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一种疫苗组合物及其应用制作方法

  • 专利名称
    一种疫苗组合物及其应用制作方法
  • 发明者
    张许科, 孙进忠, 夏力亮, 廖永洪, 田克恭
  • 公开日
    2014年12月31日
  • 申请日期
    2014年5月15日
  • 优先权日
    2014年5月15日
  • 申请人
    普莱柯生物工程股份有限公司
  • 文档编号
    A61P31/00GK104248753SQ201410204020
  • 关键字
  • 权利要求
    1. 一种猪支原体肺炎疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物含有P46蛋白、NrdF蛋 白和兽医学上可接受的佐剂2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物,其特征在于,所述P46蛋白为SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4编码的一种或两种蛋白混合物3. 根据权利要求1所述的疫苗组合物,其特征在于,所述NrdF蛋白为SEQ ID No. 6编 码的蛋白4. 根据权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物中的P46 蛋白、NrdF蛋白串联表达5. -种猪支原体肺炎疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物由P46蛋白、NrdF蛋白 和兽医学上可接受的佐剂组成6. 根据权利要求1-5任一项所述的疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物还含有 猪肺炎支原体全菌抗原7. 根据权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物,其特征在于,所述佐剂为铝胶佐剂、皂 苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸 酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰 脂质A、AVridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或 Gel佐剂中的一种或几种8. 根据权利要求7所述的疫苗组合物,其特征在于,所述佐剂为Gel佐剂9. 根据权利要求1-8任一项所述疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物还包括其 他抗原,所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌 抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪 狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种;优选地,所述其他抗 原为猪圆环病毒抗原10. 权利要求1-9任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药 物中的应用
  • 技术领域
    [0001] 本发明属于兽用生物制品
  • 专利摘要
    本发明提供了一种猪支原体肺炎疫苗组合物,所述疫苗组合物包括P46蛋白、NrdF蛋白和/或兽医学上可接受的佐剂;所述疫苗组合物还可包括猪肺炎支原体全菌抗原。本发明还公开了含所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。所述疫苗组合物中的多免疫原性蛋白可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达,不仅耗时短,还可便于大规模生产,并且多免疫原性蛋白片段的组合可诱导产生协同的免疫效果;当所述疫苗组合物含多免疫原性蛋白及猪肺炎支原体全菌抗原时,比单独使用全菌疫苗免疫时,猪肺炎支原体全菌抗原的含量显著降低。
  • 发明内容
  • 专利说明
    一种疫苗组合物及其应用
  • 专利详情
  • 全文pdf
  • 权力要求
  • 说明书
  • 法律状态
一种疫苗组合物及其应用的制作方法 【技术领域】,具体涉及猪支原体肺炎疫苗组合物及其应 用。 [0002] 猪支原体肺炎又称猪气喘病或猪地方性流行性肺炎,是由猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病,普遍存在于世界 各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘,生长迟缓,饲料转化率低,严重危害着养猪业的发展。 [0003] 近几年的研究发现:猪肺炎支原体感染病例日益增多,许多规模化养猪场受到猪 气喘病的严重威胁。抗生素应用在治疗气喘病虽然有一定效果,但是国家对于抗生滥用日 益重视,管理日益严格,因此,疫苗免疫将是未来有效预防该病的一种有效方法。而目前国 内应用的疫苗主要以弱毒疫苗和灭活疫苗为主,国产弱毒疫苗由于需要胸腔注射而不易推 广;灭活疫苗虽然可通过肌肉注射,操作便易,但主要被以辉瑞、海博莱、勃林格为首的国外 公司垄断,而且疫苗价格昂贵致使防疫成本变高。 [0004] 近年来,人们开始尝试利用现代分子生物学手段从研究Mhp的致病机理和主要 抗原蛋白入手,利用外源表达载体获得大量Mhp相关抗原蛋白,同时与其他相关刺激因子 重组表达而制备成新型猪支原体肺炎亚单位疫苗。这种新型的猪支原体肺炎亚单位疫苗 不含全菌疫苗的核酸,不仅不存在灭活不彻底造成的安全隐患,而且由于其不含全菌的 所有抗原,有利于疾病的净化。但目前猪支原体肺炎亚单位疫苗免疫效果不佳,不能给 猪提供完全的保护(Fagan PK, Djordievic SP. Chin J, et al. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopeumoniae antigen (NrdF) · Infection and immunity, 1997, 65:2502-2507) 〇


