专利名称：非侵袭性遗传免疫、其表达产物及用途的制作方法脊椎动物体内免疫系统的活化是保护动物免于病原体和恶性肿瘤侵袭的一个重要机制。免疫系统由许多相互作用的成分组成，包括体液的和细胞的。体液免疫包括直接与抗原结合的抗体。抗体分子作为体液免疫的效应分子是由B淋巴细胞分泌的。细胞免疫包括特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，它识别并杀伤其它产生非自身抗原的细胞。CTLs对降解的肽片段产生反应，这些肽片段与MHC(主要组织相容性复合体)I类抗原结合出现在靶细胞的表面。已知，作为细胞代谢的一部分，细胞内产生的蛋白不断地降解成肽。这些片段与MHC类分子结合并运输到细胞表面。因此，细胞免疫系统坚持不懈地监视机体所有细胞产生的蛋白谱，并准备着消除任何产生非自身抗原的细胞。接种疫苗是激发动物对抗原产生反应的过程。抗原可以蛋白(经典的)或以表达抗原的基因形式(遗传免疫)给药。该过程包括T和B淋巴细胞、其它类型的淋巴样细胞，以及特殊的抗原提呈细胞(APCs)，它可处理抗原并以可激活免疫系统的形式展示。目前给药基因疫苗的模式集中于非侵袭性程序，包括针注射、划痕和基因枪介导的渗透。以非侵袭性模式接种疫苗要求设备和经过特殊医学培训的技术人员，并且通常伴随有不适和潜在的危险(出血、感染)。疫苗效力通过对后来肿瘤或病原体攻击的保护程度来检测。有效的疫苗是这样的免疫原，在最小量接种后，它们能诱导高滴度和长期保护性免疫，产生针对疾病的目标干涉。例如，遗传免疫是通过在动物自己的细胞内表达编码特殊蛋白基因来诱导针对该蛋白的免疫应答的途径。体内延迟的抗原提呈导致的大量抗原扩增和免疫刺激可诱导针对抗原的稳定免疫。遗传免疫使得诱导针对特殊蛋白的免疫应答的接种方法简单化，因为通常蛋白纯化和与佐剂混合的困难步骤得以取消，而二者均为疫苗开发中的常规要求。因为，遗传免疫不要求蛋白的分离，所以它对进行生化纯化时会丢失构象表位的蛋白尤为有益。也可以输送基因疫苗，而没有诱导干扰或影响的效力(Tang et al.，1992；Barry et al.，1995)，这样可简化针对多种抗原的接种方案。尽管人们对基于局部应用蛋白质的疫苗进行了研究，但其用途是有限的。尽管以蛋白质为基础的疫苗与霍乱毒素联合局部应用也可以非侵袭性方式免疫动物(Glenn et al.，1998)，但本发明的以皮肤为目标的非侵袭性基因疫苗通过不同于以蛋白质为基础的疫苗的机制激活免疫系统。另外，由于抗原的重新合成与自然感染相似，通常基因疫苗的效力先于蛋白质疫苗(McDonnell and Askari，1996)。美国专利3837340涉及一种通过用干病毒接触皮肤来接种动物的方法，这里应用的干病毒不是能表达转基因或异源性或外源性核酸分子的基因载体。此外，免疫原可以是病毒外壳中的蛋白质，而不是病毒基因在动物自己细胞内表达的蛋白产物，如任何由美国专利3837340诱导的免疫应答与局部给药与本发明不相类似的以蛋白质为基础的疫苗所诱导的相似，因此美国专利3837340与本发明不相类似。疫苗接种的现有技术通常需要注射器针或基因枪等器材和给药疫苗的特殊技术。该领域迫切需要并希望疫苗接种由没有器材和没经过医学培训的人员进行。通过开发非侵袭性皮肤疫苗接种(NIVS)可对大量的疾病进行免疫，因为该程序简单、有效、经济、无痛和潜在的安全。结果，因患者舒适，NIVS可增加那些医药资源缺乏的发展中国家以及发达国家疫苗的覆盖范围。由病毒引起的包括AIDS和流感在内的感染性疾病，和由细菌引起的包括破伤风和TB在内的感染性疾病，和由寄生虫引起的包括疟疾在内的感染性疾病，和包括多种不同肿瘤类型的恶性肿瘤均可通过以皮肤为目标的非侵袭性疫苗而进行预防或治疗，而不需特殊的器材和医务人员。本发明满足了该领域内这一长期的需要和期望。发明目的和概述非侵袭性皮肤疫苗接种(NIVS)可提高疫苗接种计划，因为皮肤是一免疫活性组织，并且该非侵袭性程序不要求特殊训练的人员。以皮肤为目标的非侵袭性基因输送可达到皮肤内局部的转基因表达和免疫应答的引发(Tang et al.，1997)，并且这些应答的机制不同于霍乱毒素的基于蛋白的疫苗的局部应用的机制(Glenn et al.，1998)。这些结果显示基于载体的NIVS是一种新的有效的输送疫苗的方法。本发明的这种简单、有效、经济和无痛的免疫方法可使疫苗接种较少依赖于医药资源，因此提高疫苗接种的年实施率。由此，本发明的一个目标是下面任何一个或多个提供一种在宿主或动物，如哺乳动物等脊椎动物内诱导免疫应答，如保护性免疫应答，和/或治疗性应答的方法，包括局部给药包括并表达一核酸分子的载体，该核酸分子编码的基因产物可诱导或刺激这些反应；提供这样一种方法，其中核酸分子是与宿主异源和/或外源性的；E1和/或E3和/或E4区缺陷的腺病毒的粘膜给药，如鼻内、经舌的、颊的、口服的、口腔给药，优选E1和E3和E4区缺陷的腺病毒，如包括外源性或异源核酸分子的腺病毒，如编码感兴趣的流感表位的外源性或异源核酸分子，例如一或多个感兴趣的流感表位和/或一或多个流感抗原；提供这样一种给药，其中诱导了免疫应答，如保护性免疫应答；用于执行这些方法的产品；执行这些方法产生的产品；这些方法的用途及其产物和其它。本发明提供一种在动物内进行非侵袭性遗传免疫的方法，包括这样的步骤用有效量的在动物体内诱导免疫应答的基因载体接触动物的皮肤。本发明还提供一种免疫动物的方法，包括以皮肤为目标非侵袭性输送包含基因载体的制品的步骤，通过此步骤，载体被上皮细胞摄取，对脊椎动物产生免疫效果。本发明还提供一种通过输送装置免疫动物的方法，包括将基因载体包括在输送装置中，用统一剂量包含在装置内的基因物质接触脊椎动物的裸露的皮肤，由此载体被上皮细胞摄取，在免疫活性皮肤组织中表达特异抗原。该基因载体可以是腺病毒重组体、DNA/腺病毒复合体、DNA/脂质体复合体，或是任何一种能表达脊椎动物皮肤抗原的其它基因载体。
在本发明的一个实施方案中，提供一种诱导免疫应答的方法，它包括这样的步骤通过给动物或个体的皮肤局部应用免疫有效浓度的编码感兴趣基因的基因载体而接触需要治疗的个体或动物的皮肤。
在本发明的另一实施方案中，提供一种在需要治疗的动物或个体内诱导保护性免疫应答的方法，它包括这样的步骤通过给动物的皮肤局部应用免疫有效浓度的载体而接触皮肤，载体编码的基因编码一种抗原，给药后它可在所述个体或动物体内诱导保护性免疫效应。
在另一实施方案中，本发明提供一种通过用DNA/腺病毒复合体接触裸露皮肤而在同一细胞内共表达转基因的方法。该方法允许通过在相同细胞环境中共产生细胞因子、共刺激分子或其它免疫调节剂与抗原来操纵免疫系统。
因此，本发明提供在动物内进行非侵袭性遗传免疫的方法和/或在动物内诱导免疫应答，如全身性免疫应答，或治疗性应答的方法，其产物和该方法的用途和其产物。本发明还提供包括用有效量的诱导动物体内免疫应答，如全身性免疫应答，和治疗性应答的载体接触动物皮肤的方法。还有，本发明提供这样的方法，其中载体包括并表达外源性核酸分子，该外源性核酸分子编码感兴趣的基因产物或表位。另外，本发明还涉及这样的方法，其中全身性免疫应答针对或来自表位或基因产物。
