专利名称：干扰素－α蛋白作为Fc融合蛋白的表达和运输的制作方法已证明干扰素-α(IFN-α)蛋白家族对多种疾病的治疗具有应用价值。例如，干扰素-α2a和2b(商业名称分别为Roferon和Intron A)已应用于对慢性乙型肝炎，丙型肝炎和丁型肝炎(威胁生命的病毒性肝脏疾病)，尖锐湿疣(生殖器的疣)，爱滋病相关的卡波西肉瘤，毛细胞白血病，恶性黑色素瘤，基底细胞癌，多发性骨髓瘤，肾细胞癌，疱疹I和II，水痘/疱疹带状疱疹，蕈状真菌病。包含干扰素-α的治疗策略对前列腺癌和慢性粒细胞性白血病状况的功效也已有研究。人干扰素-α家族是最大、最复杂的干扰素家族。干扰素-α家族成员有相似的氨基酸序列由此将其定义为一个区别于其他干扰素的组；也就是说，这些蛋白在典型的蛋白序列对比中典型地具有至少35％的氨基酸同一性。SwissProt数据库包含大量的人干扰素-α蛋白，包括替换地命名为干扰素-δ和干扰素-ω的蛋白。这些蛋白典型地与约23个氨基酸的引导序列一起合成，成熟蛋白典型地具有约19kD的分子量。由于这些蛋白非常相似，当由人或其他哺乳动物源获得干扰素-α且大致纯化后，常可得到具有不同生物活性的异种混合物。[Georgiadis等，U.S.Patent No4,732,683]类似地，编码这些蛋白的cDNA具有非常相似的大小和性质，所以可用一套方法对它们进行操作，以达到构建质粒的目的。因此，由哺乳动物源有效地生产和纯化一种干扰素-α的方法是有应用价值的。由于其分子量相对较小，约19kD(Lawn等(1981)NATL.ACAD.SCI.U.S.A.785435)故干扰素-α可由肾脏过滤。但是，过滤时干扰素-α典型地由肾管状细胞吸收且代谢，因此，通常不分泌出来。依照目前的临床实践，成品的干扰素-α是通过肌肉注射来使用的，注射后干扰素-α在血清中的水平即下降，干扰素-α2a的半衰期为5小时，干扰素-α2b的半衰期为2-3小时(PHYSICIANS KESK REFERENCE，50th edition，19962145-2147和2364-2373)。而且，由于它们分子量小，需要重复频繁注射干扰素-α(通常每天注射或每周注射3次)，而且患者体内的干扰素-α水平会有显著的变化。另外，注射剂量大，范围从针对毛细胞白血病的50微克每剂到针对爱滋病相关的卡波西肉瘤的300微克每剂。高水平的循环干扰素可能导致显著的副作用，包括皮肤，神经，免疫，内分泌的毒性，人们认为由于干扰素分子量较小故可以穿过血脑屏障进入中枢神经系统，导致一些神经性的副作用，因此，提高施用干扰素-α的患者体内干扰素的功效和其在血清中的半衰期，同时将副作用降到最低是有应用价值的。鉴于干扰素-α施用剂量高，效率低，半衰期短，难于纯化且有副作用，该领域需要能使这种治疗剂产量增加，药学特性提高的方法。发明概述本发明涉及对制造和使用包含干扰素-α的融合蛋白有用的方法和组合物。更具体地，本发明涉及编码Fc-干扰素-α融合蛋白的核酸，例如DNA或RNA序列，及表达上述核酸以制造所述融合蛋白的方法。该融合蛋白能使具有生物活性的干扰素-α高水平表达。该融合蛋白在施用于哺乳动物，例如人之前，可与药剂学上可接受的载体相结合。在特定的环境下，在配制和/或施用之前，干扰素-α可从融合蛋白上切割下来。或者，编码含干扰素-α融合蛋白的核酸可与药剂学上可接受的载体相结合并施用于哺乳动物。本发明的一个目的在于提供新的促进干扰素-α生产和分泌的核酸序列，例如DNAs或RNAs。更具体的，本发明提供(i)促进干扰素-α有效生产和分泌的核酸序列；(ii)在各种哺乳动物的宿主细胞中快速高效生产和分泌干扰素-α的核酸的构建体；和(iii)生产，分泌和收集重组干扰素-α，或其遗传工程化变异体，包括非天然的，生物合成的或其他人工的干扰素-α蛋白例如经合理设计而产生的蛋白的方法。本发明的其它目的在于提供多核苷酸序列，当其与编码干扰素-α的多核苷酸相融合时编码包含干扰素-α的融合多肽，该融合多肽可由常规试剂和技术纯化。再一个目的是在分泌盒和所编码的干扰素-α蛋白之间插入一个蛋白水解切割位点，使分泌盒可从干扰素-α结构域切割下来，以便干扰素-α得以单独纯化。
