专利名称：一种呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗及其制备方法一种呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗及其制备方法发明领域本发明属于生物制药领域，涉及一种呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗(RS VLP疫苗) 及其制备方法，特别涉及一种核心来自新城疫病毒、表面蛋白来自合胞病毒的病毒样颗粒 疫苗(NDV/RSV VLP疫苗)及其制备方法。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，是在世界范围存在并引 起婴幼儿下呼吸道感染的主要原因之一，RSV感染可以引起一系列的呼吸道疾病，从简单的 感冒症状到严重的下呼吸道感染及并发症。RSV的首次感染多发生于2月龄婴儿，感染率高 达83 %，且感染后不会产生持久的免疫力，有50%的婴幼儿会在首次感染后的1 2年再 次感染。同时，RSV在青少年、老年人以及免疫缺陷人群中也是一种常见而重要的病原体。 RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属的单股负链非节段性RNA病毒，其核心是由核衣壳包裹的 RNA、外层包被有出芽时来自宿主的脂质双分子层、以及穿越其中的跨膜蛋白组成。RSV的 RNA共编码10种蛋白质三个跨膜蛋白(G、F、SH)、两个基质蛋白(Μ、M2)、三个核衣壳蛋白 (N、P、L)和两个非结构蛋白(NS1、NS2)。其中三种跨膜糖蛋白与免疫保护及致病毒力密切 相关，分别是融合蛋白(F)、黏附蛋白(G)、以及小疏水蛋白(SH)。研究显示，抗F抗体可以 阻止RSV与宿主细胞融合，而抗G抗体可以阻止RSV向宿主细胞的贴附，这使得F蛋白和G 蛋白被认为是RSV的主要保护性抗原。F蛋白是RSV的一个重要保护性抗原，它是中和性抗 体及保护性的一个重要靶位点。同时有证据表明，F蛋白还是⑶8+T细胞的一个重要靶位 点。G蛋白有一个疏水的N末端，通过该N末端把G蛋白锚定在病毒脂质包膜上，根据所暴 露的胞外区蛋白序列的差异，可将RSV分为A和B两个亚型。同时G蛋白还存在另外一种 分泌型G蛋白，分泌型G蛋白缺少了 N末端的65个氨基酸残基，只留高度糖基化的胞外区， 有研究表明，该分泌型片断有可能导致免疫应答向Th2方向发展。由此，RSV感染宿主诱发 异常天然免疫及获得免疫应答是导致Thl/Th2平衡失调并造成免疫损伤的危险信号。众所周知，疫苗是防控传染病最有效的手段，至今还没有被批准的疫苗用于RSV 免疫预防。近年研究显示，RSV感染对固有免疫应答能力弱，使得Th2免疫应答强，造成 Thl/Th2平衡失调，产生大量炎性分子与趣化因子，且产生中和性抗体不成熟，引起免疫损 伤是RSV疫苗研究的科学问题。在上世纪70年代，美国首次推出的福尔马林灭活RSV疫苗 (F1-RSV疫苗)，接种2 7个月的婴幼儿，有80%的婴幼儿出现了病情加重，且有两例死 亡，由此发现死者肺部出现了大量的嗜酸性细胞浸润和炎性分子与趋化因子，使得Thl/Th2 平衡紊乱。因为FI-RSV引起了过高的Th2免疫应答，⑶4+T细胞激活和增殖后分泌一些炎 性与趣化因子，且加速了肺部的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的产生和浸润、产生低亲和力保 护性抗体，另外损伤了 CD8+T细胞活性和功能，最终导致了 RSV清除过程缓慢、肺部损伤及 病毒开始大量传播，由此Fl-RSV疫苗以失败而告终。由此克服这几个难点，是开发RSV疫 苗的基本原则。近年美国学者报道的一种温度敏感型RSV弱毒苗和一种携带RSV的F蛋白 的重组人/牛副流感病毒活疫苗进入I期临床研究，有学者开展的RSV重组亚单位疫苗在临床前研究阶段，都面临潜在免疫病理损伤的潜在危险。因此，寻找新的技术策略、研发RSV 疫苗，是安全、有效免疫防控RSV的重大科学前提。病毒样颗粒(Virus-like pratical，VLP)是由病毒主要结构蛋白组成不含病毒核 酸的病毒粒子空壳。由于VLP大小、结构及表面抗原和多肽表位与真正的病毒几乎没有区 别，因此能被宿主抗原提呈细胞所识别，引起免疫应答和效应，且无潜在的副作用。与有良 好口碑的病毒体(Virosome)相比，VLP不是由活病毒制备而来，没有潜在的危险性；与亚单 位疫苗相比，VLP是多个抗原蛋白组成，具有很强的免疫原性，由此VLP疫苗被当今誉为病 毒类疫苗发展的新里程碑。目前的乙肝VLP疫苗(Recombivax HB，Merck)、乳头瘤VLP疫 苗(GardisiLMerck)和流感VLP疫苗已上市，戊型VLP疫苗等多个品种在临床研究中。已 有研究表明，至今RSV形成VLP机之不明，有学者利用RSV蛋白进行VLP形成研究，结果表 明自身蛋白VLP形成效率低，难以实现规模化制备。由此，如借用其它VLP形成分子，并携 带RSV —个或者多个表面抗原分子，是创新发展RSV形成VLP的增长点。众所知，新城疫病 毒(Newcastle Disease Virus,NDV)与RSV同属于附粘病毒科，主要宿主为禽类。NDV可以 感染人类，但不会在人与人之间传播。对于NDV形成VLP的机制，现在已研究比较明确，NDV 的基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(NP)、融合蛋白(F)、以及血凝素-神经氨酸酶蛋白(NH)四种 主要结构蛋白可形成获得率高、结构和功能完整的新城疫病毒样颗粒(ND VLP)。另外，ND VLP还表现出许多理想的特点首先，ND VLP可以激发理想的体液和细胞双重免疫应答；其 次，产生的抗体主要是成熟的中和性抗体，由此ND VLP有可能成为一个良好的携带外源抗 原分子的理想载体；第三，NDV是一种禽类疾病，人类没有免疫本底，如果利用ND VLP来携 带RSV免疫保护抗原分子，将会对RSV疫苗发展成为新的里程碑。发明内容本发明目的在于公开一种呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗(RS VLP疫苗)，特别是核 心来自新城疫病毒的呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗(NDV/RSV VLP疫苗)，本发明目的还在于 公开该疫苗的制备方法。本发明目的是通过如下方案实现的本发明RS VLP疫苗含有合胞病毒M、F、NP、G四种结构蛋白组成的VLP。本发明RS VLP疫苗涉及以下核酸序列①RSV M蛋白的核酸序列；②RSV NP蛋白 的核酸序列；③RSV G蛋白的核酸序列；④RSV F蛋白的核酸序列；其中，所述G蛋白核酸 序列包括来自RSV A亚型( 及RSV B亚型Gb。
本发明RS VLP疫苗涉及以下氨基酸序列①RSV M蛋白的氨基酸序列；②RSV NP 蛋白的氨基酸序列；③RSV G蛋白的氨基酸序列；④RSV F蛋白的氨基酸序列；其中，所述G 蛋白核酸序列包括来自RSV A亚型( 及RSV B亚型(Λ。