本发明还涉及这样的方法，其中核酸分子可编码感兴趣的表位和/或感兴趣的抗原，和/或刺激和/或调节免疫应答和/或刺激和/或调节表达，如转录和/或翻译，如内源性和/或外源性核酸分子的转录和/或翻译的核酸分子，和/或引起治疗性应答的核酸分子。
本发明还涉及这样的方法，其中核酸分子对于载体而言是外源性的。本发明还涉及这样的方法，其中外源性的核酸分子可编码一个或多个感兴趣的抗原或其部分，如一个感兴趣的来自病原体的表位，如一个或多个感兴趣的表位或抗原，包括流感血凝素，流感核蛋白，流感M2，破伤风毒素C-片段，炭疽保护抗原，炭疽致命因子，狂犬病糖蛋白，HBV表面抗原，HIVgp120，HIVgp160，人癌胚抗原，疟疾CSP，疟疾SSP，疟疾MSP，疟疾pfg，结核分支杆菌HSP，和/或治疗剂和/或免疫调节基因，如共刺激因子基因和/或细胞因子基因。也可参见美国专利5990091，WO 99/60164和WO 99/00166，这里引入参考。
还有，本发明还提供这样的方法，其中免疫应答由在动物细胞，如上皮细胞内表达核酸分子的载体诱导。本发明还提供这样的方法，其中免疫应答针对病原体或肿瘤。
本发明还提供在本发明方法中应用的组合物。例如，本发明提供预防性疫苗或治疗性疫苗或包括载体的免疫学或治疗性组合物，例如通过局部给药和/或粘膜和/或鼻腔和/或经舌和/或颊部和/或口服的和/或口腔给药来诱导或刺激应答。
此外，本发明还提供这样的方法和用于该方法的组合物，其中动物可以是鱼物，爬行动物，两栖类动物，禽或哺乳类动物等脊椎动，如人，或家养的、或同伴、或饲料生产或食物生产的、或家畜、或游戏或竞赛或运动动物，如牛、狗、猫、山羊、绵羊、马或猪；或鸡、鸭、火鸡等禽类。
本发明还提供这样的方法和用于该方法的组合物，其中载体可以是其中一些或所有病毒基因缺失的包括病毒外壳的一个或多个病毒，可以是细菌，原生动物，转座子，逆转录转座子和DNA载体，如是重组载体；腺病毒，如E1和/或E3和/或E4区缺陷的腺病毒。
本发明还提供E1和/或E3和/或E4区缺陷的腺病毒的鼻内和/或粘膜和/或经舌的和/或颊的和/或口服的和/或口腔给药，优选E1和E3和E4区缺陷的腺病毒，如包括外源性或异源核酸分子的腺病毒，如编码感兴趣的流感表位的外源性或异源核酸分子，例如一或多个感兴趣的流感表位和/或一或多个流感抗原。这种给药可作为一种诱导免疫应答的方法，如诱导保护性免疫应答的方法。这里的腺病毒可以是人腺病毒，也可是另一类型的腺病毒，如犬的腺病毒。因而，如果宿主或动物不是人，腺病毒可与宿主相匹配。例如，在兽医的应用中，宿主或动物是象狗这样的犬类，腺病毒可以是犬的腺病毒。
因此，本发明还涉及本发明的方法，其中载体与宿主相匹配，或者在宿主或动物中应用是有意义的载体，因为载体在动物内可表达感兴趣的异源或外源性的和同源基因产物，如在兽医的应用中，应用与动物相关的载体是有益的，例如在犬类中可使用犬的腺病毒；或者更通常的讲，载体可以是将要在其中施行该方法的宿主或动物的减毒或灭活的病原体。根据本公开的内容和该领域的知识，该领域的技术人员无需过多实验就可将载体与宿主或动物相配。
本发明还提供这样的方法，包括给动物的皮肤使用包括载体的输送装置，以及还包括将载体放置在输送装置内和/或输送装置上的方法，并涉及输送装置。
本发明还提供这样的方法和这样的载体，其中载体中所有病毒基因缺失。
本发明还提供这样的方法，其中载体可在动物内诱导抗肿瘤效应等治疗性效应，如通过表达癌基因、肿瘤抑制基因或肿瘤相关基因。
此外，本发明提供基因产物，如表达产物，和通过表达产生的免疫学产物(如，抗体)，来自该方法的细胞，及其体外和离体应用。表达产物和免疫学产物可用于分析、诊断等；表达免疫学产物的细胞和/或表达产物可从宿主中分离出来，体外扩增，重新导入宿主。
还有，尽管在所有的给药中都希望非侵袭性输送，但本发明可与侵袭性输送联合应用；并且，通常本发明可用作初次加强方案的部分。例如，本发明的方法可用作初次加强方案的部分，其中发明的非侵袭性方法的给药先于或后于或与其它给药一起使用，如其它相同或不同免疫学或治疗性成分的非侵袭性或侵袭性给药，例如，在非侵袭性给药之前、之中或之后给药，通过注射同一或相似病原体的不同疫苗或免疫组合物，如同一或相似病原体的完整或亚单位疫苗或免疫组合物，该病原体的抗原或表位被非侵袭性给药的载体表达。
本发明还包括以皮肤为目标的输送工具(绷带、粘附性敷料(adhesive dressing)、斑点制剂(spot-on formulation)及其应用工具，灌注制剂(pour-on formulation)及其应用工具，卷动制剂及其应用工具，香波制剂及其应用工具等)和其它非侵袭性疫苗或免疫学组合物及其应用，以及非侵袭性输送载体的组合物；制备非侵袭性输送载体的试剂盒。这样的试剂盒包括载体和可药用或适宜的载体或稀释剂和一适当的输送装置，每一个都在各自的包装内；该包装可包括在单个容器内或分装在不同的容器内或每一个都有其自己的容器；该试剂盒可选地包括成分混合和/或组合物给药的说明书。
灌注和斑点制剂在美国专利6010710和5475005中有描述。卷动制剂在美国专利5897267中也有描述。美国专利6010710、5475005和5897267的内容，其中引用或参考的文档，及在这些文档中引用或参考的文献在此引入作为参考。而且，技术人员也知道如何制作香波制剂及给动物应用该制剂的工具。
因此，本发明还包括所有为在这里所描述的方法中预期应用的基因载体。
需要指出的是，本发明中“包含、包括”具有美国专利法中的意思，如它们意味着“包括”等。
下面的详细描述中公开并包含了这些实施方案和其它实施方案。
附图简述下面的详细描述以实例的方式给出，但不意味着本发明限于所描述的具体实施方案中，相应的附图帮助理解本发明，附图在此引入作为参考，其中，

图1表示局部给药载体后，来自重组腺病毒的转基因在皮肤中的表达。
图2a和2b显示了可能的靶细胞的特征，该细胞可被局部给药的腺病毒重组体转导。
图3a和3b表示用腺病毒介导的NIVS免疫小鼠后，血清中特异抗体的检测。
图4表示接受致死量的肿瘤细胞攻击后，对照和免疫小鼠的存活率。
图5显示肿瘤浸润性T淋巴细胞的特征。
图6显示肿瘤浸润性CTLs的特征。
图7表示用局部使用的疫苗绷带免疫小鼠后，针对人CEA蛋白的抗体的蛋白质印迹分析。
图8a表示用DNA/腺病毒介导的NIVS免疫小鼠后，血清中特异抗体的检测。
图8b表示用DNA/脂质体介导的NIVS免疫小鼠后，血清中特异抗体的检测。
图9表示DNA编码的和腺病毒编码的转基因在靶细胞中的共表达。
图10表示局部使用的腺病毒重组体、DNA/腺病毒复合体、DNA/脂质体复合体中相关转基因的表达。
图11表示一种给药以皮肤为目标的非侵袭性疫苗的装置。
图12表示以皮肤为目标的非侵袭性疫苗在小鼠中产生的抗流感抗体。
