专利名称：表达免疫调节分子的重组呼吸道合胞病毒的制备的制作方法人呼吸道合胞病毒(HRSV)是世界范围内严重儿科呼吸道疾病的首要病因(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996；在此引用作为参考)。RSV是超过所有其它病毒的诱发1岁以下幼儿肺炎和细支气管炎的病原。几乎所有的儿童在两岁时都被感染，再次感染以可观的频率发生于较大的儿童和青年中(Chanock等，于ViralInfection of Humans，3rded.，A.S.Evans，ed.，Plenum Press，N.Y.，1989；在此引用作为参考)。因呼吸道疾病引起的儿科入院的五分之一是由RSV引起的，并且仅在美国每年造成10万例入院和4,500例死亡(Heilman等，J.Infect.Dis.161402-6，1990；在此引用作为参考)。此外，有证据表明生命早期的严重呼吸道感染可以引发或恶化哮喘(Sigurs等，Pediatrics 95500-505，1995；在此引用作为参考)。尽管RSV通常被认为感染儿童群体，也发现它是较老的人中严重疾病的重要诱因(Falsey等，J.Infect.Dis.172389-394，1995；在此引用作为参考)。RSV也在某些无免疫应答的个体(如骨髓移植受体)中引起威胁到生命的疾病(Fouillard等，Bone Marrow Transplant 997-100，1992；在此引用作为参考)。现在有一种化学治疗试剂，病毒唑，可以治疗RSV。但其疗效和应用是有争议的。也有干扰RSV的已注册的产品，由一个供体IgG池(Groothuis等，N.Engl.J.Med.3291524-1530，1993；在此引用作为参考)或人源化RSV特异的单克隆抗体组成。这些是作为被动免疫预防试剂给药高危险个体。尽管这些产品有作用，其高成本和其它因素(如缺乏长期的有效性)使其不适合广泛的使用。其它不利之处包括传播由血液运载的病毒的可能性和制备和储存的难度和花费。此外，对该感染性疾病控制的历史，以及特别是病毒起源的疾病，表明疫苗的首要重要性。尽管多年以来对发展抗RSV的有效疫苗制剂进行了研究，仍然没有安全和有效的疫苗被认可，以预防与RSV感染相关的严重疾病和显著的死亡率。难以发展成功的疫苗与这一事实部分相关，即，小的幼儿对RSV抗原的血清和分泌性抗体应答较低。因此，RSV对这些个体的感染更严重，而累积性免疫似乎保护更年长的儿童和成人，以抗该病毒更严重的冲击。RSV感染中的免疫机制近来成为研究焦点。分泌性抗体在保护上呼吸道中似乎最重要，而高水平血清抗体被认为抗RSV在下呼吸道的感染中起主要作用。RSV特异的细胞毒T细胞，诱导免疫的另一个效应方面，对解决RSV的感染也重要。不过，尽管后一个效应物可因先前的免疫而增强，对病毒攻击有增强的抗性，但这种效应是短期的。F和G表面糖蛋白是RSV的两个主要保护性抗原，也是RSV中仅有的诱导RSV中和抗体和对抗攻击长效抗性的蛋白(Collins等，FieldsVirology，Fields等，eds.，21313-1352，Lippincott-Raven，Philadelphia，1996；Connors等，J.Virol.65(3)1634-1637，1991；在此引用作为参考)。第三个RSV表面蛋白，SH，不诱导RSV中和抗体和对RSV攻击的显著抗性。发展活RSV疫苗的一个阻碍是难以在减毒和免疫原性之间获得一种适当的平衡。其它阻碍包括一些减毒病毒遗传不稳定、RSV在细胞培养时相对低的生长和病毒颗粒的不稳定。此外，天然感染诱发的免疫不能充分抗后来的感染。许多因素可能引起这种现象，包括免疫系统对限制呼吸道腔表面病毒感染相对的低效，局部粘膜免疫的短期性，快速和广泛的病毒复制，由于免疫不成熟而在幼儿中降低的免疫应答，经胎盘来源的母体血清抗体引起的免疫抑制，和病毒的某些特点，如G蛋白高水平的糖基化。RSV也作为两个抗原亚型A和B出现，如下所述，抗一个亚型的免疫对于另一个的有效性下降。尽管RSV在生命中可以多次感染，由于先前感染诱导的保护性免疫的存在，再次感染的严重性降低，因此免疫预防是可行的。可以鼻内给药一种活的减毒RSV疫苗以引发轻度的免疫性感染。与肠胃外给药途径相比，这种方式的优点是简单和安全。这也直接刺激在抵抗RSV中起主要作用的局部呼吸道免疫。这也消除了RSV-特异的母体来源的血清抗体的免疫抑制(典型的发现于幼儿中)效果。RSV抗原肠胃外给药有时与免疫病理并发症相关(Murphy等，Vaccine 8(5)497-502，1990；在此引用作为参考)，而用活病毒从未发现这种情况。二十世纪六十年代中期，一种福尔马林灭活的病毒疫苗被检测为抗RSV，但不能抗RSV感染或疾病，事实上，在之后的病毒感染时症状更加恶化(Kim等，Am.J.Epidemiol.89422-434，1969；Chin等，Am.J.Epidemiol.89449-463，1969；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.89405-421，1969，在此引用作为参考)。更近一些的RSV的疫苗发展聚焦于减毒的RSV突变体。Friedewald等报道了一种冷传代型RSV突变体(cpRSV)(J.Amer.Med.Assoc.204690-694，1968；在此引用作为参考)，其足够地减毒从而可以作为疫苗使用。这种突变体与其野生型(wt)亲本病毒相比，表现在26℃略微增加的生长效率，但其复制并非温度敏感或显著的冷适应的。但这种冷传代的突变体在成人中是减毒的。尽管其在先前感染了RSV的幼儿和儿童(即，血清反应阳性个体)中具有满意的减毒和免疫原性，这种cpRSV突变体在血清反应为阴性的幼儿上呼吸道中保持低水平的毒性。
同样的，Gharpure等报道分离出一种温度敏感RSV突变体(tsRSV)(J.Virol.3414-421，1969；在此引用作为参考)，其也是有前途的候选疫苗。一个突变体，ts-1，被广泛地在实验室和志愿者中检测。该突变体在成人志愿者中产生无病症的感染，也赋予对免疫45天后野生型病毒攻击的抗性。尽管血清反应阳性的幼儿和儿童经历无病症的感染，血清为阴性的幼儿却发展出鼻炎和其它轻微症状。此外，也发现了这种ts表型的不稳定性。尽管表现显示部分或完全的温度敏感性丧失的病毒代表从接种者可回收的病毒的一小部分，其除了轻微鼻炎外不引起其他疾病症状。
这些和其它研究表明某些冷传代和温度敏感RSV株减毒不足，因此可在一些受接种者，特别是血清反应阴性幼儿中引发疾病的轻微症状，而另一些过分减毒，不能足量复制以诱导保护性免疫应答(Wright等，Infect.Immun.37397-400，1982；在此引用作为参考)。此外，候选疫苗突变体的遗传不稳定性导致其温度敏感表型的丧失，进一步阻碍了发展有效的RSV疫苗。一般参见(Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164，1974；McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696，1974；Belshe等，J.Med.Virol.3101-110，1978；在此引用作为参考)。
作为活减毒RSV疫苗的替代，研究者还用纯化的RSV包膜糖蛋白检测了候选亚单位疫苗。这种糖蛋白在棉鼠肺中诱导对RSV感染的抗性(Walsh等，J.Infect.Dis.1551198-1204，1987；在此引用作为参考)，但抗体中和活性很弱，而且纯化的亚单位疫苗对啮齿类动物的免疫导致疾病的潜在可能(Murphy等，Vaccine 8497-502，1990；在此引用作为参考)。
也探索表达F或G包膜糖蛋白的重组痘苗病毒疫苗。这些重组体表达与天然病毒对应物难以区分的RSV糖蛋白，皮下感染痘苗-RSVF和G重组体的啮齿类动物产生高水平的特异性抗体，可中和病毒的感染性。事实上，痘苗-F重组体感染棉鼠在下呼吸道中刺激对RSV复制的几乎完全的抗性和在上呼吸道中显著的抗性(Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 837462-7466，1986；在此引用作为参考)。但痘苗-F和-G重组体对猩猩的免疫在上呼吸道中几乎不产生抗RSV攻击的保护(Collins等，Vaccine 8164-168，1990，在此引用作为参考)，在下呼吸道中产生间断的保护(Crowe等，Vaccine 111395-1404，1993；在此引用作为参考)。
