重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗皮肤组织衰老与创伤药物中的应用的制作方法[0002]皮肤衰老，主要由内部原因和外部原因引起，其中，内在因素:1)皮肤附属器官功能的自然减退例如皮肤的汗腺、皮肤腺功能降低，分泌物减少，使皮肤的皮肤膜、角质层缺乏滋润而干燥，造成干纹、脱皮现象。2)由于皮肤新陈代谢减慢，真皮内的保湿因子减少，使得真皮内弹力纤维和胶原纤维功能减退，造成皮肤张力，弹力减弱，使皮肤容易出现皱纹。3)面部的皮肤较身体其他部位皮肤薄。由于皮肤的营养障碍，使得皮下脂肪储存逐渐减少，细胞和纤维组织营养不良，性能下降。4)生物体酶逐渐减少，身体各方面技能减退，使得大量的自由基破坏人体细胞，使细胞死亡。外在因素:1)保养不当，缺乏对皮肤的护理，或不正确的皮肤护理程序。2)寒冷、干燥的气候，使得皮肤的各项机能减退，皮肤缺乏水分。3)过度暴露在阳光下，引起皮肤老化。4)造成皮肤衰老的主要原因是由于毛孔平常受到死亡细胞的阻塞，影响新陈代谢所致。[0003]皮肤创伤，最轻度的创伤仅限于皮肤表皮层，可通过上皮再生愈合。稍重者有皮肤和皮下组织断裂，并出现伤口 ；严重的创伤可有肌肉、肌键、神经的断裂及骨折。皮肤附属器(毛囊、汗腺及皮脂腺)如遭完全破坏，则不能完全再生，而出现瘢痕修复。肌腱断裂后，初期也是瘢痕修复，但随着功能锻炼而不断改建，胶原纤维可按原来肌腱纤维方向排列，达到完全再生。皮肤创伤愈合过程: 1.伤口的早期变化伤口局部有不同程度的组织坏死和血管断裂出血，数小时内便出现炎症反应，表现为充血、浆液渗出及白细胞游出，故局部红肿。伤口中的血液和渗出液中的纤维蛋白原很快凝固形成凝块，有的凝块表面干燥形成痂皮，凝块及痂皮起着保护伤口的作用。[0004]2.伤口收缩2~3日后边缘的整层皮肤及皮下组织向中心移动，于是伤口迅速缩小，直到14天左右停止。伤口收缩的意义在于缩小创面。[0005]3.肉芽组织增生和瘢痕形成大约从第3天开始从伤口底部及边缘长出肉芽组织填平伤口。第5~6天起纤维母细胞产生胶原纤维，其后一周胶原纤维形成甚为活跃，以后逐渐缓慢下来。随着胶原纤维越来越多，出现瘢痕形成过程，大约在伤后一个月瘢痕完全形成。[0006]4.表皮及其它组织再生创伤发生24小时内，伤口边缘的基底细胞即开始增生，并在凝块下面向伤口中心迁移，形成单层上皮，覆盖于肉芽组织的表面。当这些细胞彼此相遇时，则停止迁移，并增生、分化成为鳞状上皮。健康的肉芽组织对表皮再生十分重要，因为它可提供上皮再生所需的营养及生长因子。如果肉芽组织长时间不能将伤口填平并形成瘢痕，则上皮再生将延缓；在另一种情况下，由于异物及感染等刺激而过度生长的肉芽组织(Exuberant granulation),高出于皮肤表面,也会阻止表皮再生，因此临床常需将其切除。若伤口过大(一般认为直径超过20cm时)，则再生表皮很难将伤口完全覆盖，往往需要植皮。
[0007]灵芝免疫调节蛋白(FungalImmunomodulatory Protein of Ganodermalucidium, LZ_8)是1989年Kino等从灵芝菌丝体提取物中分离到第一个真菌免疫调节蛋白。以往研究表明，LZ-8具有抑制小鼠系统性过敏反应，刺激人类外周血淋巴细胞增殖和IL-2、TNF-a和IFN-Y等细胞因子产生的免疫学活性。利用已构建的毕赤酵母GS115菌株重组表达rLZ-8及相应的中试纯化工艺获得重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)。rLZ-8作为重组蛋白免疫调节制剂，具有多种免疫功能，它可避免化疗在发挥抗癌、抑癌作用的同时所带来的一系列毒副反应。


[0008]本发明目的是提供重点涉及重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在制备皮肤修复药物中的应用，重点考察了皮肤衰老大鼠模型与皮肤创伤大鼠模型治疗效果的影响，建立了皮肤衰老大鼠模型与皮肤创伤大鼠模型，采用数学统计软件对数据进行检验处理，得出rLZ-8在皮肤衰老大鼠模型与皮肤创伤大鼠模型治疗中具有显著疗效。具体
如下: 皮肤修复模型建立:1)皮肤衰老大鼠模型:选用健康的雌性Wistar大鼠，颈背部皮下注射D-半乳糖造模，连续注射数周。显微镜观察模型建立情况。2)皮肤创伤大鼠模型:选用健康的雌性SD大鼠，体 重240-290克之间，大鼠用5%的Na2S背部脱毛，于背部造成I个全厚皮缺损创面，直径为1.5cm，深达肌层。
[0009]实验分组和给药方式:1)皮肤衰老大鼠:78只雌性Wistar大鼠，随机分为6组(n=13):正常对照组、衰老模型组、阳性对照组、rLZ-8低剂量组、rLZ-8中剂量组、rLZ-8高剂量组；正常对照组与衰老模型组注射生理盐水(0.1ml),阳性对照组注射维生素E (80mg/kg/d), rLZ-8 低剂量组(8ug/kg/d), rLZ-8 中剂量组(16ug/kg/d), rLZ-8 高剂量组(32ug/kg/d)。连续注射14天。2)皮肤创伤大鼠模型:创伤对照组采用等量的生理盐水，治疗组大鼠伤口进行直接给药治疗(将药物直接涂抹于大鼠创伤伤口处，rLZ-8给药浓度为125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg)、外周4点给药治疗(取大鼠伤口外周4点进行给药治疗，rLZ_8给药浓度为 125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg)和灌胃给药,rLZ-8 给药浓度为 125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg,各组均采用独立饲养模式,每天给药I次,持续2周。