图13表示病毒攻击后保护小鼠免于死亡。
图14表示猪尾短尾猿中含有编码流感HA的腺病毒载体的皮肤衬垫产生的ELISA抗体。
图15表示局部应用腺病毒载体后，皮肤中抗原斑点的重新定位。
图16表示以非侵袭性方式定位输送基因后，外源DNA在多种组织中的扩增。
图17表示NAIR等脱毛剂对于NIVS是非必须的。
图18表示局部应用或鼻内接种基于腺病毒的破伤风疫苗后接受破伤风梭菌攻击，可保护免于死亡。
发明详述以侵袭性方式接种疫苗也许是不必要的(Tang et al.，1997；Glenn etal.，1998)。因为皮肤直接接触外界环境并持续与潜在的病原体接触，所以免疫系统必须沿皮肤屏障不断地保持动态生物军以抵挡潜在的感染。结果，皮肤的外层实质上是免疫活性组织。皮肤中存在的引起体液和细胞毒性细胞免疫应答的免疫成分包括表皮郎罕氏细胞(它是MHC-II阳性抗原提呈细胞)，角化细胞，CD4+和CD8+T淋巴细胞。这些成分的存在使得皮肤成为一个给药疫苗的理想部位。皮肤的大面积和其耐久性是在该组织应用疫苗的其它优点。在皮肤的外层表达少量抗原而没有生理浸透，可通过提醒机体的免疫监视机制而引发有效的免疫应答。
在这里证实基因疫苗可作为以皮肤为目标的非侵袭性疫苗、或免疫原、或免疫学或治疗性组合物以新的方式进行接种。基因疫苗与非侵袭性输送方式的联合应用产生一新型“民主”疫苗、或免疫原、或免疫学或治疗性组合物，它们的给药要求很少或不要求特殊技术和装备。因此，一个人可给自己(该给药在医务工作者的指导下进行较好，例如保证剂量合适)或动物(如果动物是哺乳动物，优选剃除毛发的部位，尽管这里证明了去除毛发是非必须的，在动物不会通过摩擦、蹭毛或其它活动而移除给药的部位更有利)的皮肤给药该组合物。因此，本发明在包括表达基因产物的载体的疫苗、或免疫原、或免疫学或治疗性组合物的给药中提供了便利，尤其是给新生儿、年轻动物、动物、儿童等给药时，对于这些对象来讲，侵袭性给药如用针有一定的困难或不便或疼痛。
本发明指向一种在动物内进行非侵袭性遗传免疫或治疗的方法，它包括这一步骤用有效量的在动物体内诱导免疫应答的基因载体接触动物的皮肤。
这里所应用的载体是一种工具，它允许或便于把一个实体从一环境转移到另一环境。在重组载体技术中应用的一些载体允许实体，如DNA片段(如异源DNA片段，异源cDNA片段)被转移到靶细胞中。在一优选实施方案中，载体包括病毒载体、细菌载体、原生动物载体、DNA载体或其重组体。
这里所应用的“AdCMV-tetCIM”代表编码破伤风梭菌毒素C片段的腺病毒载体；“pCMV-tetC”代表编码破伤风梭菌毒素C片段的质粒表达载体。
参考美国专利5990091，1999年11月23日授权，Einat et al或Quark Biotech，Inc.，1999年11月25日出版的WO99/60164，它是1999年5月14日提交的PCT/US99/11066的公开，Fischer或Rhone Merienux，Inc.，1998年1月8日出版的WO98/00166，它是1997年6月30日提交的PCT/US97/11486的公开(要求美国申请系列号08/675556和08/675566的优先权)；Van Ginkel et al.，J.Immunol.159(2)685-93(1997)(“Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helpercell response to the vector and to its transgene”)；Osterhaus et al.，Immunobiology 184(2-3)180-92(1992)(“Vaccation against acuterespiratory virus inrections and measles in man”；Briles et al.，或UAB，WO99/53940，1999年11月28日出版，是1999年4月23日提交的PCT/US99/08895的公开；Briles et al或UAB，U.S.6042838，2000年3月28日授权；和Briles et al或UAB，U.S.6004802等，它们中集中了有关的信息表达的基因产物、抗体及其应用；体内或体外表达外源性核酸分子的载体；启动表达的或与要表达的核酸分子有效连接的启动子；制备载体的方法和文献；包括这些载体或核酸分子或抗体的组合物、剂量和给药状态和/或途径(包括粘膜、鼻腔、口、口腔、颊、经舌给药的组合物)等，它们可用于本发明的实施。因此，以下文献本文引为参考美国专利5990091，1999年11月23日授权，Einat et al或Quark Biotech，Inc.，WO99/60164，1999年11月25日出版，它是1999年5月14日提交的PCT/US99/11066的公开，Fischer或Rhone Merienux，Inc.，WO98/00166，1998年1月8日出版，它是1997年6月30日提交的PCT/US97/11486的公开(要求美国申请系列号08/675556和08/675566的优先权)；Van Ginkel et al.，J.Immunol.159(2)685-93(1997)(“Adenoviral gene delivery elicits distinct pulmonary-associated T helpercell response to the vector and to its transgene”)；Osterhaus et al.，Immunobiology 184(2-3)180-92(1992)(“Vaccation against acuterespiratory virus infections and measles in man”；Briles et al.，或UAB，WO99/53940，1999年11月28日出版，它是1999年4月23日提交的PCT/US99/08895的公开；Briles et al或UAB，U.S.6042838，2000，3，28授权；和Briles et al或UAB，U.S.6004802等，和所有在以下文献中引用或参考的文档或其中引用文献中引用或参考的文献美国专利5990091，1999年11月23日授权，Einat et al或Quark Biotech，Inc.，WO99/60164，1999年11月25日出版，它是1999年5月14日提交的PCT/US99/11066的公开，Fischer或Rhone Merienux，Inc.，WO98/00166，1998年1月8日出版，它是1997年6月30日提交的PCT/US97/11486的公开(要求美国申请系列号08/675556和08/675566的优先权)；VanGinkel et al.