[0005] 为了解决现有技术的不足,本发明提供了猪支原体肺炎疫苗组合物及其应用。
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种猪支原体肺炎疫苗组合物,所述疫苗组合物包含 P46蛋白、NrdF蛋白和兽医学上可接受的佐剂。
[0007] 本发明所用术语"猪支原体肺炎"在临床上的症状包括(但不限于):呼吸症状 (严重急性临床肺炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸速迫)、发热、高度传染性、高发病率、低死亡率、 坏死性细胞支气管炎及继发性细菌性呼吸道感染增加。
[0008] 本发明所用术语"猪支原体肺炎疫苗组合物"是指能够用于预防和/或治疗由猪 肺炎支原体感染所知病症或疾病的疫苗,该疫苗组合物可包括任何能够有效预防和/或治 疗猪受猪肺炎支原体感染的疫苗,能够用于猪支原体肺炎疫苗组合物包括(但不限于)完 全或部分猪支原体肺炎细胞制剂、灭活或改良活体疫苗、亚单位疫苗。
[0009] 本发明所述的猪支原体肺炎疫苗组合物优选为亚单位疫苗,所述"亚单位疫苗"包 含一个或多个猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质,或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段, 或编码所述一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质,或所述多肽或蛋白质免疫原性片 段的一个或多个猪肺炎支原体基因或核酸,且所述基因或核酸能在猪体内进行表达。猪肺 炎支原体多肽、蛋白质、所述多肽和蛋白质的免疫原性片段、或猪肺炎支原体基因或核酸可 用于本领域公知技术合成或重组制备。
[0010] 本发明所用术语"预防和/或治疗"在涉及猪肺炎支原体感染时是指抑制猪肺炎 支原体细菌的复制、抑制猪肺炎支原体的传播或防止猪肺炎支原体在其宿主体内定居,以 及减轻猪肺炎支原体感染所之疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/ 或摄食量和/或生长增加,那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
[0011] 本发明所用术语"猪"是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物,如猪。
[0012] 本发明所用术语"P46蛋白"属于Mhp的细胞膜表面抗原蛋白,引起早期免疫反 应;该蛋白分子量达46kD,为含1257bp (编码419AA)的ORFs (Open reading frames,即 开放阅读框);该蛋白种内高度保守,且其基因序列中有3个编码色氨酸(Trp)的密码 -f· TGA(Futo S, Seto Y, Mitsuse S, et al. Molecular cloning of a46-kilodalton surface antigen (p46) gene from mycoplasma hyopneumoniae: direct evidence of egg codon usage for arginine, J Bacteriol, 1995, 177 (7) : 1915-1917) 〇
[0013] 优选地,所述P46蛋白为SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4编码的一种或两种蛋白混合 物。
[0014] 所述P46蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3。
[0015] 本发明所用术语"NrdF蛋白"为NrdF全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段, 即 NrdF 全蛋白的 R2 亚基 C 端(Fagan PK, Djordjevic SP, Eamens GJ, et al. Molecular characterization of a ribonucleotide reductase(NrdF)gene fragment of Mycoplasma hyopneumoniae and assessment of the recombinant product as an experimental vaccine for enzootic pneumonia. Infection and immunity, 1996, 64:1060-1064) 〇
[0016] 优选地,所述NrdF蛋白为SEQ ID No. 6编码的蛋白。
[0017] 所述NrdF蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No. 5。
[0018] 本发明所用术语"佐剂"可包括铝胶佐剂;皂苷(saponin),如Quil A、 QS-21 (Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI_0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation,Birmingham AL);油包水乳剂;水包油乳剂;水包油包水 乳剂;丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物;顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物 选出的化合物。