由此，一方面本发明提供编码免疫球蛋白Fc区-干扰素-α融合蛋白的核酸分子，例如DNA或RNA分子。核酸分子沿5’到3’的方向顺次地编码信号序列，免疫球蛋白Fc区，和至少一种靶蛋白，且靶蛋白中包含干扰素-α。
在一优选实施例中，免疫球蛋白Fc区包含免疫球蛋白铰链区，且最好包含至少一个免疫球蛋白恒定重链区结构域，例如免疫球蛋白恒定重链2(CH2)结构域，免疫球蛋白恒定重链3(CH3)结构域，依照用于形成Fc区的免疫球蛋白类型，可任选地为免疫球蛋白恒定重链4(CH4)结构域。在一更优选的实施例中，免疫球蛋白Fc区缺失至少一个免疫球蛋白恒定重链1(CH1)结构域。尽管免疫球蛋白Fc区可以基于任意一类免疫球蛋白，例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，但优选基于IgG的免疫球蛋白Fc区。
本发明的核酸可以可操作的方式插入到可复制的表达载体，其后将该表达载体导入感受态的哺乳动物宿主细胞以生产基于干扰素-α的融合蛋白。所合成的基于干扰素-α的融合蛋白可以有效地生产并从哺乳动物宿主细胞中分泌出来。所分泌的基于干扰素-α的融合蛋白可在无需裂解哺乳动物细胞的情况下从培养基中收集。然后，可以分析所得蛋白产物的活性和/或依需求用常规试剂纯化所得蛋白产物，和/或从融合配体上切割蛋白产物，以上均应用常规技术。
另一方面本发明提供包含干扰素-α的融合蛋白。本发明的融合蛋白表现出比天然的干扰素-α改善了的生物学特性，例如溶解性提高，血清中的半衰期延长和与其受体结合率提高了。这些特性可能显著地提高干扰素-α的临床效果。在一优选实施例中，该融合蛋白由N末端到C末端包括免疫球蛋白Fc区和干扰素-α，及其它元件如蛋白水解的切割位点，可选地插入免疫球蛋白Fc区和干扰素-α之间。上述融合蛋白优选地在正常的糖基化位点将Fc区糖基化的细胞中合成，这种情况通常存在于模板抗体。
在另一实施例中，融合蛋白可能包含一第二靶蛋白，例如成熟的全长干扰素-α或其中的生物活性片段。在这种类型的构建体中第一及第二靶蛋白可以是相同的也可以是不同的。第一及第二靶蛋白可以或直接或由多肽接头相互连接在一起。或者，两靶蛋白均直接或通过多肽接头与免疫球蛋白Fc区相连接。在后一种情况中，第一靶蛋白可以连接到免疫球蛋白Fc区的N末端，而第二靶蛋白可以连接到免疫球蛋白Fc区的C末端。
在又一实施例中，两融合蛋白共价地，例如通过二硫键，多肽键或交联剂，或非共价地连接，产生嵌合蛋白。在一优选实施例中，两融合蛋白通过一个或更优选两个由半胱氨酸残基的链间二硫键共价连接，优选定位于排列于每条链上免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白铰链区内。
本发明的再一个目的是提供多价的和多聚体形式的干扰素-α融合蛋白及其组合。
另一方面本发明提供制造包含免疫球蛋白Fc区和靶蛋白的融合蛋白的方法。该方法包括下述步骤(a)提供含带有或不带有信号序列的编码所述融合蛋白的DNA分子的哺乳动物细胞，和(b)培养该哺乳动物细胞生产融合蛋白。其后收集所得的融合蛋白，重折叠，若需要可用本领域技术人员所知的常规纯化技术纯化所得蛋白。若融合蛋白包含插在免疫球蛋白Fc区和靶蛋白之间的蛋白水解酶切割位点，则靶蛋白可以用常规的蛋白水解酶从融合蛋白上切割下来，如需要可在使用前进行纯化。
再一个方面，本发明提供通过对哺乳动物施用使用本发明的方法和/或融合结构来生产有效量的干扰素-α，来治疗由干扰素-α或其活性变体所缓解的状态的方法。本发明还提供治疗由干扰素-α或其活性变体所缓解的状态的方法，该方法通过对具有该状态的哺乳动物施用本发明的核酸，例如“裸DNA”或包含本发明DNA或RNA的载体来进行。
在优选实施例中，本发明的构建体能够用于肝脏紊乱的治疗，其中干扰素-α通过免疫球蛋白Fc区定位于肝脏内。本发明的构建体对于治疗包括但不限于病毒性疾病例如乙肝，丙肝或丁肝，肝癌及定位于肝脏的包含转移瘤的其它类型的癌症的治疗特别有用。
本发明的上述和其它目的，特征和有益之处通过下面的描述，附图和权利要求清楚地说明。
附图简述

图1A-1C是非局限性的几个依照本发明构建的融合蛋白的例子的图解说明。
