专利名称：干细胞条件培养基组合物的制作方法干细胞条件培养基组合物本发明涉及用于药学、美容和药用美容(cosmeceutical)应用的组合物,特别是用于包括病变和烧伤的治疗在内的伤口愈合的组合物。干细胞由于其形成多种类型的细胞的能力而在许多治疗、美容和药用美容领域十分引人关注。参见例如EP 0980270。此外，已披露了用于供细胞(包括干细胞)生长的培养基，其因生长细胞将蛋白质和其它因子分泌到培养基中而用于治疗、美容和药用美容应用。参见例如US7, 118. 746、US7, 160，726和W02008/020815。仍然需要鉴定用于治疗、美容和药用美容目的的备选组合物。特别需要鉴定产生不被用于支持干细胞生长的蛋白质性物质污染的条件培养基的方法。此外，可能特别需要鉴定制备条件培养基的有效的可规模化的方法。按照本发明的第一个方面，提供包含如下获得的条件细胞培养基的药物组合物 a)将选自真皮鞘细胞、真皮成纤维细胞或真皮乳头细胞的保持干细胞潜能的分化人细胞培养在生长培养基中；和b)将培养基与细胞分离。可用于本发明的第一个方面的生长培养基是足以满足细胞生长的培养基。细胞培养方法和培养基为本领域所熟知，包括补充血清的基础培养基、无血清培养基、无蛋白质培养基或化学成分确定的生长培养基。生长培养基通常包含必需氨基酸、糖、盐、维生素、矿物质/无机盐、痕量金属、脂质和核苷，并补充有支持细胞增殖所必需的各种其它组分，例如血清、蛋白质(例如胰岛素、运铁蛋白、生长因子和其它激素)、抗生素(例如庆大霉素、链霉素、青霉素)、附着因子(例如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白)。可组合(例如在血清的情况下)或单独加入补充成分。生长培养基为细胞提供满足特定细胞类型在受控体外环境中生长的营养需要的必需成分。在一个实施方案中，细胞培养过程在一个培养容器中操作，将细胞直接接种到装有微载体的培养容器中，细胞增殖直到达到所需细胞密度。在其它实施方案中，细胞培养过程在至少两个完全不同的细胞培养容器/系统中操作，例如一个或多个种子细胞扩繁容器接着是细胞生产容器。这种多重种子细胞扩繁过程优选利用尺寸递增的培养容器直到得到足够的细胞数目用于最终生产细胞培养容器的接种。种子细胞扩繁培养容器可为相同类型(例如组织培养瓶、摇瓶、滚瓶、转瓶(spinner flask)、wave生物反应器、搅拌爸生物反应器)，但尺寸随种子细胞扩繁进程递增，或者可为随着种子细胞培养扩繁准备妥要转移到生产生物反应器而尺寸递增的混合培养系统(例如组织培养瓶至摇瓶至转瓶至搅拌釜生物反应器系统)。通常控制体外环境以保持最适生长温度、溶解氧、二氧化碳、pH和重量摩尔渗透压浓度。许多细胞培养基配方是领域已知的，或者可容易地获自商用来源。本领域技术人员已知可通过将细胞接种到允许细胞在细胞培养期间生长的生长培养基中来产生条件细胞培养基。在细胞培养结束时或在培养期间的选定点，取出细胞，收获条件培养基。条件培养基可含有许多原始细胞培养生长培养基的成分，但还可含有细胞代谢物和由细胞分泌的其它蛋白质。分泌性蛋白可以是有生物活性的生长因子、细胞因子、蛋白酶和其它胞外蛋白质和肽。在许多实施方案中，本发明第一个方面的组合物包含Gro-a、1-309、IL_6、IL_8、IL-13、MIF、PAI-I、SDF-I和TGF- P蛋白的一种或多种，尤其包含TGF- ^ I。按照本发明的第二个方面，提供用于制备条件细胞培养基的方法，所述方法包括 a)将真核细胞培养在具有有效支持细胞生长的组成的生长培养基中； b)将培养细胞与生长培养基分离； c)将培养细胞维持在具有适于维持细胞存活率但不支持实质性细胞生长的组成的基础培养基中。可用于本发明第二个方面的真核细胞披露于‘Basic Cell Culture’ OxfordUniversity Press (2002) J. M. Davis 主编；以及 ‘Animal Cell Culture’ Oxford University Press (2000) John. R. ff. Masters主编；两份文献通过引用以其整体结合到本文中。术语“干细胞”描述了可产生多种组织类型的细胞的细胞。干细胞是来自胚胎、胎儿或成体的细胞，当与特殊信号转导复合物(其提供成为不同细胞类型的指导)一起出现时，其具有成为不同细胞类型的能力。存在不同类型的干细胞。