[0019] 本发明所用术语"乳剂"可尤其基于轻液体石錯油(^European Pharmacopea类 型);因烯经寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoidoil),如角S烧(squalane)或角S烯 油(squalene oil),尤其异丁烯或葵烯;酸或醇的含线性烧基的酯,更尤其植物油、油酸乙 酯、丙二醇二_(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯;支链 脂肪酸或醇的酯,尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离 子表面活性剂,尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、 脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异 硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯,它们任选乙氧基化,还有聚氧丙烯-聚氧乙 烯嵌段共聚物,尤其Pluronic产品,特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants)) (Ed. by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等编写的《Vaccine》(1997, 15:564-570)。例如,可使用 Powell Μ 和 Newman Μ 编写的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach〉〉(Plenum Press, 1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。
[0020] 本发明所用术语"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"优选为交联的丙烯酸或甲基 丙烯酸聚合物,尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联,这些化合物已知被称为 卡波姆(Carbomer,商品名Carbopol)(Phameuropa, 1996, 8(2))。本领域技术人员还可 参见美国专利US2909462,其描述了这类丙烯酸聚合物,其与聚羟基化的化合物交联,所 述化合物具有至少3个羟基,优选不超过8个,其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2 个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳 原子的基团,例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基,如甲基。这些产品以卡波普的名义出 售,(BF Goodrich, Ohio, USA)特别合适。它们与烯丙基鹿糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P,最优选使用卡波普971P。
[0021] 本发明所用术语"顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物"也可考虑顺丁烯二酸 酐与乙烯的共聚物EMA (Monsanto),这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液,经中和,优选中 和至生理pH,以便产生佐剂溶液,能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。
[0022] 本发明所用术语"佐剂"还包括,但不限于,RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、 Block c〇-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF_M(Chiron,Emeryville CA)、单憐醜脂质 A(monophosphoryl lipidA)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其 它)、霍乱毒素、MS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。
[0023] 优选地,所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、 丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐 剂系统、Block c〇-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热 肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种;优选为Gel佐剂。
[0024] 更优选地,所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5 % -30 %。
[0025] 作为本发明的一种实施方式,所述疫苗组合物中的P46蛋白、NrdF蛋白串联表达。
[0026] 作为本发明的一种实施方式,所述疫苗组合物由P46蛋白、NrdF蛋白和兽医学上 可接受的佐剂组成。
[0027] 优选地,所述疫苗组合物还含有猪肺炎支原体全菌抗原。
[0028] 本发明所用术语"猪肺炎支原体全菌抗原"是指包含至少一种对猪接种后诱导、刺 激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的全菌抗原的任何组合物。所述猪肺炎支原体 全菌抗原是完整的猪肺炎支原体,不仅包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株,还 包括灭活的、改良的活的或减毒的猪肺炎支原体,优选为灭活形式,更优选为猪肺炎支原体 HN0603株或J株。猪肺炎支原体全菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原,如:猪肺 炎支原体如勃林格殷格翰公司的[ngelvac? M. hyo、哈药集团公司的瑞倍适Respisure和 RespisureOne、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend MH、梅里亚动物保 健公司的猪克喘、国内生产的168株活疫苗。
[0029] 作为本发明的一种实施方式,所述疫苗组合物由P46蛋白、NrdF蛋白、猪肺炎支原 体全菌抗原和兽医学上可接受的佐剂组成。
[0030] 本发明所用术语"猪肺炎支原体"与"Mhp"在本发明中可互换使用。