图2是表明注射了Daudi细胞悬液后用huFc-huIFN-α处理的SCID小鼠组的存活曲线的图表。第0天对小鼠注射Daudi细胞。第3到8天，8只小鼠为一组分别注射PBS(钻石形)，30μg huFc-huIFN-α(叉形)或60μg huFc-huIFN-α(三角)。
图3是表明用huFc-huIFN-α处理的SCID小鼠中的Daudi细胞的皮下肿瘤的生长速度的图表。在处理前约4周，小鼠经皮下注射Daudi细胞。当注射的Daudi细胞长成200-400mm3的肿瘤时，将小鼠每8只为一组分开，分别注射PBS(钻石形)，含30μg huFc-huIFN-α的PBS(方块)或含60μg huFc-huIFN-α的PBS(三角)，处理6天。
发明详述许多病症可以通过施用干扰素-α得以缓解。例如，前面所讨论的干扰素-α2a和2b(商业名称分别为Roferon和Intron A)已应用于对慢性乙型肝炎，丙型肝炎和丁型肝炎(威胁生命的病毒性肝脏疾病)，尖锐湿疣(生殖器的疣)，爱滋病相关的卡波西肉瘤，毛细胞白血病，恶性黑色素瘤，基底细胞癌，多发性骨髓瘤，肾细胞癌，疱疹I和II，水痘/疱疹带状疱疹和蕈状真菌病。而且提高干扰素-α对前列腺癌和慢性粒细胞性白血病的治疗效果也已有相关的研究。
对于肝炎的治疗，例如具有在肝脏中浓缩的干扰素-α的形式可能特别有用。这种方式下，干扰素-α在其它组织中的浓度可以降到最低，从而减小副作用。肝组织是清除可溶性的免疫复合物的主要部位，且肝脏的巨噬细胞(枯否细胞(Kupffer cells))上有很多Fc受体(Benacerraf，B.etal.(1959)J.IMMUNOL.82131 Paul，W.E.(1993)FUNDAMENTALS OFIMMUNOLOGY，3rded.ch.5113-116)。因此，将干扰素-α与免疫球蛋白Fc区融合后，该干扰素-α分子比不带有免疫球蛋白Fc区的相同干扰素-α分子对肝组织有更好的定向性。IgG型的抗体中与Fc受体具有最强亲和力的是IgG1。但相反地，象IgG4对Fcγ受体I的亲和力要低将近10倍。(Anderson and Abraham(1980)J.IMMUNOL.1252735；Woof etal.(1986)MOL.IMMUNOL.23319)。当IgG1的FcγI置于配体的C末端时，可以介导对表达该配体受体的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。而且，当IgG1的FcγI置于配体的C末端时，可以介导直接对表达该配体受体的细胞的C1q结合和补体结合。
相反，IgG1，IgG4不能有效地结合补体。由此有人提出将干扰素-αN末端与IgG4的Fc区C末端相融合(Chang，T.W.et al.，U.S.PatentNo.5,723,125)。但是IgG4的Fc区C末端从Fab区分离出来后，IgG4的Fc与补体结合的同时也与IgG1的Fc区结合(Isenman，D，E.etal.，(1975)J.IMMUNOL.1141726)。根据这一结果以及IgG1和IgG4的Fc区非常相似的事实，不考虑理论上的结合，可以预见由于连接IgG4Fab和Fc区的铰链区比IgG1的铰链区短，所以IgG4的Fab区在空间上阻碍C1q结合和补体结合。如果IgG4的庞大的Fab区被象干扰素-α这样的小分子所替换，干扰素-α与Fc区由灵活的接头连接起来，可以预见，这样的干扰素-α-Fcγ4融合体与带有干扰素-α受体的细胞相结合时可以结合补体。
由于细胞素N末端与Fc区融合而产生的细胞毒性作用是众所周知的。例如白细胞介素-2(IL-2)与Fc区C末端融合而产生的分子能够结合补体，并能引起带有IL-2受体的细胞溶解(Landolfi，N.G.，U.S.PatentNo.3,349,053)。
Fc区置于配体的N末端的融合(称为‘免疫融合’或‘Fc-X’融合，其中X是配体，例如干扰素-α)有许多突出的有益的生物学特性(Lo et al.，U.S.Patent Nos.5,726,044和5,541,087；Lo etal.(1998)PROTENIN ENGINEERING 11495)。具体说来，这种融合蛋白仍可以结合到细胞表面的相关Fc受体上。但是，当配体与细胞表面的受体相结合时，Fc区的方向改变了，介导ADCC和补体结合的序列即被阻隔起来。结果使得Fc-X分子的Fc区不能有效地介导ADCC或补体结合作用。这样Fc-X融合体可望具有延长血液中的半衰期和提高其在肝脏中的相对浓度的作用，而仅有由ADCC和补体结合引起的微小不良效果。