尽管为发展有效RSV疫苗的进行了各种努力，仍然没有许可的疫苗用于RSV。因先前的方法未能达到目标，而强调了需要新方法发展RSV疫苗，需要特定的方法操作重组RSV，使其在活的减毒RSV重组体中包含产生新表型特征的遗传改变。但对于RSV基因组RNA和其它非区段化负义RNA病毒的操作被证明是困难的。这方面主要的阻碍包括这些病毒裸露基因组RNA的无感染性，以及对于RSV而言，在组织培养中较差的生长、冗长的复制周期、毒粒的不稳定性、基因组的复杂和基因产物的复杂组织结构。
重组DNA技术使从cDNA获得感染性非区段化负链RNA病毒成为可能，使遗传操作病毒克隆以构建新的候选疫苗成为可能，使快速检测其减毒水平和表型稳定性成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-389，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-11358，1996；在此引用作为参考)。文中报道了在必需病毒蛋白存在时，从cDNA编码的反基因组RNA中获得的一些重组病毒，这些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒和仙台病毒(SeV)(参见，如，Garcin等，EMBO J.146087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-4481，1995；Radecke等，EMBO J.145773-5784，1995；Schnell等，EMBO J.134195-4203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-8392，1995；Hoffman等，J.Virol.714272-4277，1997；Pecter等，J.Virol.735001-5009，1999；Kato等，Genes to Cells 1569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)1-6，1998；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；国际申请WO 97/06270；1995年9月27日的US临时专利申请60/007,083；1996年9月27日的US专利申请08/720,132；1996年7月15日的60/021,773；1997年5月9日的US临时专利申请60/046,141；1997年5月23日的US临时专利申请60/047,634；1999年11月30日的US专利申请5,993,824(相应于公布的国际申请WO 98/02530)；1999年4月13日的US临时专利申请60/129,006；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；Durbin等，Virology 235323-332，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Jin等，Virology251206-214，1998；Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999；Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999；Bucholz等，J.Virol.73251-259，1999；Collins等，Virology 259251-255，1999，为各种目的在此分别全文引用作为参考)。
基于重组DNA技术的这些发展，现在可能从cDNA中获得感染性RSV，并对RSV克隆设计和实施各种遗传操作以构建新的候选疫苗。因此，可以评价减毒和表型稳定性，以及其它期望表型特征的水平。
发展重组疫苗的研究途径之一是工程化病毒，使其表达一种或多中细胞因子或其它潜在的抗病毒分子。研究的大部分都包括野生型痘苗病毒的参与，其目标在于增加对宿主免疫和病毒致病性的基本了解(参见，如Ramshaw等，Immunol.Rev.127157-182，1992；在此引用作为参考)。很早就考虑到细胞因子共表达以提高免疫应答在疫苗发展中的潜在应用(Ramshaw等，Trends Biotechol.10424-426，1992；在此引用作为参考)。但使用痘病毒作为研究客体降低了这一概念的实际应用，因为天花已在人群体中被消灭，而且痘病毒疫苗已不在被使用。
这些利用细胞因子共表达发展疫苗的早期研究范例包括工程化地表达细胞因子白介素2(IL-2)的一个痘苗病毒。据报道这种重组病毒在免疫缺陷型无胸腺裸鼠中是减毒的(Flexner等，Nature 330259-262，1987；Ramshaw等，Nature 329545-546，1987在此引用作为参考)。对各种免疫效应物在清除和回收中的作用也进行了研究(Karupiah等，J.Ex.Med.1721495-1503，1990；Karupiah等，J.Immunol.144290-298，1990；Karupiah等，J.Immunol.1474327-4332，1991；在此引用作为参考)。该痘苗病毒重组体表达的IL-2可极大地降低该疫苗病毒在灵长类引起的皮肤损伤，表明其显著地减毒。尽管有这些初步的发现，在存在或不存在IL-2的情况下抗体的产生量被确定是相等的(Flexner等，Vaccine 817-21，1990；在此引用作为参考)。
重组痘苗病毒共表达其它细胞因子的例子包括白介素4(IL-4)，有报道其负调节抗病毒细胞因子的表达和细胞毒T细胞应答，也恶化病毒感染(Sharma等，J.Virol.707103-7107，1996；在此引用作为参考)。另一个研究中，重组痘苗病毒表达氧化氮合成酶是高度减毒性的，显示宿主防御机制对于控制痘苗病毒感染的重要性(Rolph等，J.Virol.707678-7685，1996；在此引用作为参考)。重组痘苗病毒共表达IL-5或IL-6使局部IgA产生4倍的增加(Ramsay等，Reprod.Fertil.Dev.6389-392，1994；在此引用作为参考)。重组痘苗病毒共表达的α肿瘤坏死因子(TNF)使小鼠控制感染能力增加，暗示该分子参与宿主对于该病毒的防御(Sambhi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.884025-4029，1991；在此引用作为参考)。重组痘苗病毒表达的鼠IFNγ在正常或无免疫应答的小鼠中极大地降低病毒的复制(Kohonen-Corish等，Eur.J.Immunol.20157-161，1990；在此引用作为参考)。
这些研究也扩展到逆转录病毒。最近，构建了表达IL-2的猴免疫缺陷病毒(SIV)(Gundlach等，J.Virol.712225-2232，1997；在此引用作为参考)。感染这种表达IL-2的病毒的猕猴中，SIV特异的T细胞增殖应答和抗体效价与对照病毒的相似。感染这种表达IL-2病毒的猴和4只对照动物中的两只被发现存在SIV特异的CTL。另一项研究中，缺少nef基因但包含IFNγ基因的SIV重组体在体内是减毒的，但该细胞因子基因在体内复制几周后不稳定，此外，这种减毒伴随着降低的免疫原性(Giavedoni等，J.Virol.71866-872，1997；在此引用作为参考)。
对大的双链痘病毒(约有185个ORF，并且编码许多干扰宿主防御的蛋白)或人免疫缺陷病毒(也干扰宿主防御)的研究不适用于非区段化负链RNA病毒。早已表明外源基因可以从重组呼吸道合胞病毒(RSV)的基因组中表达，并且可以稳定维持(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作为参考)。这表明可以共表达蛋白，如细胞因子，趋化因子，配基和其它分子，其可以改变、增加或增强宿主对RSV的应答。从重组RSV中表达免疫调节分子是期望的，因为其可以在RSV抗原产生的局部位点表达。此外，共表达不需要分别制备并给药免疫调节物。从非逆转录病毒(即正义、双链或反义RNA病毒)基因组中表达免疫调节物的策略先前没有进行过探索。