，J.Immunol.159(2)685-93(1997)(“Adenoviral gene deliveryelicits distinct pulmonary-associated T helper cell response to the vectorand to its transgene”)；Osterhaus et al.，Immunobiology 184(2-3)180-92(1992)(“Vaccation against acute respiratory virus infections andmeasles in man”；Briles et al.，或UAB，WO99/53940，1999年11月28日出版，它是1999年4月23日提交的PCT/US99/08895的公开；Brileset al或UAB，U.S.6042838，2000年3月28日授权；和Briles et al或UAB，U.S.6004802。美国专利5990091，1999年11月23日授权，WO99/60164，WO98/00166，Van Ginkel et al.，J.Immunol.159(2)685-93(1997)，Osterhaus et al.，Immunobiology 184(2-3)180-92(1992)，WO99/53940，U.S.6042838，U.S.6004802的信息可作为本发明实施的参考(例如表达的产物、抗体及其应用；体内或体外表达外源性核酸分子的载体；外源性核酸分子编码感兴趣的表位或抗原或治疗剂等；启动子；包括这些载体或核酸分子或表达的产物、抗体组合物，剂量等)。需要指出的是，按照本发明获得的免疫学产物和/或抗体和/或表达的产物可在体外表达，免疫学产物和/或抗体和/或表达的产物可以经典的方式应用，表达该免疫学产物和/或抗体和/或表达的产物的细胞可在体外和/或离体应用中使用，例如这些用途和应用包括诊断、分析、离体治疗(例如表达基因产物和/或免疫学应答的细胞在体外扩展，并重新导入宿主或动物)等，参见美国专利5990091、WO99/60164、WO98/00166、WO99/53940、美国专利6042838，和6004802，和这里引用的文档及在文档中引用或参照的文献。另外，用这里的方法或从按这里的给药方法体外扩展的细胞中分离出的表达抗体或基因产物，可在组合物中给药，与亚单位表位或抗原或治疗剂或抗体的给药类似，以诱导免疫性，刺激治疗性应答和/或刺激被动免疫。给药量要根据患者(宿主)和待治疗的情况而变化，可以从1微克或几微克到几百或几千微克变化，例如1ug-1mg，每天100ng/kg-100mg/kg体重，优选每天10pg/kg-10mg/kg体重。载体可非侵袭性地给予患者或宿主，其用量要达到基因产物(如，表位，抗原，治疗剂和/或抗体)组合物的量。当然，本发明正视低于和高于所举例中的剂量，和任何要给予人或动物的包括其成分的组合物，以及任何特殊的给药方法，因此优选确定其毒性，如在合适的动物模型，如鼠等啮齿类中确定其致死剂量(LD)和LD50；组合物的剂量；其成分的含量和给药组合物的时间选择，在该时间范围内，可诱导适宜的应答，如通过ELISA和/或血清中和试验来进行血清滴定和分析。根据技术人员的知识结构、这里的公开和引用的文档，这些确定不需要过多实验。并且，本发明还包括发明组合物的顺序给药或方法的顺序执行，例如阶段性的给药发明组合物，如治疗或处理病情的过程中，和/或免疫组合物的加强给药，和/或在初次加强方案中；并且顺序给药的时间和方式可不经过多实验而确定。此外，本发明包括制备和应用载体的方法和组合物，包括体内和/或体外和/或离体制备基因产物和/或免疫学产物和/或抗体(如后两种形式，可从来自按照发明进行了非侵袭性给药的宿主的细胞进行分离，如该细胞进行了适当的扩增)的方法；该基因和/或免疫学产物和/或抗体的用途，包括诊断学、化验、治疗学、处置等。载体组合物的配制是通过将载体与适当的载剂或稀释剂混合而进行；基因产物和/或免疫学产物和/或抗体组合物的配制是通过将基因和/或免疫学产物和/或抗体与适当的载剂或稀释剂混合而进行；参见美国专利5990091、WO99/60164、WO98/00166、WO99/53940、美国专利6042838，和6004802，和这里引用的文档，及这里引用的其它文档，和这里的其它教导(例如，与载剂、稀释剂等相关的)。
如果希望鼻腔或呼吸道(粘膜的)给药，组合物可由压挤喷射分配机、或气雾剂分配机来调剂，并以这样的剂型存在。这些分配机也可将组合物输送到口或口腔(如颊或舌)粘膜。气雾剂通常通过碳氢化合物而处于压力下。抽吸分配机优选调配米计量的药剂，或具有特殊颗粒大小的药剂。
本发明的组合物可包含可药用的调味剂和/或增色剂使它们更诱人，尤其如果口服的给药(经颊或经舌)时；该组合物可是片剂或胶囊，可溶于口或咬开可释放经颊或经舌吸收的液体(与硝酸甘油、nifedimen等治疗咽痛的口服的、经舌或经颊药剂相似)。粘性组合物可以是胶体、洗液、药膏、乳液等形式(例如为了局部和/或黏膜和/或鼻腔和/或口和/或口腔和/或经舌和/或经颊给药)，传统的包含足量的增稠剂，这样粘性为2500-6500cps，尽管也可使用粘性高至10000cps的粘性组合物。优选粘性组合物的粘度在2500-5000cps，因为高于这个范围会难于使用。但是，高于这个范围组合物会成为固体或胶体形式，它们可作为口服消化的吞咽丸、和/或口含的丸剂或胶囊或片剂容易的给药，如经颊或经舌给药。
通常液体制剂比胶体、其它粘性组合物和固体组合物易于制备。此外，液体组合物有些更便于给药，尤其是通过注射或口服或经颊或经舌给予动物、儿童、尤其是小孩儿和其它难于吞咽丸剂、胶囊、片剂者或处于多种药剂时。另一方面，粘性组合物可调配在适当的粘性范围内，以提供较长的与粘膜接触的时间，如胃皱褶或鼻腔黏膜或经舌或经颊或口腔吸收的时间。
很明显，适宜载体和其它添加剂的选择要取决于具体的给药途径和具体的药剂形式的性质，如液体制剂(例如，组合物被调配成溶液、悬液、胶体或另外的液体形式)，或固体制剂(例如，组合物被调配成丸剂、片剂、胶囊、囊片、时间释放形式或液体充盈形式)。
通常，除抗原、脂蛋白和适当的佐剂以外，溶液、悬液和胶体含有占主要量的水(优选纯化水)。也存在其它次要量的成分，如pH调节剂(如NaOH等碱)、乳化剂或调配剂、缓冲液、防腐剂、致湿剂、使成凝胶状的试剂(如甲基纤维素)、增色剂和/或调味剂。该组合物可是等渗的，即它具有与血和泪腺的液体相同的渗透压。
所期望的本发明组合物的等渗性可应用氯化钠或其它可药用的试剂来完成，如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶剂。氯化钠尤其是包含钠离子的缓冲液优选。
通过应用可药用的增稠剂，组合物的粘度可维持在所选水平。优选甲基纤维素，因为它容易获得且经济，还容易操作。其它适宜的增稠剂包括，例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选剂量取决于所选试剂。重要的一点是应用的量可达到所选粘度。粘性组合物的制备通常是通过向溶液中添加这些增稠剂。