本发明RS VLP疫苗含有呼吸道合胞病毒样颗粒(RS VLP)，并携带有以下表面蛋 白①RSV的G蛋白；②RSV的F蛋白；其中，所述RSV G蛋白包括来自RSV A亚型的fei和 来自B亚型的(Λ。
本发明RS VLP疫苗包含一个携带有RSV及NDV主要结构蛋白的重组真核表达载 体、鸡成纤维细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞；其中，所述真核表达载体选自①PHWD2000 ； ②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所述鸡成纤维细胞选自①UMNSAH/DF-I细胞；②分离9-10龄禽成纤维细胞；所述哺乳动物细胞选自①VERO细胞；②293细 胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤；BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧H印-G2细 胞；所述昆虫细胞选自①Tn5细胞；②SF9 Cell细胞。
其中，本发明pHWD2000载体是由pHW2000载体改造得到，包括去掉pHW2000载体 上游的PCMV启动子，并用鸡β-actin蛋白启动子替换，同时在鸡β-actin蛋白启动字上 游插入hCMV-IE增强子，改造后的PCWD2000可以在真核系统中高效表达外源基因，同时 PCWD2000有着较小的分子量，可以携带较大的外源基因片段。
本发明NDV/RSV VLP疫苗含有新城疫病毒M、F、NP、NH四种结构蛋白，以及新城疫 病毒F蛋白与合胞病毒F组成的NDV F/RSV F融合蛋白、新城疫病毒HN蛋白与合胞病毒G 蛋白组成的NDV HN/RSV G融合蛋白两种表面蛋白组成的VLP。
本发明NDV/RSV VLP疫苗涉及以下核酸序列①NDV M蛋白的核酸序列；②NDV NP 蛋白的核酸序列；③NDV HN蛋白的核酸序列；④NDV F蛋白的核酸序列；⑤NDV HN/RSV G 融合蛋白核酸序列；⑥NDV F/RSV F融合蛋白核酸序列；其中，所述G蛋白核酸序列包括来 自RSV A亚型Ga及RSV B亚型(Λ。
本发明NDV/RSV VLP疫苗涉及以下氨基酸序列①NDV M蛋白的氨基酸序列； ②NDV NP蛋白的氨基酸序列；③NDV HN蛋白的氨基酸序列；④NDV F蛋白的氨基酸序列； ⑤NDV HN/RSV G融合蛋白的氨基酸序列；⑥NDV F/RSV F融合蛋白的氨基酸序列；其中，所 述G蛋白核酸序列包括来自RSV A亚型( 及RSV B亚型(Λ。
本发明NDV/RSV VLP疫苗包含有一种新城疫病毒核心，并携带有以下表面蛋白 ①NDV HN/RSV G融合蛋白；②NDV F/RSV F融合蛋白；其中，所述RSV G蛋白包括来自RSV A亚型的( 和来自B亚型的Gb。
本发明NDV/RSV VLP疫苗包含一个携带有RSV及NDV主要结构蛋白的重组真 核表达载体、鸡成纤维细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞；其中，所述真核表达载体选自 ①PHWD2000 ；②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所述鸡成纤维细胞选自 ①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9_10龄禽成纤维细胞；所述哺乳动物细胞选自①VERO细 胞；②293细胞；③COS细胞；④人二倍体细胞；⑤；BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞； ⑧H印-G2细胞；所述昆虫细胞选自①Tn5细胞 ’②SF9 Cell细胞。
其中，本发明pHWD2000载体是由pHW2000载体改造得到，包括去掉pHW2000载体 上游的PCMV启动子，并用鸡β-actin蛋白启动子替换，同时在鸡β-actin蛋白启动字上 游插入hCMV-IE增强子，改造后的PCWD2000可以在真核系统中高效表达外源基因，同时 PCWD2000有着较小的分子量，可以携带较大的外源基因片段。
其中，本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗可不含有佐剂，也可以含有如下佐 剂中的一种或几种①铝盐氢氧化铝或磷酸铝；②SPOl佐剂由2%角鲨烯、0. 聚氧乙 烯蓖麻油、0. 聚醚组成水包油佐剂；③SP02佐剂在SPOl佐剂中加一定量(20 60ug) 重组细菌鞭毛蛋白；P3BSK4 (N-palmitoyl-S-[2，3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -propul]-[R ]-propyl-[R] -cysteinyl-[S] -seryl-[S] - (Iysyl) 3-lysine)；⑤水凝胶佐剂季胺化的壳 聚糖、⑥rLT 重组不耐热性肠毒素。
本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗可制成多种临床适用的剂型，包含但不限 于注射剂型、喷鼻剂型、舌下含片、透皮贴剂或微针剂型。
本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗包括如下几种RS VLP疫苗、NDV-HNF/ RSV-GF VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G+NDV-F/ RSV-F VLP 疫苗。
本发明RS VLP疫苗的制备方法包括如下步骤
①构建pHWD2000真核表达载体；②含有编码RSV M蛋白核酸序列的重组真核表 达载体；③含有编码RSV NP蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；④含有编码重组RSV G 蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；⑤含有编码重组RSV F蛋白的核酸序列的重组真核 表达载体；⑥提供一种用于表达的细胞系，经转染后可以释放RS VLP ；⑦提供用于纯化RS VLP的方法，方法包括蔗糖梯度离心纯化方法以及柱层析纯化方法。
本发明NDV/RSV VLP疫苗的制备方法包括如下步骤
将含有编码NDV M、NDV NP的核酸序列的重组真核表达载体与含有NDV-HN/RSV-G 融合蛋白、NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重组真核表达载体共同转化用于表达的细 胞系，形成具有NDV核心并携带有RSV表面抗原G、F的NDV-NHF/RSV-GF VLP ；
或将含有编码NDV M、NDV NP、NDV F蛋白的核酸序列的重组真核表达载体与含有 NDV-HN/RSV-G融合蛋白的核酸序列的重组真核表达载体共同转化用于表达的细胞系，形成 具有NDV核心并携带有RSV表面抗原G的NDV-NH/RSV-G VLP ；
或将含有编码NDV M、NDV NP、NDV HN蛋白的核酸序列的重组真核表达载体与含 有NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重组真核表达载体共同转化用于表达的细胞系，形 成具有NDV核心并携带有RSV表面抗原F的NDV-F/RSV-F VLP ；