本发明中的Fc-X结构的一个特点是其浓缩了靶蛋白，在这里指肝脏中的干扰素-α。γ1和γ3链的Fc区表现出与Fc配体最强的亲和性，γ4链表现出略低的亲和性，而γ2链与Fc配体的亲和性最低。据此，γ1和γ3链的Fc区特别适用于本发明的Fc-X结构，因为它们与Fc受体具有最高的亲和性，因而可以把干扰素-α优先地导向肝组织。与X-Fc蛋白形成对照，例如扰素-α-Fc蛋白，其在肝脏中浓度上的潜在优势必定是通过该蛋白能介导直接对带有扰素-α受体的细胞的效应物功能，即ADCC和补体结合来平衡的。
由于本发明提供编码包含免疫球蛋白Fc区和至少一种靶蛋白的融合蛋白，这里指干扰素-α，的核酸序列和确定上述融合蛋白的氨基酸序列。图1A-1C描述了三个可仿效的蛋白结构的实施例，由此使本发明具体化。由于优选二聚体结构，因此全部描述为由相邻亚单位中的半胱氨酸之间的一对二硫键相交联的二聚体。在附图中二硫键描述为通过每一条重链中的免疫球蛋白铰链区使两免疫球蛋白重链Fc区连接在一起，而这是这些分子的天然形式的特征。尽管包含Fc铰链区的结构是优选的而且有望作为治疗剂，本发明预见到，根据需要也可以选择在其它位置的交联。而且，在某些条件下，在本发明的实施中有用的二聚体和多聚体可能是由非共价连接产生的，例如通过氢键之间的相互作用。由于同源二聚体结构是本发明的重要实施例，附图中即介绍了这样的结构。可以理解，异源二聚体在本发明的实施中也是有用的。
图1A描述了依照这里所阐述的原理生产的二聚体结构(参见，例如实施例1)。每个同源二聚体的单体包括含铰链区的免疫球蛋白Fc区1，CH2结构域和CH3结构域。通过多肽键直接附加到Fc区C末端的是扰素-α2。应当理解Fc区可以通过多肽接头附加到靶蛋白上(未示出)图1B和图1C描述了本发明的蛋白结构，其中包括靶蛋白和两个以上扰素-α蛋白串联排列并由接头相连接。在图1B中，靶蛋白包括全长的扰素-α2，由甘氨酸和丝氨酸残基4构成的多肽接头，和有活性的扰素-α3变异体。与图1B中的结构不同，图1C中多数C末端蛋白结构域包括第二个全长干扰素-α2拷贝。尽管图1A到1C代表Fc-X结构，其中X是靶蛋白，可以预见对本发明有用的蛋白也可以呈现为X-Fc-X的形式，其中X’s可代表相同或不相同的靶蛋白。
此处所用到的术语“多肽接头”是指将两个在天然状态下非自然相连的两个蛋白连接在一起的多肽序列。多肽接头优选地包含多种氨基酸，例如丙氨酸，甘氨酸和丝氨酸或其他氨基酸的组合。优选地，该多肽接头包括一系列的甘氨酸和丝氨酸肽，长度约为10-15个残基。参见，例如U.S.Patent No.5,258,698。可以预见，最佳的接头长度和氨基酸组成取决于日常的实验情况。
这里所用的术语“多价的”指由两个或多个生物活性片段合并在一起所组成的重组分子。形成多价分子的蛋白片段任选地可以通过多肽接头相连接，该多肽接头将各组分连接在一起并使其各自在功能上相互独立。
这里所用的术语“二价的”指具有Fc-X或X-Fc构型的多价重组分子，其中X使靶分子。免疫球蛋白Fc区可以通过例如链间二硫键相交联，产生如图1所示的结构类型。如果本发明的融合结构具有Fc-X-X的构型，所得的Fc分子如图1C所示。两个靶蛋白可以通过多肽接头相连接。图1A所示的结构类型可以提高靶分子和其受体之间的表面结合亲和力。
这里所用的术语“多聚体的”指或共价地，例如通过共价相互作用如二硫键，或非共价地，例如通过氢键相互作用稳定地相互连接的两个或多个多肽链。术语多聚体既包括其中的亚基相同的同源多聚体，也包括其中的亚基不相同的异源多聚体。