因此需要增强和改变宿主对RSV的免疫应答。因为RSV疫苗可以被给药年幼的幼儿，已知该年龄组中累积免疫无效，并且在一些方面不同于成人。例如，对RSV的中和抗体应答和细胞毒T细胞应答在年幼者中降低(Kovarik和Siegrist，Immunol.Today 19150-152，1998；Kovarik和Siegrist，Immunol.Cell.Biol.76222-236，1998；Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-989，1986；Risdon等，Cell.Immunol.15414，1994；在此引用作为参考)。一般认为，新生儿的免疫系统倾向于Th-2型辅助T细胞应答(即，IL-4分泌所限定的辅助T细胞亚群)(Early和Reen，Eur.J.Immunol.262885-2889，1996；在此引用作为参考)。新生儿的T细胞具有降低的对B细胞的辅助细胞活性，并产生低量的细胞因子，包括IL-2、γ干扰素(IFNγ)和IL-4(Splawski等，J.Clin.Invest.87454，1991；Hassan和Reen，Scand.J.Immunol.39597，1994；Wilson等，Pediatr.54118，1991；在此引用作为参考)。年幼的幼儿典型的也具有经胎盘获得的RSV特异性IgG，其可以干扰或改变免疫应答(Murphy等，J.Clin.Microbiol.24894-989，1986和231009-1014，1986；Siegrist等，Eur.J.Immunol.284138-4148，1998；在此引用作为参考)。最后，某些RSV的免疫与免疫病理并发症相关(Murphy等，Vaccine8497-502，1990；Waris等，J.Virol.716935-6939，1997；在此引用作为参考)。尽管典型地这在活减毒病毒感染中未观察到，有证据表明单个的RSV抗原，最值得注意的是G蛋白，即使在由活病毒表达时，也具有诱导免疫病理学效应的潜力(Johnson等，J.Virol.722871-2880，在此引用作为参考)。这些参与RSV免疫应答、免疫介导的保护和免疫病理反应的许多因素表明，需要发展调节对RSV疫苗的宿主应答的方法。
总之，本领域迫切需要发展其它的工具和方法，以工程化制造安全有效的疫苗，减轻RSV导致的严重的健康问题。文中，需要发展一个广泛而多样的遗传修饰的菜单，其可以单独或组合地与其它类型遗传操作一起使用，构建可用于广泛疫苗应用的感染性减毒RSV候选疫苗。对活的减毒RSV疫苗病毒有用的操作可包括使重组RSV克隆共表达调节宿主免疫应答和由免疫介导的保护的一种或更多因子。令人惊讶地，本发明提供了构建感染性减毒RSV候选疫苗的其它工具，满足了这些需要。
发明简述本发明提供了被工程化表达一种或更多免疫调节分子的重组的RSV(rRSV)。该重组病毒具有包含编码该免疫调节分子的多核苷酸的经修饰的基因组或反基因组，该免疫调节分子由病毒在感染细胞中表达。优选用于本发明的免疫调节分子包括细胞因子。但是包括趋化因子或细胞因子拮抗剂、表面或可溶性受体、附着分子、配基等在内的其它多种免疫调节分子也可以改变病毒生物学和/或宿主对RSV的免疫应答的一些方面。在更详细的实施方案中，该免疫调节剂是细胞因子，选自白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、γ干扰素(IFNγ)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
细胞因子和其它免疫调节分子可以被引入本发明重组RSV中，由病毒在感染细胞中表达，并改变病毒生物学的一个或多个方面。例如，免疫调节剂的引入和表达可能改变病毒感染性、复制和/或致病性，并能诱导或改变一种或多种宿主免疫应答，例如抗RSV的中和抗体应答、辅助T细胞应答、细胞毒T细胞(CTL)应答和/或自然杀伤(NK)细胞应答。
本发明利用重组DNA技术提供从重组RSV中细胞内共表达广泛的天然或工程化蛋白。这些蛋白典型地影响造血细胞，或阻断造血细胞之间的天然信号和相互作用。病毒基因组或反基因组被修饰，引入编码细胞因子或其它免疫调节分子的多核苷酸，以构建这些重组病毒。该核苷酸序列在该基因组或反基因组中添加或替代，典型地是作为单独的基因，有自己的基因起始(GS)和终止(GE)信号。一般，编码免疫调节分子的多核苷酸序列添加或替代到重组RSV基因组或反基因组的基因间隔区或其它非编码区中，在任何适当的不破坏该基因组或反基因组中读码框的位点。
细胞因子或其它免疫调节分子的表达水平可通过改变该重组基因组或反基因组中编码该细胞因子的多核苷酸的基因排序进行调整。例如，编码该细胞因子的多核苷酸可以在RSV基因的任何基因间隔区或其它非编码区中引入。引入的位点越上游或“接近启动子”，该调节分子的表达水平就越高。
在RSV中插入编码免疫调节因子的基因组或基因组区段的其它方法是，将cDNA置于如上所述的RSV基因起始和末端信号控制之下，插入该cDNA使其从反基因组而非从基因组中表达。理想的，外源基因放置于紧邻反基因组3’末端启动子下游，这种靠近启动子的位置保证其高水平表达。
从RSV中表达细胞因子或其它免疫调节分子的其它方法是，将基因的ORF置于哺乳动物内部核糖体进入位点的控制下，将该ORF插入任何一个或多个RSV基因非编码区下游。
表达的另一种方法是通过构建嵌合或融合蛋白。例如，希望表达于感染细胞和毒粒表面的蛋白胞外域可以添加于SH ORF或其它非必需基因的下游末端，从而其阅读框不受干扰并产生嵌合蛋白。以这种方式，SH部分提供信号和膜锚点，C末端附着的结构域被显示于细胞外。
重组RSV表达一种或更多免疫调节分子是所希望的，因为其提供免疫调节分子于RSV抗原产生局部位点的表达。根据本发明的指导，共表达免疫调节分子不需要单独制备和给药免疫调节分子。此外，本发明重组RSV具有其它在发展疫苗中有用的特性。使该重组基因组或反基因组表达一种细胞因子的这种改变产生表现一个或更多如下新特征的候选疫苗，所述特征选自(i)在细胞培养中病毒生长的改变，(ii)在感染宿主的上和/或下呼吸道中病毒减毒的变化，(iii)病毒噬菌斑大小的改变，和/或(iv)免疫原性的改变，或另外具有，或同时伴随有，与野生型或亲本(即，不表达细胞因子的)RSV诱导的宿主应答相比，诱导改变的宿主应答的能力，如增加抗RSV中和抗体应答、辅助T细胞应答、细胞毒T细胞(CTL)应答和/或自然杀伤(NK)细胞应答。
本发明优选的方面中，重组RSV高水平表达引入的细胞因子或其它免疫调节分子，如最高可达感染组织培养细胞培养基中2.5μg/ml。这种重组病毒在体内和体外都减毒，同时也在接种个体中表现抗野生型RSV的高保护效率。其经过工程化，表达的病毒抗原量未减少，典型的是增加，同时也表现减毒表型。由于未降低或被增加的mRNA转录和抗原表达，其保存了免疫原的潜能，且通过RNA复制和病毒生长的同时降低达到了减毒。这一套新的表型特点对于发展疫苗是非常有利的。在被工程化表达免疫调节分子的重组RSV中的其它有利的表型改变包括与野生型或突变亲本RSV株相比，噬菌斑大小的改变和致细胞病变性改变。
与被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的重组RSV中提供的表型效果组合，经常期望通过引入增加或降低该重组病毒减毒性的额外的突变，调整减毒表型。因此，候选疫苗株可因引入的至少一个，优选两个或多个不同的减毒突变(例如来源于已知的生物学来源的突变RSV株中的一组突变)而进一步减毒。优选的人突变RSV株是冷传代(cp)和/或温度敏感(ts)突变体，例如命名如下的突变株cpts RSV 248(ATCC VR 2450)；cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)；cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)；cpts RSV 530(ATCC VR 2452)；cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)；cpts RSV 530/1030(ATCC VR2455)；RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)；RSV B-1 cp23(ATCCVR 2579)；遵循布达佩斯条约，各材料保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA，并给出以上的保藏号)。从该生物学来源的突变体模式组中，获得了一个减毒的“菜单”，每个都可以与该组中其它任何减毒突变组合，在本发明用于疫苗的重组RSV中调整减毒和其它所希望的表型的水平。可引入或转移到被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV克隆中的其它突变，可以从各种温度敏感(ts)、冷传代(cp)、小噬菌斑(sp)、冷适应(ca)或宿主范围限制(hr)的突变RSV株中获得。其中减毒突变可在非RSV负链RNA病毒中发现，并也可以引入本发明RSV突变体中，方法是将该突变定位到受体RSV基因组或反基因组相应的同源位点处，将受体中现存序列突变为突变基因型的(通过等同或保守突变)，如1999年4月13日美国临时专利申请60/129,006所述。其它有用的突变可以用上述引用参考文献中所述的重组微基因组分析和感染性病毒，通过突变分析经验性地确定。