当精子使卵受精时便形成一个全能细胞，并因此具有形成整个生物体的能力。在受精后头几个小时内，该细胞分裂成相同的全能细胞。受精后大约4天以及几个细胞分裂循环后，这些全能干细胞开始特化。在全能细胞变得更加特化时，因此而被称为“多潜能”。多潜能细胞可分化成体内的每种细胞类型，但不产生胎盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能细胞分化的潜力是不“完整的”，因此这类细胞不能称为“全能”，且它们不是胚胎。多潜能干细胞进行进一步特化成为多能干细胞，所述多能干细胞定向分化成特化用于特殊功能的特定谱系的细胞。多能细胞可分化成存在于其从中衍生的组织中的细胞类型；例如多能(成体)干细胞例如间充质干细胞，例如真皮鞘细胞、真皮乳头细胞和真皮成纤维细胞。细胞可来源于成体、新生儿或胎儿组织，并且可以是自体或同种异体细胞。可采用本领域充分确立的方法对细胞进行遗传修饰。可采用遗传修饰改变分泌到细胞生长条件细胞培养基或条件基础细胞培养基中的一种或多种成分的浓度，例如以增量调节或减量调节蛋白质、引入新的蛋白质、或调节离子浓度。在某些实施方案中，使细胞作为共培养物生长。共培养细胞是生长在一起的两种或更多种不同种类的细胞的混合物。适用于第二个方面的方法的细胞可通过本领域已知方法获得。具体地讲，细胞可从组织中分离、由之前已建立的细胞母液中的细胞扩繁、传代并培养以产生细胞生长条件细胞培养基或条件基础细胞培养基。细胞生长条件细胞培养基或条件基础细胞培养基可使用未分化或分化细胞产生。用于本发明第二个方面的方法的细胞优选为保持干细胞潜能的选自真皮鞘细胞、真皮成纤维细胞或真皮乳头细胞的分化人细胞。可用于本发明第二个方面的生长培养基如上文有关第一个方面中所述。将细胞培养在生长培养基中，直到达到所需细胞密度。用于本发明第二个方面的基础培养基具有适于维持细胞存活率的组成(例如pH和重量摩尔渗透压浓度)以避免细胞溶解但不支持实质性细胞生长、优选不支持细胞生长。基础培养基包含基础组分例如无机盐、氨基酸、维生素和能源(包括糖)，但不补充例如血清、蛋白质、激素和附着因子等成分。优选的能源包含谷氨酰胺。基础培养基在引入培养细胞前无蛋白质，并且在引入培养细胞后不向基础培养基中添加蛋白质补充成分。选择基础培养基的组成以维持培养细胞的存活率以供输出细胞代谢物并分泌到基础培养基中。可使用的基础培养基的实例包括Ames培养基、Eagle基础培养基、Click培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基、Ham养分混合物F-12、Glasgow极限必需培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基、Eagle极限必需培养基和RPMI-1640培养基。在本发明第二个方面的许多优选实施方案中，在从生长培养基分离后并在引入基础培养基之前洗涤细胞。合适的细胞洗涤溶液的实例为本领域所熟知，包括缓冲液，例如磷酸缓冲盐溶液。在一些优选的实施方案中，所用洗涤溶液为基础培养基，例如上述基础培养基，通常为与随后维持细胞的培养基相同的基础培养基。可以以细胞生长期结束时达到的相同细胞浓度将培养细胞引入基础培养基，或者更优选以较高浓度引入以提高基础培养基中分泌成分的浓度。如果使细胞生长在2D培养中，则细胞一般生长产生高度汇合的单层培养物。这种细胞浓度通常为IxlO4-IxIO5个细胞/cm2，优选2x104-5xl04个细胞/cm2。如果与基础培养基的接触以2D模式进行，则也是利用 这种高度汇合的细胞单层。如果细胞生长在3D培养中，例如附着于微载体上，则细胞一般生长至Ixl07-lxl012个细胞/升的浓度范围，优选为IxIO8-IxIOltl个细胞/升。在许多实施方案中，在2D或3D培养任一种中，所用基础培养基的体积低于支持细胞生长所用培养基体积，至少 1/15、一般 1/10-1/2、1/6-1/4，例如 1/5。一般将培养细胞维持在基础培养基中直到培养基具有所需组成，一般为期超过12小时，通常为18-26小时，例如约24小时。在这种再培育期结束时，取出细胞以产生无细胞的条件基础细胞培养基。条件基础细胞培养基可含有细胞代谢物和分泌性蛋白。分泌性蛋白可为生物活性生长因子、细胞因子、蛋白酶和其它胞外蛋白质和肽。使用不同术语描述培养物中的细胞。