其中该方法所述NDV-HNF/RSV-GF VLP, NDV-NH/RSV-G VLP, NDV-F/RSV-F VLP 及 NDV-NH/RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP均可激发体液与细胞双重的免疫应答；其中所述RSV G蛋 白包括来自RSV A亚型( 和来自B亚型(Λ。
其中，该方法所述以NDV 为核心的 VLP (NDV-HNF/RSV-GF VLP、NDV-NH/RSV-G VLP、 NDV-F/RSV-F VLP)包括①NDV M蛋白；②NDV NP蛋白；③NDV NH蛋白；④NDV F蛋白； ⑤NDV F蛋白胞与RSV F蛋白的融合蛋白NDV-F/RSV-F ；⑥NDV HN蛋白与RSV G蛋白的融 合蛋白 NDV HN/RSV G。
本发明NDV/RSV VLP疫苗的制备方法还可以为如下步骤
①构建PHWD2000真核表达载体；②含有编码NDV M蛋白核酸序列的重组真核表达 载体；③含有编码NDV NP蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；④含有编码重组NDV NH蛋 白的核酸序列的重组真核表达载体；⑤含有编码重组NDV F蛋白的核酸序列的重组真核表 达载体；⑥含有编码重组NDV HN/RSV G融合蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；⑦含有 编码重组NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重组真核表达载体；⑧提供一种用于表达的 细胞系，经转染后可以高效率释放NDV/RSV VLP ；⑨提供用于纯化NDV/RSV VLP的方法，方 法包括蔗糖梯度离心纯化方法以及柱层析纯化方法。
其中，构建含有重组NDV NH/RSV G以及NDV F/RSV F蛋白核酸序列的重组真核表 达载体的方法包括如下步骤①通过生物信息学，分析NDV F及HN蛋白的胞内区和跨膜区 核酸序列；②通过生物信息学，分析RSV F及G蛋白的胞外区核酸序列；③通过基因合成的 方法合成重组HN/G以及F/F蛋白核酸序列；④在该方法基础上利用酶切与连接的手段构建 含有编码重组NDV NH/RSV G以及NDV F/RSV F蛋白的真核表达载体。10
其中，构建重组表达载体的方法，包括如下步骤将编码RSV M蛋白、F蛋白、NP 蛋白、G蛋白的DNA片断被插入到pHWD2000载体中，构成重组pHWD2000-M、pHWD2000-F、 pHWD2000-NP、pHWD2000-G表达载体；在另一个方案中包括将编码NDV M蛋白、NP蛋白、F蛋 白、HN蛋白、重组F/F蛋白、及重组NH/G蛋白的DNA片断被插入到pHWD2000载体中，构成 重组 pHWD2000-M、pHWD2000-NP, pHWD2000-F, pHWD2000-HN, pHWD2000-F/F, pHWD2000-NH/G 表达载体；所述重组NH为NDV-NH/RSV-G，即pHWD2000-NH/G ；所述重组F为NDV-F/RSV-F， 即 pHWD2000-F/F。
其中，本发明方法涉及一个RS VLP及NDV/RSV VLP表达宿主细胞系，其中，所指细 胞为鸡成纤维细胞或哺乳动物细胞，鸡成纤维细胞有①UMNSAH/DF-1细胞；②分离9_10 龄禽成纤维细胞；哺乳动物细胞选自①VERO细胞 ’②293细胞；③COS细胞；④人二倍体 细胞；⑤BHK细胞；⑥CHO细胞；⑦MDCK细胞；⑧H印-G2细胞；⑨Tn5细胞；⑩SF9 Cell细 胞；其中，所述NDV/RSV VLP表达宿主细胞系包含NDV-HNF/RSV-GF VLP、NDV_NH/RSV_G VLP, 及 NDV-F/RSV-F VLP。
其中，本发明制备RS VLP及NDV/RSV VLP细胞培养方法包括如下步骤在细胞培 养基中加入浓度为2-100 μ g/mL的糖胺聚糖，优选 ομ g/mL ；其中，所指糖胺聚糖为硫酸肝 素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素，优选肝素。
其中，本发明制备RS VLP及NDV/RSV VLP时的纯化方法包括如下步骤蔗糖梯度 离心法，蔗糖浓度为30 ^35%与60%;或柱层析纯化方法，用kphar0Se6FFTM分子筛并进 行 DEAEipharoseFFTM 离子交换。
其中，蔗糖梯度离心的步骤为①收集规模化生产的RS VLP或NDV/RSV VLP细胞 培养液，4°C 5000rmp离心lOmin，去除细胞及杂质；②取上清液IOOOOOg 4°C离心2h，沉淀 用 TNE buffer 悬浮，TNE buffer 的组成为 25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA ； ③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用TNE buffer配制，体系采用30%蔗糖ImL ；45%蔗 糖ImL ；60%蔗糖4mL ；4°C IOOOOOg离心池；④收集中间层，并用折射仪测量密度；⑤用 PH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM介质进行凝胶层析纯化，收集外水体积流穿峰；杂 蛋白去除可达95%以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM介质进行离子交换层析，平衡液为 ρΗ6· 5-7. 5、含有0. 05-0. 15Μ氯化钠的PBS，洗脱液为含0. 2-0. 5Μ氯化钠、ρΗ6· 5-7. 5的 PBS ；杂蛋白去除可达99 %以上，纯化后的VLP原液为疫苗原液。
本发明产品及方法中所述的百分含量均为质量体积百分含量。
本发明涉及一种呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗，包括如下几种RS VLP疫苗、 NDV-HNF/RSV-GF VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、或 NDV-NH/ RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP疫苗。经此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐剂，制备的注射 剂型、喷鼻剂型、舌下含片剂型、透皮剂型免疫不同动物或人群后，可安全、有效预防RSV感 染，为不同年龄人群免疫防控RSV感染提供了疫苗。经过药效实验，将本发明呼吸道合胞病 毒样颗粒疫苗分别通过注射、喷鼻、舌下含片、透皮等途径免疫Balb/C小鼠、恒河猴敏感动 物产生好的体液免疫与细胞免疫应答及天然免疫与获得性免疫应答以及黏膜免疫应答效 果，且Th2/Thl免疫应答趋于平衡，没有免疫肺损伤的迹象，具有安全性。用呼吸道合胞病 毒样颗粒疫苗免疫棉鼠、恒河猴敏感动物两次，进一步通过RSV野生株攻毒，均对A型标准 株RSV A2、B型标准株G8537及不同地区临床分离A和B型RSV流行野生株有90%以上的免疫保护效果。用呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗接种不同年龄段O岁以下、3-17岁、18-59 岁、60岁以上)人群，免疫两次，分别采用注射、喷鼻、舌下含片、透皮剂型疫苗免疫，显示对 各年龄段人群没有出现不适，具有安全性。并能产生好的双重免疫应答和免疫保护力，其保 护率达85%以上，由此表明该疫苗对不同年龄人群具有好的免疫保护效果。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗检定实验