选择用做疫苗的本发明重组RSV常具有至少两个、有时三个或多个减毒突变，以获得可广泛地进行临床应用的满意的减毒水平。一个实施方案中，至少一个减毒突变发生在RSV聚合酶L基因中(在供体或受体基因中)，涉及到决定该聚合酶蛋白的氨基酸改变的核苷酸替代，其特定导致产生减毒表型，可以包括或不包括一种温度敏感表型(ts)。被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的重组RSV在除L之外的其它RSV基因中包含一个ts突变，如在M2基因中。但文中优选的候选疫苗包含大聚合酶基因L内的核苷酸替代，导致氨基酸位点Asn43、Cys319、Phe521、Gln831、Met1169、Tyr1321和/或His1690处的氨基酸改变，例如由Ile替代Asn43，由Leu替代Phe521，由Leu替代Gln831，由Val替代Met1169，由Asn替代Tyr1321。这些位置其它氨基酸改变，尤其是相对于所发现的突变残基保守的改变，也可以产生，以得到与发现的突变替代相似的效果。引入本发明重组RSV的其它期望突变包括决定RSV N基因Val267、RSV F基因Glu218和/或Thr523的氨基酸替代的减毒突变，和M2基因起始序列内的一个核苷酸替代。此处发现的减毒突变中一个或多个直至全部的任何组合，可以引入被修饰为表达免疫调节分子的RSV中，产生适当减毒的重组病毒，用于选择的群体或广泛的疫苗受体群。
减毒突变可被选择在重组RSV基因组或反基因组的编码部分，或非编码区，如顺式调节序列。模式的非编码区突变包括基因起始序列内单个或多个碱基改变，以M2基因起始序列内核苷酸7605处(在一个模式重组序列中是7606)单个或多个碱基替代为例。
除了上述突变，根据本发明修饰的感染性RSV还可包含来自任何RSV或RSV类病毒的异源的编码或非编码核苷酸序列，如人、牛、羊、鼠(小鼠肺炎病毒)或鸟肺病毒，或其它任何有包膜病毒，如副流感病毒(PIV)。模式的异源序列包括来自一种人RSV株的RSV序列，其与来自一种不同的人RSV株的序列组合在被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV中。例如，本发明的重组RSV可能包括来自两种或多种野生型或突变RSV株中的序列，例如选自cptsRSV 248、cpts RSV 248/404、cpts RSV 248/955、cpts RSV 530、cpts530/1009或cpts530/1030的突变株。这些新突变株也可包含来自两个或更多野生型或突变人RSV亚型的序列，例如人RSV亚型A和亚型B序列的组合(参见国际申请PCT/US/08802和相关的美国专利申请60/021,773；60/046,141；60/047,634；08/892,403；09/291,894；在此分别引用作为参考)。其它方面中，一个或更多人RSV编码或非编码多核苷酸被异源RSV或非RSV病毒的对应序列所替代，单独或与选择的减毒突变(如cp和/或ts突变)组合，产生新的减毒疫苗株。
在本发明相关方面，有关引入细胞因子编码序列的修饰被引入嵌合人-牛RSV中，其被工程化重组，同时包含了来自人和牛RSV株的核苷酸序列，产生感染性嵌合的病毒或亚病毒颗粒。本发明模式的人-牛嵌合RSV包含一个同时具有人和牛多核苷酸序列的嵌合RSV基因组或反基因组，以及主要核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)和RNA聚合酶延伸因子。其它的RSV蛋白可以各种组合包括在内，产生从感染性亚病毒颗粒到完整的病毒颗粒或具有多余蛋白、抗原决定簇或其它附加成分的病毒颗粒。
本发明使用的嵌合人-牛RSV一般述于名为“减毒人-牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产”的2000年6月23日Bucholz等的美国专利申请(案卷号015280-398100US)，和之前的美国临时专利申请60/143,132(分别在此引用作为参考)。这些嵌合重组RSV包括部分或完整的“背景”RSV基因组或反基因组，其来源于，或其构建依据与不同RSV株的一个或更多异源基因或基因组区段组合的人或牛RSV株或亚型病毒，以形成人-牛嵌合RSV基因组或反基因组。在本发明的某些方面，嵌合RSV包含与来自人RSV的一个或更多异源基因或基因组区段组合的部分或完整的牛背景RSV基因组或反基因组。本发明其它一些方面，被修饰为表达免疫调节分子的RSV包含与来自牛RSV的一个或更多异源基因或基因组区段组合的部分或完整的人背景RSV基因组或反基因组。
本发明其它一些方面包括改变基因的位置或改变基因的排序，以创造或改变被修饰为表达免疫调节分子的RSV。文中，前述许多引用文献都集中于改变RSV和其它病毒的天然排序。例如，RSV中、NS1、NS2、SH和G基因被单个地缺失，以及NS1和NS2被一同缺失，由此改变各下游基因相对于启动子的位置。例如当NS1和NS2被一同缺失，N从3移至1，P从4移至2，等等。或者，基因排序内任何其它基因的缺失只会影响其更靠近下游基因的位置(相对于启动子)。例如SH占据野生型病毒的位点6处，其缺失不会影响位点5处的M(或任何其它上游基因)，但将G从相对于启动子的位置7移至6。应该说明基因缺失也可在生物学来源的突变病毒中产生(但极少)。例如，在细胞培养中被多次传代的亚型B RSV自发地缺失SH和G基因(Karron等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413961-13966，1997；在此引用作为参考)。注意“上游”和“下游”分别指“接近启动子”和“远离启动子”方向(启动子在反义基因组RNA 3’前导区末端)。
基因排序转变性修饰(即，在重组病毒基因组中将基因移动到接近启动子或远离启动子的位置)，创造或改变表达细胞因子的本发明RSV，产生具有改变的生物学性质的病毒。例如，同时缺少NS1、NS2、SH和G，NS1和NS2，或者同时缺少SH和G的RSV表现在体内减毒、体外减毒或体内体外都减毒。可能这种表型主要因为特定病毒蛋白表达的丧失。但改变的基因图可能也赋予这种观察到的表型。缺失SH的病毒充分说明了这一点，可能由于基因缺失，基因排序变化，以及可能由于基因组大小的变化，导致转录、复制或二者的效率同时的增加，使其在一些细胞类型中比野生型更有效生长。其它一些病毒中，如NS1和/或NS2缺失的RSV，因基因排序改变而产生的生长变化，可能被因该RSV蛋白表达丧失而产生的更主导的表型所掩盖。
也将引入其它变化，改变表达细胞因子的RSV的基因排序，以改善该重组病毒作为活的减毒疫苗的特性(参见，名为“从近启动子基因表达保护性抗原的呼吸道合胞病毒疫苗”的2000年6月23日Krempl等的美国专利申请(案卷号015280-424000US)，在此引用作为参考)。特别的，G和F基因可被单独或以串联形式，移动到相对于其野生型座位更靠近启动子的位置。这两个蛋白通常占据RSV基因次序(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)中7(G)和8(F)处。在SH基因缺失的RSV中进行模式的移动突变，以增加成功回收的可能性(Whitehead等，J.Virol.733438-42，1999)。这促进回收，因为该病毒在体内产生较大的噬斑。(Bukreyev等，J.Virol.718973-82，1997，在此引用作为参考)。然后将G和F基因单独移动到位置1，或一同移动到位置1和2。令人惊讶地，当G或F基因移动到位置1，或一同移动到位置1和2时，重组RSV可以很容易地回收。