‘细胞培养物’一般是指取自活的生物体并生长在受控条件下的细胞。原代细胞培养物是在第一次继代培养前直接取自生物体的细胞、组织或器官的培养物。当将细胞在促进生长和/或分裂的条件下置于生长培养基中时，细胞进行扩繁，产生较大的细胞群。细胞系是通过对原代细胞培养物进行一次或多次继代培养所形成的细胞群。每轮继代培养亦称为传代。本领域技术人员应理解的是，在传代期间，可能有多次群倍增。依赖贴壁细胞或依赖附着细胞是在组织培养中需要附着某一表面以繁殖和生长的细胞。在一些实施方案中，用于实施本发明的细胞能够生长在悬浮培养物中。本文所用的有悬浮能力的细胞是能够生长在悬液中而又不会产生大的坚实聚集体的细胞，即是单分散性的细胞，或者是生长在其中每个聚集体仅有少数细胞的疏松聚集体中的细胞。有悬浮能力的细胞包括而不限于在不需要适应或操作时生长在悬液中的细胞，以及通过依赖附着细胞对悬液生长逐步适应而成为有悬浮能力的细胞。如果使用这类细胞，则细胞的繁殖可在悬液中进行，因此可仅在生产生物反应器本身中的最终繁殖阶段和在生产阶段使用微载体。在悬液适应的细胞的情况下，所用微载体通常为大孔载体，其中细胞通过物理截留在载体的内部结构中而附着。本文所用术语“微载体”意指适于细胞附着和生长的小的分立颗粒。虽不总是如此，但微载体通常为由聚合物形成的多孔珠粒。微载体还可具有带凹痕的致密表面。细胞常常附着并生长在这类珠粒的外表面上。通过在有利于细胞生长的条件下培养细胞来实施本发明的方法。培养条件，例如温度、pH、溶解氧(包括低氧条件)等，是已知最适于特定细胞的培养条件，并且对本领域的技术人员或操作人员而言是显而易见的(参见例如Animal Cell Culture: A PracticalApproach 第 2 版,Rickwood, D.和 Hames，B. D.,主编,Oxford University Press, NewYork (1992))o在本发明的第一和第二个方面，有利的是，对附着在固体支持培养基上的细胞进行培养。大规模生产的选择包括组织培养瓶、滚瓶、基于灌注的系统(例如中空纤维生物反应器、内部和外部自旋过滤器(internal and external spin filter)、声学细胞滞留装置(acoustic cell retention device)、基于过滤的细胞滞留装置)、单板、多板或堆积板细胞培养系统、细胞立方体(cell cube)和微载体。还可使用由可供细胞与之附着并且可供细胞以不止一层生长的任何材料和/或形状组成的三维支架培养细胞。构架的结构可包括网格、海绵或可由水凝胶形成。一个合适的三维构架是Integra Dermal RegenerationTemplate (Integra Life Sciences)。可将细胞直接培养在三维支架上,或者可从组织培养瓶、滚瓶、中空纤维系统、单板、多板或堆积板细胞培养系统、细胞立方体和微载体中收获细胞后，将细胞重新接种在三维支架上以产生细胞生长条件细胞培养基或条件基础细胞培 养基。还可利用灌注细胞培养来培养细胞。在灌注细胞培养中，使用细胞滞留装置例如过滤器(例如内部或外部自旋过滤器)、细胞截留网格、细胞沉淀器、声学装置等，将细胞保留在生物反应器中。连续或定期向生物反应器中提供细胞培养生长培养基，并连续或周期性地取出不含细胞的‘耗尽’培养基。在某些优选的实施方案中，细胞附着在固体微载体的表面上，或者附着在大孔微载体的内部结构上，或通过物理截留在大孔微载体的内部结构内而附着，其中微载体是明胶(水解胶原)微载体。这类微载体可包含用作载体材料上的涂层的明胶颗粒、交联明胶颗粒或明胶，例如聚苯乙烯或玻璃颗粒。明胶可得自天然来源或者重组或合成产生。在一些实施方案中，细胞培养过程在一个培养容器中操作。将细胞直接接种到装有微载体的培养容器中后，细胞增殖，直到达到所需细胞密度。在无菌下收获含有增殖细胞的微载体并洗涤。然后，将经洗涤的微载体重新悬于基础培养基中，并在维持细胞存活率的最适条件下培育一段时间(通常24小时)。然后收获条件培养基。洗涤步骤可进行一次或多次。在其它实施方案中，细胞培养过程在至少两个完全不同的细胞培养容器/系统中操作，例如一个或多个种子细胞扩繁容器，接着是细胞生产容器。这种多种子细胞扩繁过程优选使用尺寸递增的培养容器，直到得到足够的细胞数目用于最终生产细胞培养容器的接种。