本发明实施例8制备的RS VLP疫苗和NDV/RSV VLP疫苗的注射剂、喷鼻剂、舌下 含片、透皮剂型外观见均一，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒 性反应；通过Lorry法测定蛋白含量均在剂量范围；通过电镜观察VLP直径约140-160 μ m ； ELISA测定DNA含量均在50EU以下；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免 疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在3200以上。
实验例2本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的Balb/C小鼠体内的免疫应 答效果实验
将本发明实施例8制备的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相应佐剂 制备的注射、喷鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型，并用？83、铝盐、3 01、3 02、？；^31(4、1^1细菌 鞭毛为对照组，分别按各自途径免疫5-6周Balb/C小鼠，其免疫剂量按实施例8疫苗低剂 量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天将各组小鼠摘眼球取血、分离血清和免疫细 胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价都在1 6400以 上，采用MTT法测定中和抗体效价都在1 3200以上，采用流式细胞仪、ELISP0T仪测定免 疫细胞与血清中重要细胞因子、炎性分子、趋化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变 化使得TH2/Thl应答平衡，采用ELISA法测定鼻腔、肺灌洗液，SIgA抗体效价都在1 160 以上。这说明本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产 生满意的双重免疫应答，且呈现出试验组有佐剂优于无佐剂组、高剂量组高于低剂量组免 疫应答效果，而对阴性照组没有产生双重免疫应答；本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫 苗不管是注射还是喷鼻、舌下含片、透皮贴剂、微针剂型均都能产生满意的双重免疫应答， 且注射剂血清抗体效价高于微针剂型、喷鼻、舌下含片、透皮贴剂型，喷鼻、舌下含片、微针 剂型黏膜和细胞免疫效应好于注射剂型；本发明NDV-HNF/RSV-GF VLP疫苗免疫应答效力 与 RS VLP 疫苗相当，但优于 NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP+NDV-NH/RSV-G VLP疫苗。由此制备的RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗在小鼠体内具 有好的免疫应答效果。
实验例3本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的棉鼠体内的免疫保护效果实 验
将本发明实施例8制备的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相应佐剂 制备的注射、喷鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型为试验组，并用PBS、铝盐、SPOl、SP02、P3BSK4, rLT、细菌鞭毛及Fl-RSV灭活疫苗为对照组，分别按各自途径免疫6_8周棉鼠，其免疫剂量 按实施例8疫苗低剂量组，免疫两次(0，21天)，末次免疫后14天各试验组、对照组小鼠用 3 X IOf5Pfu临床分离RSV代表株(A、B型)分别气溶胶鼻腔攻毒观察保护效果。结果显示本 发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗均都能产生较好的保护效果，免疫保护率在90 %以 上，且RS VLP疫苗疫苗保护率达98%、NDV-HNF/RSV-GF VLP疫苗保护率达97%、NDV-HN/RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP 疫苗保护率达 96 %、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗保护率达 94 %、 NDV-F/RSV-F VLP疫苗保护率达92 %，而对照组FI-RSV灭活疫苗保护率达60 %、其他各对 照组保护率达为0%。由此制备的RS VLP及NDV NH/RSV VLP疫苗在小鼠体内具有高效的 免疫保护效果。
实验例4本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的恒河猴体内的免疫应答及免 疫保护效果实验
将本发明实施例8制备的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相应佐 剂制备的注射、喷鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型，并用PBS、铝盐、SPOU SP02、P3BSK4, rLT、 细菌鞭毛和FI-RSV灭活疫苗为对照组，分别按各自途径免疫3岁恒河猴，其免疫剂量按实 施例8疫苗高剂量组，免疫两次(0，21天)；末次免疫后14天将各组小鼠摘眼球取血、分 离血清和免疫细胞，采集脾淋巴细胞、肺和鼻腔灌洗液；通过ELISA法测定血清抗体效价都 在12800以上，采用MTT法测定中和抗体效价都在6400以上，采用流式细胞仪、ELISP0T仪 测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动 态变化使得TH2/Thl应答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗体效价在1 200以 上。这说明本发明NDV-NH/RSV VLP疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双 重免疫应答，且试验组有佐剂组好于无佐剂组、高剂量高于低剂量组免疫应答效果，而对照 组没有产生双重免疫应答；本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗不管是注射还是喷鼻、 舌下含片、透皮贴剂、微针剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高 于微针剂型、喷鼻、舌下含片、透皮贴剂型，喷鼻、舌下含片、微针剂型黏膜和细胞免疫效应 好于注射剂型；本发明NDV-HNF/RSV-GF VLP疫苗免疫应答效力优于RSV VLP疫苗、NDV-NH/ RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗。由此制备 的RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗在恒河猴体内具有好的免疫应答效果。
呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗末次免疫后14天各试验组、对照组恒河猴用 2X107pfu临床分离RSV代表株(A、B型)分别气溶胶鼻腔攻毒观察保护效果。结果显示，本 发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗均都能产生高水平的保护效果，免疫保护率在90%以 上，且RS VLP疫苗及NDV-HNF/RSVGF VLP疫苗保护率达 100%,NDV-F/RSV-F+NDV-NH/RSV-G VLP疫苗保护率达98%、NDV-NH/RSV-G VLP疫苗保护率达97%、NDV-F/RSV-F VLP疫苗保 护率达96%、而对照组FI-RSV灭活疫苗保护率达68%、其他各对照组保护率达为0%。由 此制备的NDV NH/RSV VLP疫苗在恒河猴体内具有高效的免疫保护效果。
实验例5本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的人群体内的免疫应答及免疫 保护效果实验
实施例8制备的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相应佐剂的注射、喷 鼻、舌下含片、透皮疫苗剂型，并用？83、铝盐、3 01、3 02、？；^31(4、扎1细菌鞭毛为对照组， 分别按各自途径接种健康不同年龄人群0岁以下、2-17岁、18-59岁、60岁以上)组，2岁 以下、2-17岁年龄组免疫剂量按实施例8疫苗低剂量、18-59岁、60岁以上年龄组免疫剂量 按实施例8疫苗高剂量，接种两次(0，21天)，末次免疫后14天采集各组人群静脉血、分离 血清和免疫细胞，采集鼻腔灌洗液，并全程观察试验疫苗组人群生命体征变化。通过ELISA 法测定血清抗体效价在3200以上，采用MTT法测定中和抗体效价在1 1600以上，采用流 式细胞仪、ELISP0T仪测定免疫细胞与血清重要细胞因子、炎性分子、趋化因子及嗜酸性粒13细胞、中性粒细胞等动态变化TH2/Thl应答趋于平衡，采用ELISA法鼻腔灌洗液SIgA抗体 效价在1 160以上；全过程观察接种疫苗人群90天无明显不适等反应症状；通过现场流 行病学经过360天的跟踪随访其疫苗有很好的免疫保护效果，其保护率达85%以上，且RS VLP 及 NDV-HNF/RSV-GF VLP 疫苗保护率都达 96 %、NDV-NH/RSV-G+NDV-F/RSV_F VLP 疫苗保 护率达94%、NDV-NH/RSV-G VLP疫苗保护率达92%，NDV_F/RSV_F VLP疫苗保护率达88%、 而各对照组保护率达为12%。由此制备的RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗不管是注射或 是喷鼻或是舌下含片或是透皮免疫接种在不同年龄人群中有很好的免疫应答和免疫保护 效果。
实验例6本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的安全性实验
(1)无菌、支原体试验将实施例8制备的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗接种硫 乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴 性对照，培养温度为25°C、35°C。结果显示，RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP两类疫苗都未见细 菌生长。将RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗分别用半流体和肉汤培养基，37°C初代培养21 天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗 都无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧 光染料染色。结果显示，RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗都无支原体生长。
(2)溶血性试验选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤 3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗(由实施例 8制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血 球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球 破裂，无溶血现象。说明RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此， RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗都无溶血反应。
(3)急性毒性试验取实施例8制备的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗0. 5ml腹腔注 射体重为12 18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的 活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行 动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗在试验的 浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重 为8 IOkg的Beagle狗体内的急性毒性结果取实施例8制备的RS VLP及NDV/RSV VLP 疫苗肌肉注射15mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率 变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各 狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗都无急性毒性反应，使用是安全的。