可药用的防腐剂可用于增加组合物自身的保存期。尽管许多防腐剂，包括如parabens、硫柳汞、三氯叔丁醇或苯扎氯铵等也可应用，但苄醇合适。防腐剂适当的剂量可占总重量的0.02％-2％，尽管根据所选试剂可作适当调整。
该领域的技术人员会认识到，组合物的成分必须选择对感兴趣的载体或抗原或表位和可选择的佐剂或其它活化或免疫增强成分来讲是化学惰性的。这对于化学和药学原则领域的技术人员是不存在问题的，或者通过参考标准文件或通过简单的实验(无需过多实验)，通过该公开和其中引用的文档，问题可很容易地解决。
本发明的免疫学效应组合物的制备是按通常的程序混合其成分。例如，所选成分可在搅拌机内简单混合，或在其它制造浓缩混合物的标准装置内进行混合，然后通过添加水或增稠剂把它调整到最终的浓度和粘度，并可能添加缓冲液来调控pH或额外的溶液来控制张力。通常pH值为3-7.5。组合物可在药剂中给药，可通过医学和兽医领域的技术人员熟知的技术给药，要考虑到诸如年龄、性别、体重和具体患者或动物的状况和给药的组合物的形式(如固体还是液体)等因素给药。给人或其它哺乳动物应用的剂量可由技术人员进行确定，而不用过多实验。他们根据该公开、其中引用的文档、下面的实施例，和这里引用的申请、专利和其它引用的文档和在该文档中引用的文献或参照进行确定，所有这些均在此引入作为参考。
初次给药和加强剂量或依次给药的合适策略也是可变的，可包括一次初次给药，随后进行后来的给药；虽然如此，可由技术人员进行确定，他们根据该公开、这里引入作为参考的文档，包括其中引用的申请和专利，在该文档中引用的文献或参照，以及下面的实施例进行确定，所有这些均在此引入作为参考。该组合物可单独给药或与本发明的其它组合物或与其它预防性或治疗性组合物共给药或依次给药。
在本发明的另一有利实施方案中，载体表达编码流感血凝素，流感核蛋白，流感M2，破伤风毒素C-片段，炭疽保护抗原，炭疽致命因子，狂犬病糖蛋白，HBV表面抗原，HIVgp120，HIVgp160，人癌胚抗原，疟疾CSP，疟疾SSP，疟疾MSP，疟疾pfg，结核分支杆菌HSP或其突变体的基因。
在本发明的一实施方案中，动物体内免疫应答通过基因载体诱导，该载体在动物细胞内表达编码感兴趣抗原的基因。在本发明的另一实施方案中，感兴趣的抗原选自流感血凝素，流感核蛋白，流感M2，破伤风毒素C-片段，炭疽保护抗原，炭疽致命因子，狂犬病糖蛋白，HBV表面抗原，HIVgp120，HIVgp160，人癌胚抗原，疟疾CSP，疟疾SSP，疟疾MSP，疟疾pfg，结核分支杆菌HSP。在该方法的另一实施方案中，免疫应答针对病原体或肿瘤。在该方法的另一实施方案中，基因载体用作防御性疫苗或治疗性疫苗。在本发明的另一实施方案中，基因载体包括能在动物细胞内表达感兴趣抗原的基因载体。在该方法的另一实施方案中，动物是脊椎动物。
关于要在载体内表达的外源性DNA(如编码感兴趣的表位和/或抗原和/或治疗剂)和提供该外源性DNA的文献，以及关于增强核酸分子表达的转录和/或翻译因子的表达，“感兴趣的表位”、“治疗剂”、“免疫应答”、“免疫学应答”、“保护性免疫应答”、“免疫学组合物”、“免疫原组合物”和“疫苗组合物”等术语要参照美国专利5990091，1999年11月23日授权，WO99/60164，WO98/00166，它们均在此引入作为参考。因此，美国专利5990091，WO99/60164，WO98/00166，和这里引用的文献，在这些专利或PCT申请审批过程中的记录或文献，这里引用的其它文献或其它引入作为参考的，可在本发明的实践中参考；所有在这里提及的外源性核酸分子、启动子和载体可在本发明的实践中应用。在这点上，还要提及美国专利6004777，5997878，5989561，5976552，5972597，5858368，5863542，5833975，5863542，5843456，5766598，5766597，5762939，5756102，5756101，5494807，6042838，6004802和WO99/53940。
在本发明的另一实施方案中，动物优选为脊椎动物，如哺乳动物、禽、爬行动物、两栖类动物或鱼；更优选的是人或其同伴或家养的、或食物或饲料生产的、或家畜、或游戏或竞赛或运动动物，如牛、马、狗、猫、山羊、绵羊或猪、和鸡、鸭、火鸡等禽类。在本发明的另一特别优选实施方案中，脊椎动物是人。在本发明的另一实施方案中，基因载体是病毒载体、细菌载体、原生动物载体、转座子、逆转录转座子、病毒外壳和DNA载体。在本发明的另一实施方案中、病毒载体、细菌载体、原生动物载体是重组载体。在本发明的另一实施方案中，免疫应答是针对流感A。在本发明的另一实施方案中，针对流感A的免疫应答由基因载体诱导，该载体在动物细胞内表达的基因编码流感血凝素，流感核蛋白，流感M2或其片段。在本发明的另一实施方案中，基因载体选自病毒载体和质粒DNA。在本发明的另一实施方案中，基因载体是腺病毒。在本发明的另一实施方案中，腺病毒E1区缺陷。在本发明的另一实施方案中，腺病毒E3区缺陷。在本发明的另一实施方案中，腺病毒E1区和E3区缺陷。在本发明的另一实施方案中，DNA是质粒形式的。在本发明的另一实施方案中，接触步骤还包括将含有感兴趣基因的基因载体放置到输送装置上，并将具有基因载体的该输送装置应用到动物的皮肤上。在本发明的另一实施方案中，基因载体编码免疫调节基因，共刺激基因或细胞因子基因。在本发明的另一实施方案中，载体具有所有缺失的病毒基因。在本发明的另一实施方案中，基因载体在动物体内诱导抗肿瘤效应。在本发明的另一实施方案中，基因载体表达癌基因，肿瘤抑制基因或肿瘤相关基因。
本发明还提供一种在动物中进行非侵袭性免疫的方法，包括这样的步骤用有效量的在动物内能诱导免疫应答的基因载体接触动物的皮肤。
应用本发明的方法，能用于诱导免疫应答的抗原的代表性例子包括流感血凝素，流感核蛋白，流感M2，破伤风毒素C-片段，炭疽保护抗原，炭疽致命因子，狂犬病糖蛋白，HBV表面抗原，HIVgp120，HIVgp160，人癌胚抗原，疟疾CSP，疟疾SSP，疟疾MSP，疟疾pfg，结核分支杆菌HSP等。最优选，免疫应答对肿瘤或感染性病原体产生保护性效果。
本发明的实行包括用免疫动物或给药治疗剂的非侵袭性程序，将有效编码多肽的基因载体输送到脊椎动物的外层皮肤。可不用任何装置直接将基因物质转移到皮肤，或利用绷带或绷带样装置使之接触皮肤，从而将基因载体给药到脊椎动物。在首先应用中，该基因载体是水溶液。也可用由冷冻干燥粉重新构成的载体。该载体可编码一完整的基因、一个或几个基因的片段、与免疫调节序列融合的基因片段，如泛素或富含CpG的合成DNA等免疫调节序列，它们与表达必须的转录/翻译信号一起。
在本发明的另一实施方案中，载体还包含选自共刺激基因或细胞因子基因的基因。在该方法中，基因选自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、IL-2基因、IL-12基因和干扰素基因。