这里所用的术语“二聚体的”指特定的多聚体分子，其中的两个多肽链通过共价地或非共价地相互作用稳定地连接在一起。这样的结构在图1A中由图示方式示出。应当理解，包含至少一部分铰链区的免疫球蛋白Fc区，CH2结构域和CH3结构域典型地形成二聚体。已知许多蛋白配体与作为二聚体其受体相结合。由于二聚体化过程是浓度依赖性的，所以，如果蛋白的配基X天然地二聚体化，Fc-X分子中的X元件将在更大程度上二聚体化。由Fc连接的两个X元件的自然接近可导致二聚体化成为分子内过程，显著地使平衡向着有利于二聚体的方向移动，加强其与受体的结合。
此处所用术语“干扰素-α”不仅指全长的成熟干扰素-α例如人干扰素-α1(SEQ ID NO8)，人干扰素-α2(SEQ ID NO9)，人干扰素-α4(SEQ ID NO10)，人干扰素-α5(SEQ ID NO11)，人干扰素-α6(SEQ ID NO12)，人干扰素-α7(SEQ ID NO13)，人干扰素-α8(SEQ ID NO14)，人干扰素-α10(SEQ ID NO15)，人干扰素-α14(SEQ ID NO16)，人干扰素-α16(SEQ ID NO17)，人干扰素-α17(SEQ ID NO18)，人干扰素-α21(SEQ ID NO19)，人干扰素-δ1(SEQ ID NO20)，II-1(干扰素-ω1)(SEQ ID NO21)；和小鼠干扰素-α1(SEQ ID NO22)，小鼠干扰素-α2(SEQ ID NO23)，小鼠干扰素-α4(SEQ ID NO24)，小鼠干扰素-α5(SEQ ID NO25)，小鼠干扰素-α6(SEQ ID NO26)，小鼠干扰素-α7(SEQ ID NO27)，小鼠干扰素-α8(SEQ ID NO28)，小鼠干扰素-α9(SEQ ID NO29)还包括变异体和其中的生物活性片段。已知的干扰素-α序列可以从GenBank中找到。
术语生物活性片段是指由实施例4中的细胞增生抑制分析确定的具有SEQ ID NO2所示的模板人干扰素-α生物活性的至少50％，优选至少70％，最优选至少90％的任何干扰素-α蛋白片段。术语变异体包括种和等位基因变异体，及其他自然存在或非自然存在的变异体，例如由遗传工程方法产生的，它们与在SEQ ID NO2中公开的成熟人干扰素-α蛋白有至少70％的相似性或60％的同一性，优选至少75％的相似性或65％的同一性，最优选至少80％的相似性或70％的同一性。
为确定备选多肽与参考多肽是否具有所需的相似性或同一性百分比，需要首先将被选氨基酸序列与参考氨基酸序列用Smith和Waterman在J.MOL.BIOL.147195-197(1981)中所描述的动态程序算法，结合如图2中所描述的BLOSUM62替换矩阵(Henikoff和Henikoff(1992)“源于蛋白封闭的氨基酸替换矩阵”PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 8910915-10919)进行对比。对本发明合适的gap插入罚分是-12，合适的gap延伸罚分是-4。应用Smith和Waterman的算法和BLOSUM62矩阵进行对比的计算机程序，例如GCG程序组(Oxford Molecular Group，Oxford，England)，是可商购的且已为本领域的技术人员所广泛使用。
将备选序列与参考序列进行对比后，即可计算相似值的百分比。每一序列的单个氨基酸依照它们彼此之间的相似性继续比较。如果相应于相比较的两个氨基酸在BLOSUM62矩阵中的值为0或负数则配对方式的相似值是0；否则配对方式的相似值是1.0。相对比的氨基酸的配对方式相似值相加的总和为粗相似值。粗相似值被备选的或参考氨基酸中较小的一个的氨基酸数所除使粗相似值正常化。正常化的粗略值是百分相似值。换言之，为计算同一性百分比，每一序列相对比的氨基酸再次继续比较。如果氨基酸是非同一的，配对方式同一值是0；否则配对方式同一值是1.0。同一性对比的氨基酸的的总和为粗同一值，粗同一值被备选的或参考序列中较小的一个的氨基酸数所除使粗同一值正常化。正常化的粗略值是百分同一值。为计算百分相似性和同一性忽略插入和缺失。据此，尽管gap创建罚分用于起始的对比中，但没有应用于这一计算之中。
变异体也可以包括其它具有干扰素-α样活性的干扰素-α突变体蛋白。种和等位基因变异体包括但并不限于人和小鼠干扰素-α序列。人干扰素-α变异体在SEQ ID NOS8-21中示出，小鼠的干扰素-α变异体如SEQ ID NOS22-29所示。