(4)过敏试验研究取实施例8制备的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗分别皮下接种 体重为250 350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0. 5ml，隔日一次，共3 次。第3次注射后21天，耳静脉分别给予相同RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗0. 5ml，并用人 血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟 及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗组豚鼠无死亡， 且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，RS VLP及NDV/RSV VLP 两类疫苗在动物体内都无过敏反应。
(5)兔热源质试验取预检合格的体重为2 3kg家兔3只固定，30分钟后测 量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0. 2°C，各家兔2次平均温度在 38. 6-39. 5 0C。将实施例8制备的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗预热至38 °C，于第2次测温后 15分钟内，自家兔耳边静脉分别缓缓注入0. 5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连 测6次。结果显示RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗给予家兔个体升温均未超过0. 2°C，3只家 兔升温总和未超过0.4°C，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的RS VLP及NDV/RSV VLP 两类疫苗都无热源质。
(6)免疫病理损伤试验由实施例8制备的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗通过小鼠、 恒河猴和人群外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细 胞及气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测。试验结果显示，RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗 免疫接种不管在大小动物，或是在人体内Th2/Thl免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤 的迹象，因此具有安全性。
实验例7本发明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的稳定性实验
由实施例8制备的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗，分别置于2_8°C、室温O0_25°C )、 37°C 1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和M个月，取样观察外观、PH值、 无菌、电镜观察粒径、免疫动物观察安全性。结果显示RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗放置 2-80C 24个月内均无变色分层等现象，PH值在7. 0-7. 2之间无变化，电镜观察粒径大小保 持一致，且注射或滴鼻或透皮给Balb/c小鼠表现正常；RS VLP及NDV/RSVVLP疫苗放置室 温25 °C 3个月内均有好的稳定性；RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗放置室温37 °C 1个月内均 有好的稳定性效果。由结果说明，RS VLP及NDV/RSV VLP两类疫苗放置2_8°C理化性质、生 物学性能稳定，有效期至少M个月。
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

实施例1 本发明呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗的基因及蛋白构成
以RSV的M蛋白核酸与蛋白序列、RSV的NP蛋白的核酸与蛋白序列、RSV的F蛋白 的核酸与蛋白序列、RSV的G蛋白的核酸与蛋白序列、NDV的M蛋白核酸序列与蛋白序列、 NDV的NP蛋白核酸序列与蛋白序列、NDV的HN蛋白核酸序列与蛋白序列、NDV的F蛋白核 酸序列与蛋白序列，见表1-20所示。
实施例2.本发明呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗的表达载体构建
以构建重组pHWD2000表达载体为例利用PCR的方法扩增RSV M基因白核酸序 列、F蛋白基因序列、G蛋白基因序列、NP蛋白基因序列并插入到PHWD2000载体中，构成重 组 pHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-G、pHWD2000-NP 表达载体。在另一个方案中 NDVM 基因白核酸序列、F蛋白基因序列、NP蛋白基因序列并插入到PHWD2000载体中，构成重组 PHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-NP 表达载体。
pHWD2000-NH/G表达载体构建通过生物信息学方法，分析NDV HN蛋白基因序列 胞内区(CT)与跨膜区(TM)，同时分析RSV G蛋白基因序列胞外区，通过基因合成的方法合 成重组HN/G蛋白基因序列，然后利用酶切与连接的方法构建重组表达载体pHWD2000-NH/ G，并包含Bsa I酶切为点。
pHWD2000-F/F表达载体构建通过生物信息学方法，分析NDV F蛋白基因序列胞 内区(CT)与跨膜区(TM)，同时分析RSV F蛋白基因序列胞外区，通过基因合成的方法合成 重组F/F蛋白基因序列，然后利用酶切与连接的方法构建重组表达载体pHWD2000-F/F，并 包含Bsa I酶切为点。
实施例3.细胞培养及细胞批库建立
以UMNSAH/DF-1细胞培养并建库为例UMNSAH/DF_1细胞来源于American Type Culture Collection(ATCC)。培养基采用 Dulbecco，s modified Eagle medium(DMEM)，添 加青霉素及链霉素，不加或加入一定量胎牛血清(10-2% )在细胞工厂或细胞发酵罐进行 培养，建立细胞工作种子批库，并及对传代后的外援源因子、致瘤性及稳定性等全面检定， 细胞使用代数控制在60代以内，均符合疫苗生产介质的要求。