种子细胞扩繁培养容器可为相同类型(例如组织培养瓶、摇瓶、滚瓶、转瓶、wave生物反应器、搅拌釜生物反应器)，但尺寸随种子细胞扩繁进程递增，或者可为随着种子细胞培养扩繁准备妥要转移到生产生物反应器而尺寸递增的混合培养系统(例如组织培养瓶至摇瓶至转瓶至搅拌釜生物反应器系统)。如有需要，可通过使微载体沉淀到细胞培养瓶底，之后取出选定百分比(至多全部并包括全部)的生长培养基体积，任选洗涤微载体，将相应百分比的新鲜细胞培养生长培养基加到细胞培养瓶中，来进行培养基更换。然后将微载体重新悬浮于培养基中后继续培养。可重复培养基取出和置换的这个过程，直到达到所需细胞密度。可用于本发明方法的明胶微载体通常为大致球状的，但可具有其它形状，并且可以是多孔的，或可以是固体。多孔和固体类型的微载体两者可获自商品供应商。大孔明胶微载体是市售可获得的，例如可获自Percell Biolytica AB, Sweden的“Cultispher”微载体。明胶大孔微载体的特征在于颗粒以高度交联的明胶基质为基础，粒径为10-500 ii m，由包封直径为1-50 的大量空穴的聚合物基质组成。细胞附着微载体的使用有利于用于依赖贴壁细胞生长的搅拌釜和相关生物反应器的使用。细胞一般附着在悬浮的颗粒上。悬浮的需要性通常限制可使用的微载体的物理参数。一般选择这样的微载体粒径范围，即粒径足够大以容纳依赖贴壁细胞类型，同时又足够小以形成其性质适用于细胞培养生物反应器的悬液，细胞培养生物反应器例如摇瓶、滚瓶、转瓶、wave生物反应器和搅拌釜生物反应器系统。明胶或胶原可通过赖氨酸的氨基、通过谷氨酸或天冬氨酸的羧基或其组合交联。通过本领域已知方法，例如采用细胞沉淀和倾析、间歇离心或连续离心和/或微量过滤，从细胞在其中生长或维持的培养基中将其分离。可采用例如超滤、渗滤或色谱纯化，对所得到的无细胞培养基进一步加工以浓缩或减少一种或多种因子或成分。在本发明第二个方面的方法中产生的条件培养基优选用作药物组合物。因此，这 类药物组合物构成本发明的第三个方面。药物组合物，尤其是得自真皮鞘细胞、真皮成纤维细胞或真皮乳头细胞的药物组合物一般可应用于伤口和病变愈合。组合物还可用于已知培养基的成分对之有效的其它应用。优选的组合物包含IL-6、Gro_a、SDF_1、FGF_2、SPARC、PAI-1、IL-8、胶原、纤连蛋白、1-309、IL-13、MIF和SDF-I和TGF-3蛋白的一种或多种，尤其包含TGF-3 I。尤其优选的组合物包含表2、3或4中所列举的一种或多种蛋白质。本发明第一和第三个方面的组合物可用于作为液体剂的药物，或可冷冻、冻干、形成膜剂或干燥成散剂。可将组合物稀释、浓缩、与其它成分混合，或者将组合物部分或完全纯化。可通过任何合适的方法，将组合物递送至人体或动物体。可将条件培养基与作为用于内部给予的溶媒的药学上可接受的载体一起配制、直接施用于伤口 /病灶、与用于局部施用的油膏或软膏一起配制、或者例如制成或加入或分散于生物可降解的聚合物或水凝胶中以产生创伤敷料、可植入组合物和医疗装置涂层。分散于生物可降解聚合物中的一个优势是该系统可用于缓释递送系统。这对于将聚合物的生物活性成分递送至慢性伤口是特别有利的，其必须抵抗伤口蛋白水解环境的快速降解并且具有生物活性成分的缓释。对技术人员而言将是显而易见的是，递送方法将取决于待递送条件培养基的具体体内应用，并且技术人员应能够确定为此要应用哪一种方法。可通过应用细胞分泌物而不是细胞或者除细胞以外应用细胞分泌物加强内源组织修复，来使组织再生或修复组织。本发明基于以下前提，即包括多种蛋白质的差异性表达/分泌的多个复杂过程是最适组织修复和重塑所必需的。本发明中产生的条件培养基含有据信对组织修复、重塑和伤口愈合是重要的并且在例如伤口愈合体内模型中显示已被消耗的许多调节蛋白。这类蛋白质的实例包括TGF-P、IL-6、Gro-a、SDF-U FGF-2、SPARC、PAI-U IL-8、胶原、纤连蛋白、1-309、IL-13、MIF 和 SDF-I0TGF-P I是在皮肤伤口愈合中的主要TGF-P蛋白。在伤口愈合中，TGF-^ I在炎症、血管生成、上皮再形成和结缔组织再生中是重要的。已经表明在发生损伤时表达增加(Kopecki Z, Luchetti MM, Adams DH, Strudwick X, Mantamadiotis T, StoppacciaroA，Gabrielli A，Ramsay RGj Cowin AJj J Pathol 2007;211:351-61。