无论是否是由光诱导的皮肤老化，重新引发表皮和真皮细胞活性，激活皮肤，增加它的弹性。
通过以下的实施例和


本发明。
图1说明在非治疗动物中和每日用制剂5，制剂3或制剂7治疗两次的动物表皮中测量的HA数量，这些制剂根据实施例1和2中描述的操作过程获得。
图2说明在非治疗动物或经制剂5，3或7治疗的动物真皮中的HA量，这些制剂如在实施例1和2中那样制备。
实施例实施例1局部使用的透明质酸盐片段的效应1.材料和方法1.1.制剂评价了3种类型的透明质酸片段(HAF)·非常高分子量HAF(1,000,000-2,000,000Da)·低分子量HAF(50,000-750,000Da)-HAF(250,000-750,000Da)-HAF(50,000-250,000Da)·非常低分子量HAF(1,000-20,000Da)这些片段包括在标准化妆品制剂中，它们的两种例示组成在下表1中给出


表1HAF基制剂

1.2.HAFs活性的测量使用无毛SKH1鼠，每组3只动物。
局部施加不同的制剂。
采用有刻度的目镜(Zeiss)测量表皮厚度；放大40倍，该厚度在每只鼠的五个场内取平均。
通过计算真皮细胞的数目评价真皮细胞含量(cellularity)，放大40倍，该细胞含量在每只鼠的五个场内平均。
表皮和真皮的增殖细胞数目由采用抗Ki-67抗体的免疫标记Ki67来揭示(抗小鼠的鼠，Dako)。
在根据ELISA技术每天施加两次的速率下施加不同的制剂之后，测量真皮中透明质酸盐的存在(Corgenix)和在由胶体铁染色的组织切片上揭示透明质酸盐。
2.结果
2.1.表皮厚度，真皮细胞构成和增殖细胞数目的效应结果见表2和3。
表2根据本发明的HAFS的效果(1)

表3根据本发明的HAFS的效果(2)

*ND未测定与分别包含高和非常低分子量HAF的制剂1和4相比，采用根据本发明的低分子量HAF配制并局部施加的制剂2和3显著增加无毛SKH1鼠中的表皮厚度和真皮细胞含量(表2)。与制剂1和4相比，制剂3也明显增加无毛SKH1鼠中表皮和真皮增殖细胞的数目(表3)。
制剂2和3的局部施加诱导表面和深真皮中增加的细胞性。数目增加的细胞主要是成纤维细胞，它们具有活化表型与非常发达的内质网。
2.2.真皮中HA水平的效应结果见表4。
表4根据本发明的HAFS对HA在真皮中的存在的影响

针对制剂2和3检测真皮中HA的存在(制剂3＞制剂2)。在施加制剂1和4之后不可检测HA水平。
因此，本发明人已经证明低分子量HAF的局部施加具有两个主要结果1-伴随细胞增殖增加的显著的表皮增生。
2-表面真皮中HA的局灶性累积与成纤维细胞数目的显著增加，这一结果在采用高和非常低分子量HAF时是观察不到的。
实施例2类维生素A与低分子量HAF的组合的效应1.材料和方法表5的片段包括在前述例示的标准化妆品制剂中。
表5基于HAF和类维生素A的制剂

2.结果它们见表6和7及见图1和2。制剂6和7的局部施加可增加变厚的表皮的位点数目。
表6对HAF和RAL对表皮厚度和真皮细胞含量的协同效应的研究

表7在施加HAF-RAL之后HA在真皮中的存在的检测

单独施加RAL(制剂5)的效应可比于将低分子量HAF与RAL结合的制剂8获得的效应，这证明在RAL和非常低分子量片段之间没有协同作用。
HAF-RAL结合的协同效应是特别可见针对制剂6和7的真皮细胞含量的水平(参照表5)。
制剂6和7的局部施加也增加真皮HA的染色(制剂7＞制剂6)(参照表7)。
HAF-RAL结合的协同效应也由HA在鼠真皮和表皮中存在的ELISA量揭示，采用以上提及的不同制剂治疗该鼠。
结果显示与仅采用RAL(制剂5)或仅采用HAF(制剂3)的治疗相比，在采用HAF-RAL结合(制剂7)的治疗之后，在真皮中(图2)和在表皮中(图1)HA产生的显著增加。


本发明涉及局部组合物，该组合物的特征在于其包括一种或几种作为主要成分的、分子量为50000到750000的透明质酸片段，如果需要，该组合物还包括类维生素A。