所述细胞培养及细胞批库建立包括但不限于①UMNSAH/DF-1细胞；②人二倍体 细胞；③Vero细胞；④CHO细胞；⑤H印-2细胞；⑥MDCK细胞。
实施例4 质粒转染及稳定高表达细胞系筛选与建库
RS VLP疫苗选用实施例3细胞库中UMNSAH/DF-1细胞，采用脂质体法将实施 例2构建的表达质粒转染UMNSAH/DF-1细胞，并筛选稳定高表达RS VLP的细胞系，具体 是①在:35mm 孔中，加入 pHWD2000_NP 1. 0 μ g、pHWD2000_M 1. 0 μ g、pHWD2000_G 1. 0 μ g、 PHWD2000-F 0. 75yg;②加入5yL OptiMEM配置的脂质体，室温孵育45min。然后加入到 被OptiMEM润洗过的宿主细胞中，孵育证；③离心去除载体-脂质体混合物，并向细胞中加 入 DMEM 进行培养；④ pHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-NP、pHWD2000-G 四种重组载体在 细胞系中共表达，可自组装RS VLP ；⑤通过加压筛选表达RS VLP的UMNSAH/DF-1细胞株。 结果显示，在UMNSAH/DF-1细胞23代时筛选到稳定高表达RS VLP的细胞株，经细胞系稳定 表达与产量、VLP大小与结构、外源因子与致瘤性、染色体完整性等传代至40代没有表型改 变。由此，建立了稳定高表RS VLP的UMNSAH/DF-1细胞系。进一步建立具有RS VLP的三 级细胞种子批库，经对全面检定符合疫苗生产要求，放置液氮中保存备用。
NDV/RSV VLP疫苗选用实施例3细胞库中UMNSAH/DF-1细胞，采用脂质体法将 实施例2构建的表达质粒转染UMNSAH/DF-1细胞，并筛选稳定高表达NDV/RSV VLP的细胞 系，具体是①在 35mm 孔中，加入 pHWD2000-NP 1. 0 μ g、pHWD2000_M 1. 0 μ g、pHWD2000-NH 0. 75 μ g、pHWD2000-F 0. 75 μ g、pHWD2000-F/F 0. 75 μ g ；pHWD2000-NH/G 0. 75 μ g ②加入 5 μ LOptiMEM配置的脂质体，室温孵育45min。然后加入到被OptiMEM润洗过的宿主细胞中， 孵育证；③离心去除载体-脂质体混合物，并向细胞中加入DMEM进行培养；④pHWD2000-M、 PHWD2000-NP、分别与 pHWD2000-F/F 及 pHWD2000-NH/G、或 pHWD2000-F 及 pHWD2000-NH/G、 或pHWD2000-F/F及pHWD2000-NH、重组载体在细胞系中共表达，可自组装NDV-NHF/RSV-GF VLP、NDV-NH/RSV-G VLP、NDV-F/RSV-F VLP ；⑤通过加压筛选表达 NDV/RSV VLP 的 UMNSAH/ DF-I细胞株。结果显示，在UMNSAH/DF-1细胞21代时就筛选到稳定高表达NDV/RSVVLP的 细胞株，经细胞系稳定表达与产量、VLP大小与结构、外源因子与致瘤性、染色体完整性等传 代至40代没有表型改变。由此，建立了稳定高表NDV/RSV VLP的UMNSAH/DF-1细胞系。进 一步建立具有NDV/RSV-G VLP的三级细胞种子批库，经对全面检定符合疫苗生产要求，放置 液氮中保存备用。
所述稳定高表RS VLP及NDV/RSV VLP的细胞系包括但不限于①UMNSAH/DF-1细16胞；②人二倍体细胞；③Vero细胞；④CHO细胞；⑤H印-2细胞；⑥MDCK细胞。
实施例5 =RS VLP或NDV/RSV VLP规模化生产
取稳定表达RS VLP或NDV/RSV VLP的UMNSAH/DF-1工作批库细胞，用DMEM细胞 培养液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入10μ g/mL的肝素)通过20L细胞工厂或加入 微载体30L细胞发酵罐放大培养生产使得细胞密度达到1 X ΙΟ7"8以上时，收集细胞培养RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗原液。
RS VLP或NDV/RSV VLP规模化生产方法包括如下方法
①人二倍体细胞取稳定表达RS VLP或NDV/RSV VLP的二倍体细胞工作批库细 胞，用DMEM细胞培养液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通过20L 细胞工厂放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗原液。
②Vero细胞取稳定表达RS VLP或NDV/RSV VLP的Vero细胞工作批库细胞，用 DMEM细胞培养液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通过20L细胞 工厂或加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养RS VLP或 NDV/RSV VLP疫苗原液。
③CHO细胞取稳定表达RS VLP或NDV/RSV VLP的CHO细胞工作批库细胞，用DMEM 细胞培养液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通过20L细胞工厂或 加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养RS VLP或NDV/ RSV VLP疫苗原液。
④H印-2细胞取稳定表达RS VLP或NDV/RSV VLP的H印_2细胞工作批库细胞， 用DMEM细胞培养液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通过20L细 胞工厂或加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养RS VLP 或NDV/RSV VLP疫苗原液。
⑤MDCK细胞取稳定表达RS VLP或NDV/RSV VLP的MDCK细胞工作批库细胞，用 DMEM细胞培养液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通过20L细胞 工厂或加入微载体的30L细胞发酵罐放大培养至适当细胞密度时，收集细胞培养RS VLP或 NDV/RSV VLP疫苗原液。
实施例6 =RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗的纯化