Kane CJj HebdaPA，Mansbridge JNj Hanawalt PC, J Cell Physiol 1999 ;148:157-73)。体外研究表明，TGF-P I通过增加与胞外基质(ECM)形成有关的基因表达(包括纤连蛋白、纤连蛋白受体及胶原和蛋白酶抑制剂)而有助于启动肉芽形成(White L A, Mitchell T I，BrinckerhoffC E, Biochimica et biophysica acta, 2000 ；1490 (3):259-68。 Mauviel A， Chung KYjAgarwal A，Tamai K，Uitto J，J Biol Chem 1996;271:10917-23。PapakonstantinouE, Aletra AJj Roth M，Tamm M，Karakiulakis G，Cytokine 2003，24: 25-35。ZengG, McCue HMj Mastrangelo L, Mills AJj Exp Cell Res 1996; 228:271-6)。更多的体外研究表明，TGF-^ I通过促进胶原基质的成纤维细胞收缩而在伤口收缩中起重要作用(Meckmongkol TTj Harmon R, McKeown-Longo P，Van De Water L, Biochem BiophysRes Cornnun 2007;360:709-14)。在伤口愈合的基质形成和重塑阶段，TGF-P I参与胶原产生，特别是 I 型和 II 型的产生(Papakonstantinou E, Aletra AJj Roth M, Tamm MjKarakiulakis G, Cytokine 2003 ;24:25_35)。已经表明，当过量表达时，已知TGF-0 I剌激同样已知在肥厚性瘢痕和瘢痕瘤性瘢痕的发展中起重要作用的结缔组织生长因子(CTGF)(Colwell AS， Phan TTj Kong W, Longaker MT， Lorenz PHj Plast Reconstr Aesthet Surg 2005 ; 116:1387-90)。已经表明，IL-6在启动伤口愈合反应中重要，和在受伤后表达增加，在陈旧伤口中趋于持续存在(Sogabe Y，Abe M, Yokoymana Y，Ishikawaj 0，Wound RepairRegen 2006 ;14:457_62。Grellner W, Georg T, Wilske J, Forensic Sci Int 2000 ；113:251_640Finnerty CCj Herndon DNj Przkora R， Pereira CTj Oliveira HMj QueirozDM, Rocha AM，Jeschke MG，Shock 2006;26:13-9)。11-6 对角质形成细胞具有促有丝分裂作用(Randle M Gallucci, Dusti K Sloan, Julie M Heck, Anne R Murray 和 SijyJ O’Dell，Journal of Investigative Derma to logy (2004) 122, 764-772)和增殖作用(Sato M, Sawamura D，Ina S，Yaguchi T，Hanada K，Hashimoto I，Arch Dermatol Res1999 ;291:400-4。Peschen M， Grenz H， Brand-Saberi B， Bunaes M， Simon JCj SchopfE, Vanscheidt W，Arch Dermatol Res 1998 ;290:291-7)，并且对嗜中性粒细胞有趋化性。Gro- a (CXCLl)趋化因子是CXC家族成员，是嗜中性粒细胞趋化作用的有效调节齐U，并且在急性伤口中被增量调节。体外研究表明通过促进角质形成细胞迀移而在上皮再形成中起作用(Englehardt E, Toksoy A, Goebeler M, Debus S，Brocker EBj GillitzerRj Am J Pathol 1998 ； 153:1849-60oChristopherson K II，Hromas R, Stem Cells 2001 ；19:388-96)oSDF-I (CXCL12)通过将淋巴细胞募集至伤口并促进血管生成而在炎症反应中起作用。