在两个高度减毒的候选疫苗(其中NS2基因自身缺失，或NS1和NS2基因被同时缺失)中也得到用于引入表达细胞因子的RSV中的相似广泛的基因排序的修饰。这两种候选疫苗中，G和F糖蛋白被一同移动，分别移动到位置1和2，而G、F和SH糖蛋白从其最初的下游位置处缺失。因此回收的病毒G1F2/ΔNS2ΔSH和G1F2/ΔNS1ΔNS2ΔSH除了G和F基因的移动外，分别有两个和三个基因的缺失。为了表明参与改变的程度，可以比较野生型RSV(NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)和G1F2/ΔNS2ΔSH(G-F-NS1-N-P-M-M2-L)或ΔNS1ΔNS2ΔSH(G-F-N-P-M-M2-L)的基因次序。这表明大多数或所有基因相对于启动子的位置都发生了改变。这些高度减毒的衍生物仍保持其在细胞培养中生长的能力。
本发明其它更详细的方面，被修饰为表达免疫调节分子的重组RSV被用做其它病原的保护性抗原的“载体”，特别是如副流感病毒(PIV)的呼吸道病原。例如，被修饰为编码细胞因子的重组RSV可被工程化引入编码来自PIV的保护性抗原的序列。PIV cDNA的克隆化和作为本发明补充的描述在以下文献中表述名为“从克隆的核苷酸序列制备副流感病毒疫苗”的1998年5月22日的美国专利申请09/083,793(相应于国际申请WO98/53078)，和其优先权1997年5月23日的美国临时专利申请60/047,575；名为“减毒人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Bailly等的美国专利申请(案卷号015280-399000)，以及名为“通过缺失或消除非必需基因而减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”的1999年7月9日Durbin等的美国专利申请(案卷号015280-394000)，分别在此引用作为参考。这些公布包括对可用于产生感染性PIV病毒克隆或提供用于本发明的PIV基因或基因组区段来源的以下载体的描述p3/7(131)(ATCC97990)；p3/7(131)2G(ATCC97989)；p218(131)(ATCC97991)；遵循布达佩斯条约，各材料保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA，并给出以上的保藏号。
根据本发明这一方面，提供了这种被修饰为表达免疫调节分子的重组RSV，其包含至少一种PIV序列，例如一种包含来自PIV1和PIV2中任一或二者，或PIV1和PIV3中任一或二者的多核苷酸。RSV的单个基因可能被人PIV的对应部分所替代，如PIV1，PIV2，或PIV3的F糖蛋白基因。或者，一个选择的异源基因组区段(如，编码一个免疫原蛋白的胞质尾，跨膜结构域或胞外域的基因组区段)可能替代例如RSV中同一基因的，或RSV中不同基因内，或RSV基因组或反基因组非编码序列内对应的基因组区段。一个实施方案中，HPIV3 F基因的一个基因组区段替代对应的人RSV基因组区段，产生编码嵌合蛋白的构建体，这种嵌合蛋白如具有RSV胞质尾和/或跨膜结构域与PIV胞外域融合的融合蛋白，以产生新的减毒病毒，和/或同时抗PIV和RSV的多价疫苗。或者，一个或更多PIV基因或基因组区段可以被添加到部分或完整的嵌合或非嵌合的RSV基因组或反基因组中。
异源基因可以被整体或部分地添加到该背景基因组或反基因组中，以构建本发明使用的嵌合RSV。对于由替代产生的嵌合体，编码人或牛RSV蛋白或蛋白区域(如胞质尾，跨膜结构域或胞外域，表位或区域，结合位点或区域，活性位点或具有活性位点的区域)的选择的基因或基因组区段替代背景RSV基因组或反基因组中对应的基因或基因组区段，产生与相应的野生型(或突变亲本)RSV株相比，具有所期望表型改变的新重组体。此处所述“对应”基因或基因组区段指不同RSV来源的对应的多核苷酸，其编码同源或等同的蛋白或蛋白结构域，表位，或氨基酸残基，或其代表同源或等同的顺式作用信号，顺式作用信号包括但不限于不同RSV亚型或株中的种间和等位变体。
其它实施方案中，表达细胞因子的RSV被用做携带异源抗原决定簇的载体，其包含非RSV病原如人副流感病毒(HPIV)的一个或更多抗原决定簇。一个模式实施方案中，编码一个或更多HN和/或F糖蛋白或其抗原结构域、片段或表位的一个或更多HPIV1、HPIV2或HPIV3基因被添加或引入部分或完整的HRSV载体基因组或反基因组中。更详细的实施方案中，一个具有HPIV1，HPIV2，或HPIV3 HN或F基因读码框(ORF)的转录单位被添加或引入该嵌合的HRSV载体基因组或反基因组中。
本发明cDNA、载体和病毒颗粒中引入的突变可以单独引入，也可以组合引入被修饰为编码细胞因子或其它免疫调节因子的RSV中，并且具有这些引入突变的被拯救病毒的表型可以很容易地确定。模式实施方案中，减毒的生物学来源的病毒与野生型RSV比较，其表现的氨基酸改变(如cpRSV和tsRSV显示的改变)被组合地引入表达细胞因子的重组RSV中，以产生用于疫苗的期望的减毒水平。
本发明因此提供了修饰为表达细胞因子或其它免疫调节因子的重组RSV，以及新的载体和病毒颗粒，其具有以选择的组合引入该重组基因组或反基因组中的多种表型特异性突变，获得适当减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒。这一过程，与常规的表型检测联合，提供具有期望表型特征的重组RSV，如具有减毒，温度敏感，改变的免疫原性，冷适应，小噬菌斑，宿主范围限制等。由此检出的突变可集合成一个“菜单”，并以各种组合引入，使疫苗病毒调整到所选择的减毒、免疫原性和稳定性水平。
本发明其它方面，被修饰以表达细胞因子或其它免疫调节因子的RSV，有或无减毒突变，被构建具有额外的核苷酸修饰，以产生期望的表型、结构或功能的变化。典型的，这种选择的核苷酸修饰将特定产生表型变化，如生长特性，减毒，温度敏感，冷适应，噬菌斑大小，宿主范围限制或免疫原性的变化等。文中的结构变化包括在编码cDNA的RSV内引入或消除限制性位点，以便于操作和检测。
优选的实施方案中，表达细胞因子或其它免疫调节因子的RSV重组基因组或反基因组中核苷酸改变包括，基因部分或完全缺失，或基因表达被降低或消除(剔除)引起的病毒基因的修饰。文中突变的靶基因包括附着蛋白(G)，融合蛋白(F)，小疏水蛋白(SH)，RNA结合蛋白(N)，磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，转录延伸因子(M2 ORF1产物)，转录/翻译调节蛋白(M2 ORF2产物)，基质蛋白(M)，和两个非结构蛋白NS1和NS2的编码基因。这些蛋白中任何一个都可被整体或部分地，单独或与其它期望的修饰组合，被缺失，替代或重排，以获得新的RSV重组体。
本发明一个方面中，一个SH，NS1，NS2，或G基因或M2 ORF2在表达细胞因子或其它免疫调节因子的重组病毒中被修饰。例如，这些基因中任何一个都可被整体或部分地缺失，或其表达(因引入的终止密码子或移码突变，或转录、翻译起始位点的改变)被降低或消除，改变所获得的重组克隆表型，改善其生长，减毒，免疫原性或其它期望的表型特征。例如，在重组基因组或反基因组中缺失SH基因将产生具有新表型特征的候选疫苗，如在体外生长增强，和/或在体内减毒。相关方面中，SH基因的缺失，或其它选择的非必需基因或基因组区段(如NS1或NS2基因)的缺失，被单独或与一个或多个其它特定于减毒表型的突变(如直接来源于生物学来源的减毒RSV突变体中的点突变，或以修饰的形式，如在特定于该突变的密码子内引入多个核苷酸的变化)组合，构建于表达免疫调节因子的病毒中。例如，SH，NS1，NS2，或M2-2基因缺失可以与源于cpts248/404，cpts530/1009，cpts530/1030或其他选定突变RSV株的一个或多个cp和/或ts突变组合，产生重组RSV，由于组合了不同突变的效果，其表现病毒产量增加、减毒增强、免疫原性提高和对减毒表型回复的遗传抗性。
本发明重组RSV中的其它核苷酸修饰包括该重组基因组或反基因组中一个选定基因的顺式作用调节序列的缺失、插入、添加或重排。一个例子中，一个RSV基因的顺式作用调节序列被改为相应的异源调节序列，其可以是不同RSV中相同基因的对应顺式作用调节序列，也可以是不同RSV基因的顺式作用调节序列。例如，基因末端信号可以经转变或替代而修饰为相同RSV株不同基因的基因终止信号。其它实施方案中，核苷酸修饰可能包括该重组基因组或反基因组中一个翻译起始位点的插入，缺失，替代或重排，如消除蛋白所选择形式的其它翻译起始位点。一个例子中，RSV G蛋白分泌形式的翻译起始位点被消除，从而改变这种形式G蛋白的表达，因此在体内产生了期望的效果。其它实施方案中，经微复制子或感染病毒的经验性分析发现的突变也可以被引入(参见，如Kuo等，J.Viro.714944-4953，1997；Whitehead等，J.Viro.733438-3442，1999；在此引用作为参考)。