①收集规模化生产的RS VLP或NDV/RSV VLP细胞培养液，4°C 5000rmp离心 lOmin，去除细胞及杂质；②取上清液IOOOOOg 4°C离心浊，沉淀用少量TNE buffer (25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA)悬浮。③将悬液进行蔗糖梯度离心，蔗糖采用TNE buffer配制，体系采用20%蔗糖3. 5mL ；65%蔗糖0. 5mL。4°C IOOOOOg离心2h ；；④收集 中间层，并用折射仪测量密度；⑤用PH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM介质进行凝胶 层析纯化，收集外水体积流穿峰。杂蛋白去除可达95%以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM 介质进行离子交换层析，平衡液为PH6. 5-7. 5、含有0. 05-0. 15M氯化钠的PBS，洗脱液为含 0. 2-0. 5M氯化钠、pH6. 5-7. 5的PBS。杂蛋白去除可达99%以上，纯化后的VLP原液为疫苗 原液。
实施例7 =RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗原液的检定
RS VLP及NDV/RSV VLP原液的外观为澄清液体；pH值为7. 0-7. 2 ；通过血平板进 行杂菌鉴定结果为阴性；通过半流体和肉汤培养基培养进行支原体鉴定结果为阴性；通过PAGE-SDS电泳检测结果显示目的条带清晰、无其他杂带；采用Reed&Muench法计算抗血清 中和效价均高于1 2800。
实施例8 =RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗剂型配制
①注射剂型配制将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP不加佐剂，配制10ug/0. 5ml、 20ug/l. Oml无佐剂注射剂型；将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入氢氧化铝或磷酸铝 配置7. 5ug(蛋白)/0. 5mg(铝盐)/0. 5ml、15 μ g(蛋白)/1. Omg(铝盐)/0. 5ml有佐剂疫 苗剂型；将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入SPOl佐剂0%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖 麻油、0. 聚醚)、SP02佐剂角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug细菌鞭 毛)、SP03佐剂0%角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug P3BSK4)混勻水包油 样，分别配制5. 0ug/0. 5ml、10ug/l. Oml有佐剂注射呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗剂型。以上 注射疫苗溶液装入吸顶瓶，放2-8°C备用。
②喷鼻剂型配制将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP不加佐剂吸附，配制7. 5ug μ g/0. 2ml、15ug/0. 2ml无佐剂喷鼻疫苗剂型；将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入等体 积季胺化壳聚糖水凝胶黏膜佐剂与传递系统，配制5. 0 μ g/0. 2mlU0 μ g/0. 2ml有佐剂喷 鼻疫苗剂型；将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入等体积季胺化壳聚糖水凝胶与10 μ g 细菌鞭毛或10 μ g P3BSK4黏膜佐剂及传递系统，配制4. 0 μ g/0. 2ml,8 μ g/0. 2ml有佐剂喷 鼻呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗剂型。以上喷鼻疫苗溶液装入定量喷鼻装置，放2-8°C备用。
③舌下含片剂型配制将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP 10 μ g、20 μ g分别加入 0.5%明胶、5%蔗糖、0.2%维生素C、0. 谷维素和0. 脱脂奶粉，用磷酸盐缓冲液调 PH7. 2，压片冷冻干燥，配制10 μ g/片、20 μ g/片无佐剂舌下含片剂型；将纯化RS VLP或 NDV/RSV VLP 蛋白 7. 5μ g、15y g 与 15 μ gP;3BSK4 或 Flagellin 分别加入 0. 5% 明胶、5% 蔗 糖、0. 2 %维生素C、0. 1 %谷维素和0. 1 %脱脂奶粉，用磷酸盐缓冲液调PH7. 2，压片冷冻干 燥，配制7. 5 μ g/片、15 μ g/片有佐剂呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗舌下含片剂型；以上舌下 含片疫苗装入密封板片内，放2-8 °C备用。
④透皮贴剂剂型配制将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP 75 μ g、100 μ g分别加入类 脂C，配置75 μ g/贴片、100 μ g/贴片无佐剂透皮贴剂剂型；将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP 蛋白50 μ g、100 μ g分别加入油酸促渗剂和LT佐剂，配置50 μ g/贴片、100 μ g/贴片有佐剂 舌下含片透皮贴剂剂型。放2-8°C备用。
⑤透皮微针剂型配制将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP不加佐剂，配制5 μ g/0. 5ml、 10 μ g/微针剂无佐剂剂型；将纯化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入SPOl佐剂角鲨 烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐剂角鲨烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、 0. 聚醚、IOyg细菌鞭毛)或SP03佐剂角鲨烯、0. 1 %聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、 IOug P3BSK4)混勻水包油样，分别配制3. 0 μ g/微针剂、5 μ g/剂有佐剂舌下含片微针剂剂 型。放2-8°C备用。18


本发明公开了一种核心来自新城疫病毒、表面蛋白来自合胞病毒的病毒样颗粒疫苗(NDV/RSV VLP疫苗)及其制备方法。本发明RS VLP疫苗含有合胞病毒M、F、NP、G四种结构蛋白组成的VLP；NDV/RSV VLP疫苗含有新城疫病毒M、F、NP、NH四种结构蛋白，以及新城疫病毒F蛋白与合胞病毒F组成的NDV F/RSV F融合蛋白、新城疫病毒HN蛋白与合胞病毒G蛋白组成的NDV HN/RSV G融合蛋白两种表面蛋白组成的VLP。药效实验表明，经此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐剂，制备的各种剂型免疫不同动物或人群后，可安全、有效预防RSV感染，为不同年龄人群免疫防控RSV感染提供了疫苗。