在本发明的另一实施方案中，反应是针对破伤风梭菌感染的，或载体包括AdCMV-tetCIM或pCMV-tetC。在本发明的另一实施方案中，外源性核酸分子编码破伤风毒素C片段或破伤风毒素的一个抗原或表位。
本发明还提供一种方法，它非侵袭性诱导针对流感A病毒的免疫应答，该方法包括这样的步骤通过给皮肤应用免疫学上有效量的基因载体，局部接触需要进行这样处理的目标物的皮肤，该载体编码流感特异的抗原或其片段，实施后，该抗原可在动物内诱导抗流感效应。在本方法的一实施方案中，基因载体选自病毒载体和质粒DNA。在本方法的另一实施方案中，基因载体是腺病毒。在本方法的另一实施方案中，腺病毒载体E1和E3区缺陷。在本方法的另一实施方案中，DNA是质粒。在本方法的另一实施方案中，接触的步骤还包括将含有感兴趣基因的基因载体放置到输送装置上，并将具有基因载体的该输送装置应用到动物的皮肤上。
本发明应用腺病毒重组体的实施方案，包括E1缺陷、E3缺陷和/或E4缺陷的腺病毒载体，或缺失所有病毒基因的“无内脏”腺病毒载体。E1突变提高了载体的安全度，因为E1缺陷的腺病毒突变体在非准许细胞内复制不完全。E3突变通过破坏腺病毒下调MHC-I类分子的机制而增强了抗原的免疫原性。E4突变通过抑制后面的基因表达降低了腺病毒载体的免疫原性，从而允许利用同一载体进行重复的再接种。“无内脏”腺病毒载体是腺病毒家族中最新的模型。它的复制要求一辅助性病毒和一特殊的人293细胞系，它表达E1a和Cre，这在自然环境中是不存在的；该载体被去除掉所有的病毒基因，这样该载体作为疫苗载体是非免疫原性的，并可多次再接种。“无内脏”腺病毒载体还包含36kb的空间来容纳转基因，这样就能将大量的抗原基因共输送到细胞。RGD等特殊的基元序列可插入到腺病毒的H环，以提高其感染力。腺病毒重组体的构建可通过将特异的转基因或转基因片段克隆到上述的腺病毒载体中进行。腺病毒重组体用于以非侵袭性方式转导脊椎动物的上皮细胞，或用作免疫试剂。
本发明应用DNA/腺病毒复合体的实施方案，可用合适的试剂如PEI(聚乙撑亚胺)或聚赖氨酸将质粒DNA与腺病毒载体联合。在复合体中的腺病毒载体可以是“活的”或被UV或γ射线“杀死的”。放射灭活的腺病毒载体作为受体-结合配体和胞内体裂解剂，有利于DNA介导的转染(Cotton et al.，1992)，可提高疫苗载体的安全度。DNA/腺病毒复合体用于以非侵袭性方式转染脊椎动物的上皮细胞，或用作免疫试剂。
本发明应用DNA/脂质体复合体的实施方案，可有形成脂质体的材料，DNA/脂质体复合体由这些材料制备。DNA/脂质体复合体用于以非侵袭性方式转染脊椎动物的上皮细胞，或用作免疫试剂。
本发明所提供的基因载体还可编码免疫调节分子，它可作为佐剂来激起体液和/或细胞免疫应答。这些分子包括细胞因子、共刺激分子或任何可改变免疫应答过程的分子。人们可设想这样的途径，其中可调整该项技术以进一步增强抗原的免疫原性。
NIVS应用的基因载体可采取任何一种形式，并且本发明不限制于任何编码任何特殊多肽的遗传物质。包括病毒载体、细菌载体、原生动物载体、转座子、逆转录转座子、病毒样颗粒和DNA载体在内的所有形式的基因载体，当用作以皮肤为目标的非侵袭性疫苗载体时，在本发明预期的方法中。
可以用包括无工具局部应用的各种方法来输送基因，或通过衬垫或绷带，如粘附的绷带将基因覆盖到动物的皮肤表面。图11中显示了一非侵袭性疫苗接种的工具。该疫苗输送装置包括不引起过敏的、皮肤粘附的衬垫，其中放置了一个气泡。在一实施方案中，该衬垫还包括塑胶，直径大约1cm。可把疫苗放置到气泡中。在一实施方案中，气泡包含大约1mL的疫苗(液体，冷冻干燥粉与重建液体，其变异体)。在优选实施方案中，与皮肤接触的气泡表面有意弱于对面，这样当给对面施加压力时，较低的面破裂并释放气泡中的疫苗到皮肤上。塑胶衬垫将疫苗圈制于皮肤的表面。
本发明感兴趣基因和基因载体局部给药的药剂形式包括液体、药膏、粉剂和喷雾剂。活性成分可在无菌条件下与期望的或要求的生理性载体和任何防腐剂、缓冲液、推进物或吸收增强剂混合。参考文献有，如美国专利5990091，6042838，6004802，WO99/60164，WO98/00166，WO99/53940，和在以下方面引用的文献构建载体的方法，局部给药的组合物，如可以是乳液或药膏形式的粘性组合物，和鼻腔和/或粘膜和/或口腔和/或颊和/或经舌给药的组合物。
这里应用的术语，免疫学效应量是指编码感兴趣基因的基因载体的浓度或量，当给予动物时，可诱导针对感兴趣的基因产物的免疫应答。
可通过其不同浓度的表达，局部输送各种表位、抗原或治疗剂。通常，腺病毒载体的有效量至少接近100pfu，而质粒DNA至少接近1ngDNA。根据本公开和该领域的知识，包括在此引入作为参考的文献，不用过多实验，可确定其它用量。
本发明的方法可作为预防性疫苗接种适当用于预防疾病，或作为治疗性疫苗接种适当用于治疗疾病。
本发明的疫苗可单独或作为免疫学组合物的一部分给予动物。
除了作为人疫苗外，本发明的方法可用于免疫动物。术语动物指包括人类的所有动物。动物的例子包括人、牛、狗、猫、山羊、绵羊、马、猪、火鸡、鸭和鸡等。因为所有脊椎动物的免疫系统运作简单，所以所述应用在所有脊椎动物系统均可执行。
下面的实例是为了说明本发明的各种实施方案，并不意味着本发明以任何方式限定于此。
实施例方法小鼠和细胞培养近交系小鼠来自位于伯明翰的阿拉巴马州立大学。在含2％胎牛血清和6％牛血清的PRMI 1640或DEME培养基中培养细胞。
基因载体的局部应用麻醉小鼠，用刷子或脱毛剂(如NAIR)除去覆盖在腹部有限区域或颈部皮肤的毛发和角质化表皮。将基因载体吸取到预先刮过的皮肤上，并与裸露的皮肤接触不同时间(例如1-18小时)。可将载体直接吸到裸露的皮肤上，或将它吸到吸附到皮肤上的圆柱体中。
腺病毒载体的制备从用特异的腺病毒重组体感染的人293细胞制备高滴度的腺病毒储存物。通过氯化铯梯度对裂解物进行超离。提取病毒带，对10mMTris(pH7.5)/135mM NaCl/5mM KCl/1mM MgCl2进行透析。将甘油加到10％的纯化病毒过滤除菌，分装-80℃储藏。通过斑点实验测定腺病毒储存物的滴度。
荧光素酶实验按以前描述的(Tang，1994)的方法测定皮肤中荧光素酶的含量。简要地，用Kontes玻璃组织匀浆器在裂解缓冲液中对切下的皮肤进行匀浆。离心去除组织碎片后，用荧光仪通过检测过量ATP和荧光素存在下发射的整合光来测定皮肤提取物中荧光素酶的活性。
β-半乳糖苷酶分析将一块切下的皮肤迅速在Tissue-Tek O.C.T.化合物(MilesLaboratories Inc)冷冻到液氮中，-80℃储藏，备用。将冰冻组织切片，4um，在4％多聚甲醛中固定，按以前描述的(Tang，1994)的方法，通过与X-gal染色溶液温育来染β-半乳糖苷酶活性。用苏木精和伊红复染切片。