[0010]检测项目和方法:1)皮肤衰老模型:主要检测项目为皮肤含水率、皮肤中羟脯氨酸含量、皮肤中透明质酸含量、体内SOD含量、体内MDA含量、体内脂褐素(LF)含量以及HE染色皮肤组织镜下观察病理变化等。其中采用超氧化物歧化酶(SOD)，ELISA检测试剂盒(R&D公司)测定大鼠血浆及皮肤组织中的SOD含量，按照SOD试剂盒说明书方法进行操作；利用ELISA试剂盒(R&D公司)测定大鼠血浆及皮肤组织中的HA含量，按照试剂盒说明书方法进行操作；使用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定皮肤蛋白含量，按照试剂盒说明书方法进行操作；利用羟脯氨酸(Hyp) ELISA试剂盒(R&D公司)测定大鼠血浆及皮肤组织中的Hyp含量；以丙二醛(MDA) ELISA试剂盒(R&D公司)测定大鼠血浆及皮肤组织中的MDA含量。2)皮肤创伤模型:主要检测项目为大鼠表皮生长因子(EGF)、大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、大鼠成纤维细胞生长因子(FGF)生长因子以及肉芽组织的羟普氨酸含量等。其中FGF、EGF、VEGF等项目采用相应的酶联免疫法测定，肉芽组织的羟脯氨酸含量利用羟脯氨酸(Hyp) ELISA试剂盒(R&D公司)测定。
[0011]实验结果统计:本发明主要通过皮肤含水率、皮肤中羟脯氨酸含量、皮肤中透明质酸含量、体内SOD含量、体内MDA含量、体内脂褐素(LF)含量以及HE染色皮肤组织镜下观察病理变化等指标考察rLZ-8大鼠皮肤衰老模型的治疗效果的影响，通过大鼠表皮生长因子(EGF)、大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、大鼠成纤维细胞生长因子(FGF)生长因子以及肉芽组织的羟普氨酸含量的检测考察rLZ-8对大鼠皮肤创伤模型的治疗效果。以上述指标的实验数据为基础采用SPSS统计软件进行数据分析，依据各治疗组间进行分析检验得出统计学结果评价rLZ-8在皮肤修复药物中的应用。 [0012]皮肤衰老方面:rLZ-8可以提高皮肤组织中透明质酸的含量，抑制由于衰老所导致的皮肤组织含水率的降低；rLZ-8可以提高皮肤组织的重要的细胞外基质成分胶原的含量，从而改善皮肤的弹性，降低皮肤组织中脂褐素水平，减缓衰老；rLZ-8可以增强大鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)的水平，减少过氧化脂质代谢产物丙二醛(MDA)的水平，说明rLZ-8可以有效地拮抗D-半乳糖所致皮肤细胞的衰老。
[0013]皮肤创伤方面:三种给药途径都能在同一时间点达到一致的治疗效果，实验结果表明，大鼠创伤后，rLZ-8能够在7天内显著调节大鼠表皮生长因子(EGF)、大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、大鼠成纤维细胞生长因子(FGF)生长因子的表达水平，促进创伤修复，同时稳步提高肉芽组织的羟脯氨酸含量，通过测定羟脯氨酸的含量间接反应胶原的含量，了解创面愈合过程中胶原代谢状况。随着胶原合成的不断增加，缺损组织得以逐渐填补，创面缩小，进而愈合。
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图1 40倍放大下各组大鼠模型皮肤组织HE染色照片对比 图2 200倍放大下各组大鼠模型皮肤组织HE染色照片对比

实施例1 rLZ-8对大鼠皮肤衰老的治疗作用
1.1实验方法
1.1.1实验试剂与材料:
rLZ-8、维生素E、生理盐水、D-半乳糖、蒸馏水、ImL一次性注射器、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA检测试剂盒、丙二醛(MDA) ELISA试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、羟脯氨酸(Hyp) ELISA试剂盒、HA ELISA试剂盒(R&D公司)
1.1.2仪器设备:
分析天平、立式压力蒸汽灭菌器、离心机、双人超净工作台、倒置显微镜、4°C冰箱、低温冰箱(_80°C)、普通酶标仪。
[0015]1.1.3实验动物:
健康成年Wistar大鼠，雌性，体重240-260克，SPF级。在吉林大学SPF级条件下饲养。实验期间控制室温在(20±2) °C，12小时交替照明，小鼠自由饮水、取食。
[0016]1.1.4实验分组与给药程序:78只雌性Wistar大鼠，随机分为6组(n=13):正常对照组、衰老模型组、维生素E阳性对照组、rLZ-8低剂量组、rLZ-8中剂量组、rLZ_8高剂量组；正常对照组每天颈背部皮下注射生理盐水0.lml/10g BW，其余各组每天颈背部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg(相当于注射容量为0.lml/10g Bff)造模，共7周。建立大鼠亚急性衰老模型。给药组同时灌胃给予维生素E或腹腔注射rLZ-8，正常对照组和衰老模型组给予等体积生理盐水。药物剂量如下表所示:
表1皮肤衰老大鼠模型治疗分组与给药程序