而且干扰素-α序列可以包括全部或部分如SEQ ID NO7所示的共有序列，其中的干扰素-α具有至少50％，优选至少70％，最优选至少90％的如SEQ ID NO2所示的成熟人干扰素-α的生物活性，此由实施例4中的细胞增生抑制分析确定。
这些蛋白具有非常相似的纯化特性和其它生物学特性。具体指，DNA操作，融合蛋白表达，Fc-干扰素-α蛋白的融合蛋白纯化特性极为相似。例如人干扰素-α2a和干扰素-α2b仅存在一个氨基酸不同，而人干扰素-α2a有一个赖氨酸残基，在相同的位点上干扰素-α2b有一个精氨酸残基。人干扰素-α2a和干扰素-α2b具有非常相似的特性，对所有已知目的均可相互替换。
干扰素-α的三维结构已由X射线晶体学研究所揭示出来(Ramaswamy et al.(1986)STRUCTURE 41453)。干扰素-α蛋白的序列非常相似，以至于已确定的结构被视为整个蛋白家族的结构。与干扰素-β相似，干扰素-α的三维结构是在其二聚体界面上有一锌离子的二聚体。但是在溶液中干扰素-α以单体形式存在。据推测，与白细胞介素IL-6和其它蛋白配基相似，干扰素-α在与受体结合时会发生二聚体化。(Radhakrishnan，R.et al.(1996)STRUCTURE 41453；Karpusas，M.etal.(1997)PROC.NAT.ACAD.SCI.USA 9411813)。
配基的二倍体化可以提高配基和其受体的表面结合亲和力。例如如果Fc-干扰素-α融合蛋白的一个干扰素-α元件能以特定的亲和力与细胞上的受体相结合，同一个Fc-干扰素-α融合蛋白的第二个干扰素-α元件可以以更高的亲合性(表面亲和力)结合到同一个细胞的第二个受体上。这是由于在第一个Fc-干扰素-α元件结合上后，第二个Fc-干扰素-α元件与受体自然接近而发生的。当抗体与抗原相结合时，表面亲和力可以提高至少10×1000倍，即104。每一个蛋白亚基，即“X”有其独立的功能，因此在多价分子中蛋白亚基的功能相叠加或相协同。这样正常二聚体Fc分子与干扰素-α的融合可以增强干扰素-α的活性。由此，如图1A所示类型的构建体可以增强干扰素-α和其受体之间的表面结合亲和力。
此处所公开的靶蛋白作为与免疫球蛋白Fc区的融合蛋白表达。已知，每一免疫球蛋白重链恒定区包括四或五个结构域。该结构域如下顺次命名为CH2-铰链区-CH2-CH3(-CH4)。重链结构域的DNA序列在免疫球蛋白类别中有交叉的同源性，例如IgG的CH2结构域与IgA和IgD的CH2结构域，和IgM和IgE的CH3结构域同源。
此处所用到的术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如免疫球蛋白Fc区可能包括1)CH1结构域，CH2结构域和CH3结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或5)两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。在一优选实施例中免疫球蛋白的Fc区包括至少一个免疫球蛋白铰链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，优选缺少CH1结构域。
目前优选的免疫球蛋白类别中其重链恒定区源于IgG(Igγ)(γ亚类1，2，3或4)。人Fcγ-1的核酸和氨基酸序列已在SEQ ID NOS3和4中列出。其它免疫球蛋白类别，IgA(Igα)，IgD(Igδ)，IgE(Igε)和IgM(Igμ)也可以使用。在U.S.Patent Nos.5,541,087，和5,726,044中详细讨论了对合适的免疫球蛋白重链恒定区的选择问题。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白重链恒定区序列以获得特定的结果是在本领域技术人员所掌握的范围之内的。编码免疫球蛋白Fc区DNA构建体的一部分优选至少包括部分铰链区结构域及优选至少包括Fcγ的CH3结构域或IgA，IgD，IgE，或IgM的任意一种的同源区域。