本发明的相关方面，提供了产生表达细胞因子或其它免疫调节分子的分离的感染性重组RSV的组合物(如具有RSV编码cDNA的分离的多核苷酸或载体)和方法。本发明的这些方面中包括了包含具有修饰为编码免疫调节分子的RSV基因组或反基因组的新的一个或更多分离的多核苷酸分子和载体。也提供了具有编码N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的分离的多核苷酸分子的相同或不同的表达载体。这些蛋白也可以直接由基因组或反基因组cDNA表达。载体优选在细胞或无细胞裂解液中表达或共表达，从而产生感染性RSV病毒粒子或亚病毒颗粒。
由以上产生被修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV的方法和组合物可获得感染性病毒粒子或亚病毒颗粒，或其衍生物。感染性病毒相当于天然的RSV毒粒，并有同样的感染性。可直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒典型的是病毒粒子的一个亚成分，在适当条件下可引发感染。例如，具有基因组或反基因组RNA和N、P、L和M2(ORF1)蛋白的核壳是亚病毒颗粒的一个范例，当其进入细胞质中，可以引发感染。本发明提供的亚病毒颗粒包括缺少一个或多个蛋白质、蛋白质区段或其它病毒成分的病毒粒子。
其它实施方案中，本发明提供了含有一种具有包含上述被修饰编码免疫调节分子的RSV基因组或反基因组的经分离的多核苷酸分子的表达载体，和具有包含编码RSV N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的分离的一个或更多多核苷酸分子的(与前一个相同或不同的)表达载体的细胞或无细胞裂解液。这些蛋白质中的一个或更多个也可以从基因组或反基因组cDNA表达。表达后，基因组或反基因组和N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白组合产生感染性RSV病毒粒子或亚病毒颗粒。
本发明的重组RSV以各种组合物形式用于在对RSV敏感的宿主中产生期望的抗RSV免疫反应。本发明减毒RSV能在感染的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫应答，且足够地减毒，不会在免疫化宿主中引发不可接受的严重呼吸道疾病的症状。减毒的病毒或亚病毒颗粒可能存在于细胞培养物的上清中，从培养物中分离，或部分或完全纯化。病毒也可以冷冻干燥，根据需要与多种其他成分组合以储藏或给药宿主。
本发明进一步提供了新疫苗，其包含一种生理上可接受的载体和/或佐剂，以及修饰为表达细胞因子的分离的RSV病毒粒子或亚病毒颗粒。优选实施方案中，该疫苗包含具有至少一个，优选两或多个减毒突变或以上所述的其它核苷酸修饰的被修饰为编码细胞因子的突变RSV，使减毒和免疫原性达到合适的平衡。疫苗配制为每剂103-106PFU或更多的减毒病毒。该疫苗病毒可能诱导抗单RSV株，或抗抗原亚型如A或B，或抗多RSV株或亚型的免疫应答。这方面，本发明重组RSV在制剂中可与具有不同免疫原特性的其它PIV疫苗株或亚型组合，更有效地抗一种或多种RSV株或亚型。
在相关方面，本发明提供了在哺乳动物中刺激免疫系统，以诱导抗RSV免疫应答的方法。该方法包含以足够的免疫量，给药存在于生理上可接受的载体和/或佐剂中的修饰为表达细胞因子或其它免疫调节分子的RSV制剂。一个实施方案中，免疫原组合物是包含具有至少一个，优选两或多个，减毒突变或以上所述的其它核苷酸修饰的，修饰为表达细胞因子的RSV疫苗。疫苗配制为每剂103-106PFU，或更多的减毒病毒。该疫苗病毒可能具有诱导抗单RSV株，或抗抗原亚型如A或B，或抗多RSV株或亚型的免疫应答。本发明RSV重组体也与具有不同免疫原特征的RSV组合于疫苗混合物中，或在协同治疗方案中分别给药，诱导抗一种RSV株，或抗抗多RSV株或亚型更有效的保护。优选的，免疫原组合物通过喷洒、滴入或气雾剂给药于上呼吸道。该组合物经常给药对RSV抗体血清反应阴性的个体，或具有经胎盘获得的母体抗RSV抗体的个体。
附图简述

图1显示被修饰为表达鼠IFNγ的重组RSV干扰素γ(rRSV/mIFNγ)嵌合基因组的构建。mIFNγ的cDNA(矩形阴影部分，用小写字母显示了两端的起始和终止密码子)的XmaI片段被修饰，侧翼为RSV基因起始和末端信号。这个转录盒被插入预先插入了8个核苷酸的XmaI接头(黑体斜体)的反基因组cDNA中G-F基因间隔区的唯一的StuI位点(StuI位点的两半，AGG和CCT，被下划线)，XmaI位点下划线。
CCCGGGATGGGGAAATAATG(SEQ ID NO.5)；TGAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.6)；AGGCCCCGGGGCCT(SEQ ID NO.7)。
图2显示rRSV/mIFNγ，rRSV/CAT(包含一个氯霉素乙酰转移酶基因)，和wt RSV在HEp-2细胞中的生长动力学。细胞单层被以2PFU/每个细胞感染(每个病毒两份重复)，在指定的时间点取200μl的上清，调整使其包含100mM硫酸镁和50mM HEPES缓冲液(pH7.5)，快速冷冻并储存在-70℃直到测定效价。每份上清都替代以等量的新鲜培养基。每个单步生长曲线代表两个感染细胞单层病毒效价的平均。感染wt RSV的单层细胞在感染后72小时有超过90％被破坏(*)，而rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT感染的细胞几乎无损，显示嵌合病毒在体外的减毒。
图3表明感染了rRSV/mIFNγ或rRSV/CAT的HEp-2细胞培养液体中累积mIFNγ的动力学。细胞单层被以2PFU/每个细胞感染(每个病毒两份重复)，在指定的时间点取样品，使用Quantikine M小鼠IFNγ免疫分析(R&D系统，MN)，经ELISA确定各样品中mIFNγ的含量。
图4表明病毒在鼻内接种了106PFU rRSV/mIFNγ、rRSV/CAT或wt RSV的BALB/c小鼠上和下呼吸道中复制的动力学。各组中5只小鼠在指定日处死，取出鼻甲和肺组织，并匀浆，通过对单个组织样品的噬菌斑分析确定感染性病毒的浓度。显示了具有标准偏差的每克组织的平均log10效价。并表示了病毒在上和下呼吸道中的检测极限。
图5显示用核酶保护分析检测肺mIFNγ、IL-2 p40和L-32(管家基因)mRNA的存在。小鼠(各组5只)分别被鼻内接种单独的培养基(模拟)或每只动物接种106PFU rRSV/mIFNγ或wt RSV。免疫后4天，取出肺，纯化总RNA。RNA与放射性RNA探针(由mCK-2B模板系统合成，PharMingen RiboQuant Multi-Probe RNase ProtectionAssay System)杂交，用核酶A处理，纯化，在5％变性丙烯酰胺凝胶中电泳。显示了具有被保护种(相应于指定的mRNA)的凝胶区域的放射自显影图。对三个mRNA各采取不同的暴光时间。正常鼠RNA和酵母被用做附加的阴性对照。
图6显示rRSV/mIFNγ或wt RSV初次感染，并且后来被wt RSV攻击后，小鼠肺中细胞因子mRNA的水平。小鼠分别被鼻内接种每只动物106PFU的rRSV/mIFNγ，wt RSV或单独的培养基。免疫后1或4天，处死各组的5只动物，分离肺RNA。其它被免疫的动物在第28天接受106PFU wt RSV的攻击，在第29或32天分别从各组的5只动物中分离总肺RNA。选定细胞因子mRNA的累积用图5注解中的核酶保护分析(PharMingen，CA，模板组mCK-1和mCK-2B)检测。各mRNA的放射活性用磷光成像分析量化，减去背景，各值以放射活性相对于L-32管家基因mRNA的百分比表示，显示为5只动物的平均，并附加标准偏差。没有指定细胞因子可检测的mRNA的样品用星号表示。