当急性伤口的稳态被扰乱时，在伤口边缘观察到水平升高的SDFl (Toksoy A, MullerV，Gillitzer R, Goebeler Mj Br J Dermatol 2007 ;157:1148-54) ADF-l促进上皮细胞的增殖和迁移(Salcedo R, Wasserman K，Young HAj Grimm MC，Howard OMj Anver MR,Kleinman HKj Murphy WJj Oppenheim JJj Am J Pathol 1999;154:1125-35)。SDF-1 还可提高角质形成细胞增殖从而有助于上皮再形成(Florin L, Maas-Szabowski N，WernerS，Szabowski A，Angel P，J Cell Sci 2005 ；118(Pt9) :1981-9) 0FGF-2 (bFGF)在上皮再形成期间调节各种ECM成分的合成和沉积、增加角质形成细胞运动性(Sogabe Y，Abe M, Yokoymana Y，Ishikawaj 0，Wound Repair Regen 2006 ；14:457-62。Grellner W，Georg T，Wilske J，Forensic Sci Int 2000;113:251-64。Di Vita G, Patti R，D’ Agostino P，Caruso G，Arcara M，Buscemi S，BonventreS, Ferlazzo V，Arcoleo F，Cillari E，Wound Repair Regen 2006 ； 14:259-64)和促进成纤维细胞的迀移并剌激其产生胶原酶(Sasaki T, J Dermatol. 1992年11月；19(11) :664-6) o在重塑和修复(例如愈合皮肤伤口)期间，SPARC (富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)在不同组织中表达(Reed MJj Puolakkainen P，Lane TFj Dickerson D, BornsteinP，Sage EHj J Histochem Cytochem 1 993，41:1467-1477)，这就表明了在再生中的功能(Louise H. Jorgensen，Stine J. Petersson，Jeeva Sellathurai，Ditte C. Andersen,Susanne Thayssen, Dorte J. Sant, Charlotte H. Jensen 和 Henrik D. Schroder，Journal of Histochemistry and Cytochemistry,第 57 卷(I) : 29-39，2009)。多种基质细胞蛋白显示因响应损伤而增加表达(Bradshaw ADj Sage EHj J Clin Invest2001，107:1049-1054)。SPARC是基质细胞糖蛋白，调节细胞与ECM的相互作用。据报道在SPARC失效小鼠中，皮肤伤口闭合加速，胶原沉积改变(Bradshaw ADj Reed MJj Sage EHjJ Histochem Cytochem 2002，50:1-10)。从伤口部位的表达模式和体外研究来看，SPARC涉及伤口愈合的控制(Basu A, Kligman LHj Samulewicz SJj Howe CCj BMC Cell Biol.2001 ；2:150 2001年8月7日网上发表)。PAI-I (SerpineEl)是纤溶酶产生的重要生理调节剂。虽然在表皮中PAI-1通常不是由角质形成细胞表达的，但已经表明在体外和体内伤口损伤后其表达增加(Romer JjLund LR，Eriksen J, Ralfkiaer E, Zeheb R, Gelehrter TDj Dano K，Kristensen P，JInvest Dermatol 1991， 97:803—811。