根据本申请，源于非人的种，例如小鼠或大鼠的恒定区基因也可以使用。一般在DNA构建体中作为融合部分的免疫球蛋白Fc区大致可以源于任何哺乳动物种。如果不希望在宿主细胞或动物中地诱导出对Fc区的免疫应答，则该Fc区可用源于与宿主细胞或动物的同种Fc区。例如，当宿主动物或细胞是人时，可用人免疫球蛋白Fc区；同样的当宿主动物或细胞是小鼠时可用鼠免疫球蛋白Fc区。
实施本发明有用的编码人免疫球蛋白Fc区的核酸序列和确定上述蛋白的氨基酸序列列于SEQ ID NOS3和4中。但可以预见完全可能发现对实施本发明有用的其它免疫球蛋白Fc区，例如那些由Genbank和/或EMBL数据库中所公布的核酸序列编码的序列，例如AF045536.1(Macaca fuscicularis)AF045537.1恒河猴(Macaca mulatta)，AB016710野猫(Felix catus)，K00752(Oryctolagus cuniculus)，U03780豚(Sus scrofa)，Z48947单驼峰(Camelus dromedarius)，X62916牛(Bos taurus)，L07789(Mustela vison)，X69797绵羊(Ovis aries)，U17166(Cricetulus migratorius)，X07189(Rattus rattus)，AF57619.1(Trichosurus vulpecula)或AF035195(Monodelphis domestica)，以上公布内容引入此处作为参考。
而且，可以预见在免疫球蛋白重链恒定区的内的氨基酸的替换和缺失可能对实施本发明有用。一个实施例可能包括在CH2区上游引入替代氨基酸从而产生对Fc受体的亲和力降低了的Fc变异体(Cole etal.(1997)J.IMMUNOL.1593613)。本领域的技术人员用已知的分子生物学技术能够制备这样的构建体。
用人Fcγ1作为Fc区序列有几个好处。例如，如果该Fc融合蛋白用于生物制药，Fcγ1结构域可以赋予融合蛋白效应物功能活性。所述效应物功能活性包括生物活性，例如胎盘转移和延长血清中的半衰期。免疫球蛋白Fc区也可用于由抗Fc的酶联免疫吸附测定(ELISA)检测和通过与金黄色葡萄球菌蛋白A(“Protein A”)结合的纯化。在特定的用途中，可能需要缺失源于免疫球蛋白Fc区的特定的效应物功能，例如Fc受体结合和/或补体结合功能。
本发明开发了生成对实施本发明有用的Fc融合蛋白的常规的重组DNA方法学。该Fc融合构建体优选地是在DNA水平产生的，所得的DNAs整合进表达载体，表达，产生本发明的融合蛋白。此处所用到的术语“载体”是指包括能掺入宿主细胞，经重组整合进宿主细胞基因组的核酸序列，或作为附加体自我复制的核酸序列的核酸分子。这样的载体包括线性核酸，质粒，噬菌粒，粘粒，RNA载体，病毒载体之类。非限制性的病毒载体的例子包括反转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒。这里所用的术语“基因表达”或靶蛋白的“表达”是指DNA序列的转录，mRNA转录物的翻译和Fc融合蛋白产物的分泌。
pdCs是有用的表达载体(Lo et al.(1988)PROTEIN ENGINEERING11495，)其中Fc-X基因的转录利用人巨细胞病毒的增强子/启动子和SV40的聚腺苷酸化信号。所用的人巨细胞病毒的增强子和启动子序列是源于Boshart et al(1985)CELL 41521中公开的序列中第-601位到+7位的核苷酸。该载体还包括突变的二氢叶酸还原酶作为选择标记(Simosen和Levinson(1983)PROC.NAT.ACAD.SCI.USA 802495)合适的宿主细胞可用本发明的DNA序列转化或转染，并用于表达和/或分泌靶蛋白。目前在本发明中优选使用的宿主细胞包括无限增殖的杂交瘤细胞，NS/O骨髓瘤细胞，293细胞，中国仓鼠卵巢细胞，HELA细胞和COS细胞。