图7显示了rRSV/mIL-2的基因组图谱。mIL-2 ORF的cDNA，(其翻译起始和终止位点以黑体表示)经PCR修饰，侧翼为RSV特异的基因起始和基因末端转录信号(框内)，以及XmaI位点(下划线)。得到的mIL-2转录盒利用先前引入其中的XmaI位点，被插入G和F基因间隔区(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996，在此引用作为参考)。CCCGGGATGGGGCAAATATG(SEQ ID NO.9)；TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.10)。
图8显示表明rRSV/mIL-2、rRSV/CAT和wt RSV在BALB/c小鼠上(鼻甲)下(肺)呼吸道中的复制。动物分别在鼻内接种106PFU指定的病毒。各组中5只小鼠在指定日处死，取出鼻甲和肺，通过噬菌斑分析确定病毒的效价。数据显示了具有标准偏差的病毒平均浓度(log10PFU/g组织)。斯氏t检验表明rRSV/mIL-2与wt RSV相比效价降低是统计学显著的鼻甲第3天，P＜0.01，第4天，P＜0.02，第5天P＜0.1；肺第3天P＜0.05，第4天P＜0.05，第5天P＜0.001。
图9显示感染了每只动物106PFU的rRSV/mIL-2或wt RSV或仅接受到培养基(模拟)的小鼠中肺中IL-2，IFNγ，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13和IL-12 p40的mRNA累积。免疫后1和4天，处死4或5 只小鼠，分离肺的总RNA，用前述方法(Bukreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962367-2372，1999)进行RNA酶保护分析，并利用RiboQuant Multi-Probe RNAse Protection Assay System(PharMingen)和两套不同的探针模板，即mCK-1和mCK-2B。分别对每只小鼠进行分析，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出的各被保护种进行磷光成像定量分析，以本样品中L-32管家基因mRNA量的百分比表示，显示了每组每天的平均值，并附加标准偏差。注意各y轴有不同的刻度。
图10是表达IL-4(IL4 PE)或IFNγ(IFNγ FITC)的CD4+淋巴细胞的流式细胞计数分析点状图。小鼠感染了106PFU wt RSV(左图)，rRSV/mIL-2(中图)或仅受模拟感染(右图)。10天后处死动物，收集肺CD4+细胞，流式细胞计数分析。以每个图显示了CD4+细胞在三个象限中的百分比。各图代表来自单个鼠的细胞。
图11显示了rRSV/mGMCSF的基因组图谱。mGM-CSF的cDNA，(其翻译起始和终止位点以黑体表示)经前述的限制性片段替代所修饰，侧翼为RSV特异的基因起始和基因末端转录信号(框内)以及XmaI位点(下划线)。得到的mIL-2转录盒利用先前引入其中的XmaI位点，被插入G和F基因间隔区(Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996；在此引用作为参考)。
AGTTACTTAAAAACATATTATCACAAAAGGCCCCGGGGCCTTGACCAAACTTAAACAGAATCAAAATAAACTCTGGGGCAAAT(SEQ ID NO.8)；CCCGGGATGGGGCAAATATG(SEQ ID NO.9)；TAAAGTTATTAAAAATTCCCGGG(SEQ ID NO.10)。
图12显示rRSV/mGMCSF、rRSV/CAT和wt RSV在HEp-2细胞中的生长动力学。细胞单层被以2PFU/每个细胞感染(每个病毒两份重复)，在指定的时间点取出200μl的培养基并替换。样品快速冷冻，以后利用噬菌斑分析测定感染性病毒的效价。显示了各时间点两个细胞单层的平均。
具体实施方案的说明本发明提供了被工程化表达一个或更多免疫调节分子的分离的感染性重组RSV(rRSV)，以改善该重组RSV候选疫苗治疗或预防RSV感染的作用。该重组病毒具有包含编码一个或更多免疫调节分子的多核苷酸序列的修饰的基因组或反基因组。
各种细胞因子和其它免疫调节分子可引入本发明重组RSV中，以使其在感染细胞中被表达，并改变病毒生物性状的一个或多个方面，如感染性、复制、病原性和/或改变一种或多种宿主免疫应答，如抗RSV中和抗体应答、辅助T细胞应答、细胞毒T细胞(CTL)应答和/或自然杀伤(NK)细胞应答。该免疫调节分子包括细胞因子，或其它任何免疫调节分子，如趋化因子或细胞因子拮抗剂，酶(如氧化氮)，表面或可溶性受体，附着分子，配基等。当引入并在本发明重组病毒中表达时，该细胞因子，或其编码多核苷酸可以改变，即增加、降低，或增强病毒生物性状的方面和/或宿主对RSV的免疫应答。
本发明基本的方面中，提供了从重组RSV中细胞内共表达多种免疫调节蛋白(天然存在或由重组DNA技术工程化)中任何一种。这些调节分子典型地影响造血细胞，或阻断造血细胞与其环境(包括感染的病毒)间的信号和相互作用。许多分子适用于以这种方式表达。例如，作为可溶信使的蛋白，或作为拮抗或隔绝可溶信使的蛋白，或与免疫系统的细胞相互作用的蛋白。分子包括细胞因子/趋化因子的各成员，包括白介素、干扰素和趋化因子的各个亚族、集落刺激因子(CSF)、某些分子如Flt3配基以及其它调节造血细胞的分子。可用于本发明的细胞因子和趋化因子可在以下参考文献中找到细胞因子手册(The Cytokine Handbook)，A.Thomson(ed.)，学术出版社，SanDiego，1998；和细胞因子(Cytokiness)，A.Mire-Sluis和R.Thorpe(eds)，学术出版社，San Diego，1998，在此引用作为参考。
本发明使用的合适的细胞因子和趋化因子包括但不局限于IL-1α和β、IL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。也包括γ干扰素(IFNγ)和其它干扰素，如干扰素α、β、ω。本发明重组病毒中使用的其它分子包括肿瘤坏死因子(TNF)和其相关的配基和受体，包括Fas配基(CD95)、CD40配基，以及近来报道的B细胞刺激BlyS蛋白(Moore等，Science 285260-263，1999)。其它分子包括Flt3配基。文中指出，如Flt3和CD40的配基应在感染细胞的表面表达，可改变或增强感染细胞的免疫识别。如Flt3的配基可被工程化引入重组RSV粒子的包膜中，可改变病毒的趋向性，在该例中靶向树状细胞。
本发明重组RSV病毒中使用的其它免疫调节分子包括集落刺激因子(CSF)，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞因子。模式趋化因子包括CXC组(其包括IL-8、γ-INF诱导的单核因子(Mig)、细胞因子应答基因2(Crg-2))(Mahalingam等，J.Virol.731479-1491，1999)、血小板因子-4(PF-4)、嗜中性白细胞活化蛋白-2(NAP-2)、黑体瘤生长刺激活性(GRO)α、β和γ、上皮细胞衍生的嗜中性白细胞吸引剂-78(ENA-78)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、诱导IFNγ的蛋白10(IP-10、基质细胞衍生因子1(SDF-1)α和β。第二组趋化因子，C趋化因子，包括淋巴趋化因子(lymphotactin)。近来了解的第三组，CC趋化因子，包括eotaxin、单核趋化蛋白(MCP)1、2、3、4和5、RANTES(regulated on activation，normal T-cell expressed and secreted)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)1α和β以及胸腺和激活调节趋化因子(TARC)。