DNA/腺病毒复合体的制备DNA/腺病毒复合体的制备是将100ug质粒DNA与1×1011腺病毒颗粒混合，每一申请中均存在胶连剂赖氨酸。通过吸收测定腺病毒的滴度。
DNA/脂质体复合体的制备DNA/脂质体复合体的制备是在每一申请中均将100ug质粒DNA与100ug DOTAP/DOPE(1∶1，Avanti)混合。用Qiagen Plasmid Maxi Kits制备质粒。
蛋白质印迹分析血清来自尾血，稀释到1∶250-1∶500。纯化的蛋白用SDS-PAGE进行分离，然后转移到Immobilon-P膜(Millipore)上，与血清反应。用ELC试剂盒(Amersham)观察反应。
实施例1本发明证实抗原基因可以简单方式输送到小鼠的皮肤，它通过以皮肤为目标非侵袭性输送基因载体而不应用复杂设备。图1表示输送有限量的AdCMV-luc(编码萤火虫荧光素酶的腺病毒载体)(Tang，1994)到皮肤后，产生了大量的荧光素酶。Ad，腺病毒；pfu，；LU，光单位。结果是log[LU/cm2]均值±SE(n在每一柱的顶部给出)。应用了mock的小鼠或用不编码荧光素酶的腺病毒载体覆盖的小鼠，其皮肤中检测不到荧光素酶活性。腺病毒载体在皮肤中表达转基因的水平似乎与病毒的滴度不相关。有可能是在有限的皮肤中只有少量的细胞能被病毒转导，108菌斑形成单位(pfu)的腺病毒重组体会使靶细胞饱和。这种可变性也可能部分由于小鼠的个体差异造成。此外，其中一些可变性可能由于剃除角质化表皮的程序造成，该程序还没标准化(Johnston and Tang，1994)。也许，在更大面积上应用更多载体可潜在地扩增产生的抗原量。
实施例2将编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(AdCMV-βgal)(Tang etal.，1994)的腺病毒载体以非侵袭性方式输送到皮肤后，用X-gal底物对冰冻切片进行染色，结果表明在皮肤上进行非侵袭性疫苗接种其主要的靶细胞是毛囊中的毛发基质细胞(图2a)和表皮最外层的角质化细胞(图2b)。在被处理的皮肤上没发现物理磨损，没有诱导炎症。在将108pfu AdCMV-βgal吸到皮肤上1天后，切下接受非侵袭性基因输送的皮肤组织，横切，固定，用X-gal底物染色(Tang et al.，1994)。图2a中显示腺病毒转导的毛囊中的毛发基质细胞，X150。图2b显示腺病毒转导的表皮最外层的角质化细胞，X150。在对照动物，或应用mock或覆盖AdCMV-luc的动物，中没发现蓝色细胞。
实施例3腺病毒介导的NIVS诱发体液免疫应答NIVS是一种给动物接种疫苗的新方法。为了证明该方法能诱发机体对载体编码的抗原产生特异的免疫应答，将AdCMV-hcea(一个编码人癌胚抗原(CEA)的腺病毒载体)吸到C57BL/6小鼠的皮肤上。以非侵袭性方式输送108pfu AdCMV-hcea到皮肤后1个月，从被接种小鼠取血，将其血清1∶500稀释，与用5％SDS-聚丙烯酰氨分离，转移到Immobilon-P膜(Millipore)上的纯化的人CEA蛋白(T.Strong提供)和腺病毒蛋白反应。参见图3a，1道是0.5ug的人CEA；2道是0.5ugBSA；3道是108pfu的腺病毒。图3a显示来自被接种动物的血清在蛋白质印迹中与纯化的人CEA蛋白反应，但与牛血清白蛋白(BSA)不反应，该结果支持这样的结论以皮肤为目标的非侵袭性基因输送的结果是产生针对腺病毒载体编码的外源性蛋白特异性抗体。
为了验证该技术能否推广使用，将AdCMV-hgmcsf(一个编码人粒单集落刺激因子(hGM-CSF)的腺病毒载体)应用到皮肤上。为了检测针对人GM-CSF蛋白的抗体，通过以非侵袭性方式输送107pfuAdCMV-hgmcsf到皮肤来给动物接种。用15％SDS-聚丙烯酰氨分离纯化的人GM-CSF蛋白(CalBiochem)，并转移到膜上，与稀释的血清反应。其它处理按在图3a中描述的进行。参见图3b，1道是0.25ug的人GM-CSF；2道是0.25ug BSA；3道是107pfu的腺病毒。复制缺陷的人腺病毒血清型5来源的AdCMV-hcea和AdCMV-hgmcsf在人293细胞中产生。将包含人CEA基因或人GM-CSF基因的cassette插入到Ela缺失部位，该cassette由巨细胞病毒(CMV)早期增强子-启动子元件驱动。因为Ela区的序列被缺失，所以这些病毒在非许可细胞中的自主复制能力被消弱。
结果(Tang et al.，1997)显示以非侵袭性方式输送AdCMV-hcea到皮肤后1个月，96％(23/24)的C57BL/6系小鼠产生针对人CEA蛋白的抗体；而以非侵袭性方式输送AdCMV-hgmcsf到皮肤后，有43％(6/14)的同一系小鼠产生针对人GM-CSF蛋白的抗体。NIVS之前收集的免疫前血清和不接受免疫动物的血清均不与人CEA蛋白和GM-CSF蛋白反应。通过(1)在动物麻醉苏醒前从皮肤上洗走载体(2)吸取载体到未去毛的皮肤上(3)将没接受免疫的动物与接种了的动物混在一个笼中，消除通过疏整毛发过程中咽入载体而产生口服接种的可能性。没接受免疫的动物与接种了的动物之间没发现交叉免疫，剔毛似乎是NIVS的基本成分，可能由于沿剔毛带机械性除去角质化表皮。因此，腺病毒介导的NIVS可诱发机体针对载体编码的抗原产生体液免疫应答。
实施例4
为了验证本发明的技术能否诱发保护性抗肿瘤免疫应答，将表达人癌胚抗原(CEA)基因(MC38-CEA-2)(Conry et al.，1995)的同源肿瘤细胞接种到自然状态的C57BL/6系小鼠和局部使用了编码人CEA基因(AdCMV-hcea)的腺病毒载体的同系小鼠。观察接受肿瘤攻击后动物的生存率(图4)。在对照组，90％(9/10)的动物产生了可触摸到的肿瘤结，在肿瘤接种后30天死亡。在接种疫苗组，仅有10％(1/10)死亡，70％(7/10)全程保持无肿瘤。当肿瘤的直接超过1cm时使小鼠安乐死。注射肿瘤细胞和无痛处死之间的间隔用作个体的生存时间。参见图4，对照组(未接种疫苗)和用NIVS(局部应用108pfuAdCMV-hcea一个月后)免疫的动物接受肿瘤攻击。圆括号中的数字代表每一组的动物数。结果显示基因疫苗非侵袭性输送到皮肤上可诱导产生针对表达特异抗原的肿瘤细胞的保护性抗肿瘤反应。
实施例5编码细胞因子和共刺激因子基因的重组腺病毒载体的构建构建编码细胞因子和共刺激因子基因的腺病毒载体，使这些免疫调节基因与抗原基因一起共输送到皮肤细胞，试图在被接种的动物内指导免疫轮廓。腺病毒载体AdCMV-mB7.1编码鼠的B7.1基因，腺病毒载体AdCMV-mgmcsf编码鼠的GM-CSF基因，它们的构建是通过两个转染的质粒在人293细胞中同源重组，其后是产生新腺病毒载体的标准程序(Gomez-Foix et al.，1992)。在这些载体中的所有转基因的转录均由CMV早期增强子-启动子元件驱动。通过用抗CD80抗体(PharMingen)染转导的人肺细胞癌SCC-5细胞，然后进行流式分析来确定AdCMV-mB7.1的特征。通过用ELISA kit(Amersham)检测转导的SCC-5细胞分泌的鼠GM-CSF确定AdCMV-mgmcsf的特征。