Staiano—Coico I， Carano K， Allan VMj SteinerMG， Pagan-Charry I， Bailey BBj Babaar P， Rigas B， Higgins PJj Exp Cell Res 1996，227:123-134) o支持PAI-I在伤口愈合中的作用的一项研究表明，PAI-I功能的丧失导致伤口愈合力口快(Joyce C. Y. Chan, Danielle A. Duszczyszyn, Francis J. Castellino和 Victoria A Ploplis， American Journal of Pathology. 2001;159:1681-1688)。研究表明，在上皮再形成过程的角质形成细胞和结缔组织细胞迀移以及与伤口愈合有关的组织重塑期间，uPA和PAI-I的表达在空间和时间上被调节(Romer J, Lund LR，EriksenJ, Ralfkiaer E, Zeheb R, Gelehrter TDj Dano K， Kristensen P， J Invest Derma to I1991,97:803-811)。在急性伤口中IL_8表达增加(E，Toksoy A，Goebeler M, Debus S，Brocker EBjGillitzer R，Am J Pathol 1998 ; 153:1849-60)，并且已被证实通过增加角质形成细胞迀移和增殖而在上皮再形成中起作用(Michel G, Kemeny L, Peter RU，Beetz A，Reid C，Arenberger P， Ruzicka T， FEBS Lett 1992 ;305:241_30Tuschil A, Lam C， HaslbergerA，Lindley I，J Invest Dermatol. 1992年9月；99(3) :294-8)。它还在白细胞中诱导MMP的表达，剌激组织重塑(Englehardt E, Toksoy A, Goebeler M, Debus S，Brocker EBjGillitzer Rj Am J Pathol 1998 ; 153:1849-60)。它是嗜中性粒细胞强有力的化学引诱物，因此参与炎症反应(Rennekampff HO，Hansbrough JFj Kiessig V，Dore C，SticherlingMj Schr5der JMj J Surg Res. 2000 年 9 月；93 (I) : 41-54)。此外，加入高水平的 IL-8降低角质形成细胞增殖和由成纤维细胞引起的胶原晶格收缩(Iocono JA, Colleran KR,Remick DG, Gillespie Bff, Ehrlich HP, Garner WL, Wound Repair Regen. 2000年5-6月；8(3) :216-25)。胶原和纤连蛋白一伤口愈合的增生期的特征在于血管生成、胶原沉积、肉芽组织形成、上皮形成和伤口收缩(Midwood K. S. , Williams L. V.,和 SchwarzbauerJ. E. 2004, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (6):1031-1037)。在纤维组织形成和肉芽组织形成中，成纤维细胞生长，并通过分泌胶原和纤连蛋白形成新的 ECM (Midwood K. S. , Williams L. V.和 Schwarzbauer J. E. 2004, TheInternational Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (6) : 1031—1037)。在受伤后2-5天成纤维细胞开始进入伤口部位，因为炎症期结束，且其数目在受伤后1-2周达到高峰(de la Torre J., Sholar A. (2006), Wound healing: Chronic wounds.Emedicine. com, 2008年I月20日访问)。到第一周结束时，成纤维细胞是伤口中的主要细胞(Stadelmann ff. K. , Digenis A. G.和 Tobin G. R. (1998), American Journal ofSurgery 176 (2) : 26S-38S)。在受伤后2_4周，纤维组织形成结束。在损伤后头2或3、天，成纤维细胞主要增殖并迁移，而之后，它们是沉积在伤口部位胶原基质上的主要细胞(Stadelmann ff. K. , Digenis A. G.