其它有用的免疫调节分子包括细胞因子拮抗剂，如天然存在的分泌型IL-1受体拮抗剂(Aredn等，Ad.Immunol.54167-227，1993，在此引用作为参考)，其结合受体因此封闭它而不激活。其它例子包括肿瘤坏死因子(TNF)受体胞外结构域和IgG的恒定区之间遗传工程化的融合蛋白，其可结合并隔绝可溶性TNF(Fisher等，N.Eng.J.Med.3341697-1702，1996)。第三例是隔绝IL-1的重组IL-1受体(Takebe等，J.Interferon Cytokine Res.18321-326，1998，在此引用作为参考)。其它适合在rRSV中表达的细胞因子/趋化因子拮抗剂包括，如衍生自完整分子的肽，如针对IL-1的(Palaszynski等，Biochem.Biophys.Res.Commun.14724-209，1987，在此引用作为参考)，或对功能必需的残基定点诱变后产生的灭活形式，如针对TNF的(von Feldt等，Immunol.Res.1396-109，1994，在此引用作为参考)。其它分子包括各种源于病毒的类似物和调节分子。因此，显示大量的多肽免疫调节分子，均可用于在本发明重组RSV中插入以进行表达，并在啮齿类或灵长类动物和临床实验中直接检测其对免疫原性，疗效和疾病的效果。
病毒基因组或反基因组被修饰，引入编码细胞因子或其它免疫调节分子的多核苷酸，以构建工程化表达免疫分子的重组RSV，该多核苷酸一般作为具有自身基因起始(GS)和终止(GE)信号的单独的基因被添加。一般，编码免疫调节分子的多核苷酸序列添加或替代入重组RSV基因组或反基因组中的基因间隔区或其它非编码区，在任何适当的不破坏该基因组或反基因组中读码框的位点。典型的，编码免疫调节分子的多核苷酸序列作为额外的基因引入重组基因组或反基因组，尽管也可能该基因组或反基因组中的非编码元件被去除，且编码细胞因子的多核苷酸替代其缺失的位置处。
典型的，构建被修饰为编码细胞因子或其它免疫调节分子的本发明重组RSV需要将编码细胞因子的多核苷酸添加或替代在该基因组或反基因组中选择的位置。细胞因子或其它免疫调节分子的表达水平可以通过改变编码细胞因子的多核苷酸在该基因组或反基因组中的排列位置进行调整。例如，编码细胞因子的多核苷酸可被引入任何RSV基因的基因间隔区或非编码区。编码细胞因子的多核苷酸的引入可以选择在相对于这些基因或ORF更接近或远离启动子的位置，分别增强或降低该细胞因子或其它免疫调节分子的表达。
此处所述“RSV基因”一般指RSV基因组编码mRNA的部分，典型的在上游末端以10核苷酸的基因起始(GS)信号开始，在下游末端以12-13核苷酸的基因末端(GE)信号终止。本发明中使用的RSV的10个这种基因是NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L。术语“基因”，在此也用做“翻译读码框(ORF)”。ORF更具体的定义是编码重要RSV蛋白的翻译读码框，现在已发现11个NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1(或M2(ORF1))、M2-2(或M2(ORF2))和L。因此术语“基因”可互换地指编码亚基因组RNA的基因组RNA序列，指一个ORF(后者特别用于RSV M2基因的情况，其中一个单mRNA含有编码不同的蛋白的两个重叠ORF)(Collins等，J.Gen.Virol.713015-3020，1990；Bermingham和Collins，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611259-11264，1990；Ahmadian等，EMBO J.192681-2689，2000；Jin等，J.Virol.7474-82，2000；分别在此引用作为参考)。术语“基因”在文中确定基因相对于启动子位置时，该术语一般局限于指以转录基因起始和基因末端信号基元为边界的mRNA编码序列(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.834594-4598，1986；Kuo等，J.Virol.706892-6901，1996；分别在此引用作为参考)。
“基因组区段”指来自RSV基因组的任意长度的连续核苷酸，可能是ORF的一部分，基因或一个基因外区域或其组合。
在RSV中插入异源基因，包括编码免疫调节因子的基因的其它方法是，将cDNA置于如上所述的RSV基因起始和末端信号控制之下，插入该cDNA使基因从反基因组而非从基因组中表达。优选的，外源基因放置于紧邻反基因组3’末端启动子下游，这种靠近启动子的位置保证其高水平表达。这种方式在狂犬病病毒中有过说明，异源氯霉素乙酰转移酶基因被放置于反基因组的链中，此外该反基因组的启动子被基因组的所替代(Finke和Conzelmann，J.Virol.717281-7288，1997，在此引用作为参考)。但RSV反基因组的启动子可有效地指导转录，所以一般不需要替换反基因组的启动子。事实上，我们构建了其中异源基因由反基因组表达的微复制子。
表达异源基因的其它方法是，将基因的ORF置于哺乳动物内部核糖体进入位点的控制下，将该ORF插入任何一个或多个RSV基因非编码区下游。这种方式在流感病毒中有过说明(Garcia-Sastre等，J.Virol.686254-6261，1994，在此引用作为参考)。这导致mRNA的表达，其中mRNA 5’末端的真正的病毒ORF未受干扰，下游非编码区具有因内部核糖体进入而表达的异源ORF。或者，下游ORF可放置于可被核糖体终止-重新开始所接触到的位置(Horvath等，EMBOJ.92639-2674，1990，在此引用作为参考)。
表达的其它方法是通过构建嵌合或融合蛋白。例如，期望将表达于感染细胞和毒粒表面的蛋白胞外域可以添加于SH ORF的下游，从而阅读框不受干扰并产生嵌合蛋白。以这种方式，SH部分提供信号和膜锚点，该C末端附着的结构域被显示于细胞外。这种方式是基于发现SH在免疫预防中并非重要抗原，在体外和体内的有效复制中非必需。这种方式特别适合这种情况当如Flt3之类的配基在毒粒表面表达，以使病毒靶向表达Flt3的细胞，即树状细胞。不过其它病毒基因也可以用于构建嵌合蛋白。例如，G蛋白的C末端可容易地缺失或插入，因此可以容纳异源多肽成分。此外，任何RSV基因都可以第二拷贝插入，由此在构建嵌合蛋白时的蛋白功能失活变得可以忍受。
本发明其它实施方案中，重组病毒修饰为编码多于一种的免疫调节分子，如多种细胞因子或者一种细胞因子和一种趋化因子，以提供更好的表型特征。其它方面中，多于一种的RSV被工程化，分别表达一种不同的细胞因子，如一种细胞因子增强CTL应答，另一种细胞因子增强NK应答，这些不同种的病毒可以同时或在协调的治疗方案中给药，以增强疫苗的有效性。
RSV一般定义为副粘病毒科中的有包膜的非区段化负链RNA病毒(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996，在此引用作为参考)。其基因组，在常见的A2株中为15,222个核苷酸，转录出10个先前显示为编码10个蛋白的信使RNA(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996；Atria等，J.Virol.721452-1461，1998；Bukreyev等，J.Virol.718973-8982，1997；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9381-85，1996；Ten和Collins，J.Virol.725707-5716，1998；Ten和Collins，J.Virol.73466-473，1999Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999，分别在此引用作为参考)。
近来发现的4个RSV蛋白是核壳/聚合酶蛋白，即，主要核壳蛋白N、磷蛋白P、聚合酶蛋白L和转录抗终止蛋白M2-1(M2基因第一个读码框(ORF)编码的)。这些蛋白中3个是表面糖蛋白，即附着G蛋白，在穿透和形成合胞中作用的融合F糖蛋白，以及未知功能的小疏水蛋白SH。基质蛋白M是参与毒粒形成的内在毒粒蛋白。非结构蛋白NS1和NS2未知功能。G和F蛋白是主要的中和和保护性抗原(Collins等，Fields Virology 21313-1352，1996；Connors等，J.Virol.661277-1281，1992)。对RSV再次感染的抗性主要由特定抗这些蛋白的血清和粘膜抗体介导。RSV感染也诱导RSV特异的细胞毒T细胞，并可以导向多种不同蛋白，但没有证据表明该效应物主要作用是赋予对再次感染的长期抗性。但CD8+和CD4+细胞可以在调节免疫应答中有重要作用，都参与病毒的致病性(Johnson等，J.Virol.722871-2880，1998；Srikiatkhachorn和Braciale，J.Exp.Med.186421-432，1997)。因此F和G是最重要