实施例6通过体内细胞毒性实验检测抗肿瘤免疫体内细胞毒性实验的开展是将靶细胞以单层形式种植到小鼠肌肉组织(Tang etal.，1996).以单层形式种植靶细胞可以在体内生长数天后有效重获靶细胞以评估其命运。该方法对检测弱的不足以清楚靶细胞的免疫应答尤为有用。可通过接种床的组织学分析来显示免疫应答的特征。如果没有免疫应答，靶细胞就会生长。如果有有效的免疫应答，靶细胞被清除，在接种床存在大量的免疫效应细胞，可能由于游到并围绕生长的靶细胞原位致敏。如果免疫应答较弱，生长的靶细胞会与浸润的免疫效应细胞在接种床混合存在。将5×105RM1-luc细胞(RM1前列腺肿瘤细胞表达荧光素酶基因)单层接种到天然状态的C57BL/6系小鼠，因RM1-luc细胞体内增殖形成肿瘤单层，没有明显的免疫干扰。与对照动物相对照，通过AdCMV-luc非侵袭性皮肤输送而被免疫的动物中，RM1-luc细胞与大量的免疫效应细胞在接种床混合存在。
实施例7肿瘤细胞动员的免疫效应细胞的鉴定体内细胞毒性实验通过将少量单层形式的靶细胞种植到肌肉上，可将大量的免疫效应细胞集中在接种床。接种床上特异性免疫效应细胞的特征可以为是否诱导了杀伤靶细胞的细胞免疫应答提供证据。为了确定通过AdCMV-luc非侵袭性皮肤输送而被免疫的动物中T细胞的特征，T细胞被表达荧光素酶的肿瘤细胞所动员，用抗CD3单抗(mAb)对种植床组织切片进行染色。RM1-luc细胞的制备是将pHBA-luc脂质体转染到RM1前列腺肿瘤细胞，然后用含有G418的培养基筛选。通过荧光素酶实验对表达荧光素酶的克隆进行定性。以单层形式将5×105RM1-luc细胞种植到小鼠中，小鼠通过108pfu AdCMV-luc非侵袭性皮肤输送而被免疫。5天后，在O.C.T.中冷冻种植床，切片4um，100％丙酮中干燥，用抗CD3单抗(克隆F500A2，由UAB的P.Bucy提供)进行染色，用DAB作为色原进行ABC免疫过氧化物酶程序。
如图5所示，通过AdCMV-luc非侵袭性皮肤输送而被免疫的小鼠中，RM1-luc细胞在体内生长5天后，大量的T细胞浸润到种植床(X150)，而在天然状态的小鼠中仅看到几个T细胞。这表明与天然状态的小鼠相比，在被免疫的小鼠中，同样数量的RM1-luc靶细胞能动员更多的T淋巴细胞到种植床。
为了对被靶细胞动员的CTL进行定性，用反义粒酶A RNA分子作探针对种植床的冰冻切片进行原位杂交。以单层形式将5×105RM1-luc细胞种植到天然状态的C57BL/6系小鼠或通过108pfu AdCMV-luc非侵袭性皮肤输送而被免疫的小鼠中。5天后，在O.C.T.中冷冻种植床，切片4um。用3％多聚甲醛固定冰冻切片，在0.2M HCl中温育以抑制内源性碱性磷酸酶的活性，用热变性的反义粒酶A RNA探针进行杂交。原位杂交的探针是单链RNA分子，由包含细菌噬菌体启动子的质粒转录而成。在转录过程中，地高辛-UTP直接参入到序列中。正义序列的探针用作阴性对照。与探针杂交后，洗涤切片，并与偶联碱性磷酸酶的抗地高辛抗体温育，然后在NBT/BCIP酶底物溶液中温育。
表达粒酶A的CTL是活化的CTL，可在移植过程中用作组织排斥的预测性标志。粒酶阳性CTL仅在通过AdCMV-luc非侵袭性皮肤输送而被免疫的动物中，在RM1-luc种植床中发现(图6)。它们在种植床中的存在提示NIVS可诱导机体针对表达特异抗原的肿瘤细胞产生细胞免疫应答。
实施例8用粘附性绷带局部应用基因疫苗第一次证明绷带可用于疫苗的给药。这项发展使得没受过医学训练的人能将统一剂量的非侵袭性疫苗输送到皮肤上。为了用绷带传导皮肤，将50ul实施例7中的AdCMV-luc载体吸取到粘附性绷带的衬垫中(Johnson & Johnson).然后将包含载体的绷带粘附到小鼠预先剔毛的皮肤上。载体与裸露的皮肤持续接触18小时。化验皮肤的荧光素酶，以检测由绷带输送的基因载体对转基因的表达(表1)。尽管结果有很大的差异，但应用粘附性绷带转基因可在皮肤中表达。
为了证明用非侵袭性粘附性绷带可对动物进行疫苗接种，在将含有AdCMV-hcea的绷带粘附到小鼠皮肤后两个月，从小鼠尾部取血，检测其血清中的抗CEA抗体。如图7所示，在通过粘附性绷带而接受非侵袭性疫苗的小鼠中100％(10/10)可检测到抗CEA抗体。
实施例9DNA/腺病毒介导的NIVS将质粒DNA结合到腺病毒的外部会使以腺病毒为基础的载体更通用。所得载体系统对广泛的靶细胞介导高效基因输送。该方法大大增加了外源基因大小和设计的弹性。因此，通过同样更有弹性的腺病毒受体介导的内吞途径，DNA/腺病毒复合体可将抗原基因输送给皮肤。
为了证明DNA/腺病毒介导的NIVS的可能性，编码人生长激素的质粒DNA(pCMV-GH)(Tang et al.，1992)与E4缺陷的腺病毒联合。让DNA/腺病毒复合体与裸露的皮肤接触1天，以此来给小鼠(C57BL/6系)进行疫苗接种。然后通过测验尾血的血清，监测被免疫小鼠产生抗人生长激素蛋白(hGH)抗体的情况。如图8a所示，1道是hGH(0.5ug)；2道是BSA，(0.5ug).在蛋白质印迹中待检血清与纯化的hGH反应，但不与不相关蛋白反应。在10只用DNA/腺病毒复合体免疫的小鼠中，3个月内有8(80％)只小鼠产生了抗hGH抗体。这表明质粒DNA与腺病毒联合以非侵袭性方式给药，可诱导机体产生抗质粒DNA编码的外源性蛋白的特异性抗体。在免疫前收集的非免疫血清、未处理动物的血清、接种了无关载体的动物的血清均不与hGH反应。因此，如同腺病毒重组体，DNA/腺病毒复合体是NIVS的合理的载体系统。
实施例10DNA/脂质体介导的NIVS除了开发包括腺病毒的基因载体作非侵袭性疫苗的载体外，还证明局部应用没有病毒元件的DNA/脂质体可对小鼠进行疫苗接种。很明显，在给药以皮肤为目标的非侵袭性疫苗的创造性方法中许多不同的载体可以应用。如图8b所示，1道是hGH(0.5ug)；2道是BSA，(0.5ug).待检免疫血清，通过局部应用编码hGH的DNA/脂质体复合体来免疫小鼠，与hGH反应，但不与BSA反应。在10只用DNA/脂质体复合体免疫的小鼠中，5个月内有9(90％)只小鼠的血清与纯化的hGH反应。因此，如同腺病毒和DNA/腺病毒复合体，DNA/脂质体重组体是NIVS的另一个合理的载体系统。
实施例11DNA编码的和腺病毒编码的转基因的共表达增强免疫系统应答的策略可潜在地提高疫苗的临床效果。参与淋巴细胞种群活化和扩增的免疫调节分子的局部产物可显著提高接种疫苗的效果。制备编码鼠类B7-1和GM-CSF基因的腺病毒。因此，DNA/腺病毒复合体的局部应用，可在个体的皮肤细胞中与腺病毒编码的抗原或免疫调节分子一起共表达DNA编码的抗原或免疫调节分子，以增强对抗原的免疫应答。
图9表示靶细胞中转基因从质粒DNA的表