[0031] 本发明所用术语"开放阅读框"或"0RF"是指编码不含插入的终止密码子的特定 Mhp蛋白质所需的最小核苷酸序列。
[0032] 本发明所用缩略语为:AA,氨基酸;bp,碱基对;kD,千道尔顿。
[0033] 优选地,所述疫苗组合物还包括其他抗原,所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪 繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗 原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒 抗原中的一种或多种。优选地,所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。
[0034] 本发明又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎 的药物中的应用。
[0035] 本发明具有以下突出的优点:
[0036] (1)所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表 达,不仅耗时短,还可便于大规模生产;
[0037] (2)所述疫苗组合物中多免疫原性蛋白片段的组合可诱导产生协同的免疫效果;
[0038] (3)所述疫苗组合物含多免疫原性蛋白及猪肺炎支原体全菌抗原时,比单独使用 全菌疫苗免疫时,猪肺炎支原体全菌抗原的含量显著降低。
[0039] 序列表中:
[0040] 序列1为P46蛋白的核苷酸序列;
[0041] 序列2为P46蛋白的氨基酸序列;
[0042] 序列3为P46蛋白的核苷酸序列;
[0043] 序列4为P46蛋白的氨基酸序列;
[0044] 序列5为NrdF蛋白的核苷酸序列;
[0045] 序列6为NrdF蛋白的氨基酸序列。


[0046] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0047] 本发明实施例中所用的猪肺炎支原体P46蛋白、NrdF蛋白的序列,来源于已报道 的国际标准株J株,在NCBI中的登录号为AE017243. 1。
[0048] 本发明实施例中,以大肠杆菌表达载体为例进行表达,通过基因工程手段获得猪 肺炎支原体P46蛋白、NrdF蛋白,但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限 定。
[0049] 本发明实施例以Montanide?Gel01 (法国SEPPIC公司)作为佐剂,并以体积比为 10 %的佐剂,制备猪支原体肺炎疫苗组合物为例进行阐述,但该实施方式无论在任何情况 下均不构成对本发明的限定。
[0050] 本发明实施例中所采用猪肺炎支原体HN0613株,保藏号为CCTCCNO.M2012230,保 藏日期为2012年6月13日,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,该毒株已经在专利申请 CN103083655A 中公开。
[0051] 本发明实施例中所采用的攻毒毒株为猪肺炎支原体CVCC354株,该毒株的保藏号 为CVCC354,保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0052] 本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体 肺炎的典型肺部眼观病变,对发病程度进行量化判定,包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现 的实质样病变,如"肉样变"、"胰样变"。肺炎病变评分标准为:2个尖叶、2个心叶、2个膈 叶、1个中间叶共计7个肺叶,每个肺叶满分为4分,共计28分。根据发生实质病变的肺叶 面积所占该叶的比例,分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为〇分;病变面积比例为 1% -25%,记为1分;病变面积比例26% -50%,记为2分;病变面积比例为51% -75%,记 为3分;病变面积比例为76% -100%,记为4分。如肺叶正反两面均有病变,以病变面积大 的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对 照组猪进行记分后,按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率:
[0053] b*.炎病夺a轉....攻毐对照组_炎病变τ均得分-免疫猪肺炎病变τ均得分H 攻毒对照组_炎病变f均得分
[0054] 本发明实施例统计分析方法为:统计7个肺叶的肺病变指数,确定病变程度。用 SPSS计算机软件进行AN0VA分析,比较各组间差异,确定病变差异的有效性。
[0055] 本发明中所用的pH7. 2PBS液配方为:1000mL蒸馏水中加入NaC19g、 Na2HP04 · 12H206g、NaH2P04 · 2H200. 4g,本发明中所用到的化学试剂均为分析纯,购自国药集 团。
[0056] 为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这 些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法,若无特殊说 明,均为常规方法;所述的生物材料,若无特殊说明,均可从商业途径获得。
[0057] 实施例1猪肺炎支原体蛋白的表达、鉴定与纯化
[0058] 1. 1P46重组载体的构建及蛋白的表达、鉴定与纯化
[0059] 根据NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中报道的猪肺炎支原体J株(登 录号:AE017243. 1)中的 P46 蛋白核苷酸序列(见 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3),用 Primer Premier5软件设计P46蛋白的引物及定点突变用引物序列,详情见表1。
[0060] 表1P46蛋白引物序列表
[0061]


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