和 Tobin G. R. (1998) ,American Journal of Surgery176 (2) : 26S-38S)。来自正常组织的成纤维细胞从其边缘迁移至伤口区域中。成纤维细胞最初利用在炎症期形成的血纤蛋白痂迁移过去，附着在纤连蛋白上(Romo T.和PearsonJ. M. 2005, Wound Healing, Skin. Emedicine. com, 2006 年 12 月 27 日访问)。然后成纤维细胞将基质沉积在伤口床上,稍后沉积它们可附着以迁移的胶原(Rosenberg L.，dela Torre J. (2006), Wound Healing, Growth Factors. Emedicine. com, 2008 年 I 月 20日访问)。胶原沉积被认为是重要的，因为它增加伤口的强度；在其沉积下来之前，血纤蛋白-纤连蛋白凝块保持伤口闭合(Greenhalgh D. G. (1998), The International Journalof Biochemistry & Cell Biology 30 (9): 1019-1030)。同样,参与炎症、血管生成和结缔组织构建的细胞附着在成纤维细胞所沉积的胶原基质上，生长并分化(Ruszczak Z. 2003，Advanced Drug Deli very Reviews, 55 (12) : 1595-1611)。人细胞因子1-309是一种小的糖蛋白，在结构上与许多炎性细胞因子相关，其在血管生成期间特异性刺激人单核细胞(Miller MD, Krangel MS, Proc Natl Acad Sci USA1992b 89:2950-2954)。一般认为在治疗伤口时需要通过直接加入这些因子来增加生长因子的供应。使用该方法，可排除与基于细胞的疗法相关的现有问题，例如但不限于免疫相容性和肿瘤发生。因为许多已知是所需要的一系列因子存在于申请人的细胞生长条件细胞培养基和条件基础细胞培养基中，因此本发明的细胞生长条件细胞培养基和条件基础细胞培养基还可用于治疗其中需要组织修复和/或再生或损害的其它类型的组织损害。在不受限制的情况下，通过下列实施例对本发明进行说明。细胞系的建立 基本上按EP980270中所述以及下述修改来分离毛囊间充质细胞。将人皮肤组织样品用含有I U g/ml两性霉素和10 ug /ml庆大霉素的极限必需培养基(MEM, Sigma M4655)洗涤3次。在解剖显微镜下，使用精细手术剪切下毛发生长初期‘端球’，并放入小体积(通常100-200 yl)的MEM中。用针将端球倒置，切开乳头，抽出鞘。然后将乳头和鞘分别转移到4孔细胞培养板(Nunc)中。每孔补充了 20%胎牛血清(FBS)、0. 5 u g/ml两性霉素和5U g /ml庆大霉素的Iml MEM中转移10个乳头和10个鞘。将4孔细胞培养板在无菌和标准条件(37°C、5% 二氧化碳)下培育。细胞生长10天后，将细胞从各孔中剥离(采用本领域充分确立的标准方法)，并分别转移到35mm直径细胞培养皿(Nunc)中。当细胞生长汇合时，将真皮鞘(下文称为‘AVDS’ )和真皮乳头(下文称为‘AVDP’ )细胞系按前述剥离，并转移到T25细胞培养瓶(Nunc)中用于在上述条件下进一步扩繁。从上述相同的人皮肤组织样品中建立真皮成纤维细胞(下文称为‘AVDF’ )细胞系。将乳头真皮与网状真皮和脂肪层相分离，然后在显微镜下切成表面积约2-3_2的片。将切割组织转移到装有如上述用于真皮鞘和真皮乳头细胞系的补充成分的MEM的T25细胞培养瓶(Nunc)中。将装有真皮成纤维细胞(AVDF)细胞系的T25细胞培养瓶在无菌和标准条件下培育(如前所述)。当培养物达到汇合时，采用相同条件使真皮成纤维细胞(AVDF)细胞系进一步扩繁。从多个不同的人组织样品建立AVDS、AVDP和AVDF细胞系。在下列实施例中描述的这些细胞系的概况见下表I。表I :细胞系概况本文提供制备条件细胞培养基的方法。所述方法包括a)将真核细胞培养在具有有效支持细胞生长的组成的生长培养基中；b)将培养细胞与生长培养基分离；和c)将培养细胞维持在具有适于保持细胞存活率但不支持实质性细胞生长的组成的基础培养基中。细胞优选为真皮鞘细胞、真皮乳头细胞或真皮成纤维细胞。所述组合物可用作药物组合物，尤其用于伤口愈合的药物组合物。