一个用于在哺乳动物细胞中生产高水平表达的融合蛋白的表达系统是一DNA构建体其由5’到3’方向编码分泌盒，包括信号肽序列和免疫球蛋白Fc区及靶蛋白。已有几种靶蛋白在上述系统中成功地表达，例如IL2，CD26，Tat，Rev，OSF-2，βIG-H3，IgE受体，PSMA，和gp120。这些表达构建体由Lo et al在U.S Patent Nos 5,541,187和5,726,044中公开。
这里所用到的术语“信号序列”是指在宿主细胞中指导干扰素α融合蛋白分泌并在翻译后被切除的片段。本发明的信号序列是多核苷酸，该多核苷酸编码引发蛋白转运穿过内质网膜的氨基酸序列。本发明中有用的信号序列包括抗体的轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillieset.al.(1989)J.IMMUNOL.METH.125191)，抗体的重链信号序列，例如MOPCI41，抗体重链信号序列(Sakano et al.(1980)NATURE 2865774)，和本领域所知的任何其它信号序列。(参见例如Watson(1984)NUCLEIC ACIDS RESEARCH 125145)。
已知本领域中已深入了解的信号序列典型地包含16到30个氨基酸残基，但也可以包含更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽包含三个区碱性的N末端区，中间的疏水区和极性较强的C末端区。中间的疏水区包含4到12个氨基酸残基，其在新生多肽转运过程中将信号肽锚定于脂双层膜。起始后信号肽通常在内质网腔内由被称为信号肽酶的细胞酶切割掉。信号肽的潜在切割位点一般遵循“(-3，-1)规则”。这样典型的信号肽序列在-3和-1位点具有小的中性的氨基酸，并且这一区域缺少脯氨酸残基。信号肽酶可以在-1和+1位氨基酸残基之间切割信号肽。这样在分泌过程中信号肽序列可以从融合蛋白的氨基末端切除。从而使包含免疫球蛋白Fc区和靶蛋白的Fc融合蛋白分泌出来。vonHeijne(1986)NUCLEIC ACIDS RES.144683对有关信号肽序列进行了详细的讨论。
对本领域的技术人员来说显而易见，在分泌盒使用特定的信号肽序列是否适合是需要通过常规的实验来确定的。这样的实验将包括确定指导Fc融合蛋白分泌的信号肽的能力，确定为使Fc融合蛋白有效分泌的序列理想的构型，基因组DNA或cDNA，。另外，本领域的技术人员可以参照上述von Heijne的资料来制造合成的信号肽，并通过常规的实验来检验这样合成的信号肽序列的效率。信号序列也可以指“信号肽”“引导序列”或“引导肽”。
信号序列和免疫球蛋白Fc的融合体在此处有时称为分泌盒。沿5’到3’方向编码免疫球蛋白轻链基因的信号肽序列及人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1区的多核苷酸是在实施本发明中可仿效的有用的分泌盒。人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1区优选地至少包括部分免疫球蛋白铰链区和至少CH3结构域，或更优选地至少包括部分铰链区结构域和CH2及CH3结构域。此处所用的术语“部分”免疫球蛋白铰链区的是指免疫球蛋白铰链区的一部分，其包含至少一个，优选两个能够形成链内二硫键的半胱氨酸残基。编码分泌盒的DNA可以是其基因组构型或其cDNA构型。在特定的条件下，有利于生产源于人免疫球蛋白Fcγ2重链序列的Fc区。尽管基于人免疫球蛋白γ1和γ2序列的Fc融合体在小鼠中起相似的作用，但基于γ2序列的Fc融合体在人体中表现出更强的药物动力学作用。
在另一实施例中，编码蛋白水解切割位点的DNA序列插入在分泌盒和靶蛋白之间。所编码的融合蛋白中提供蛋白水解切割的切割位点将Fc区与靶蛋白分开。此处所用到的术语“蛋白水解切割位点”是指优选地由蛋白水解酶或其他蛋白水解切割物切割的氨基酸序列。有用的蛋白水解切割位点包括可由蛋白酶例如，胰蛋白酶，纤维蛋白溶酶，肠肽酶K所识别的氨基酸序列。许多成对的切割位点/切割物是已知的(参见例如，U.S.Patent No.5,726,044)。
而且这些恒定区构建体的替换和缺失也是有用的，其中所述恒定区结构域的一个或多个氨基酸残基可被替换或缺失。一个实施例中在CH2区的上游引入氨基酸的替换产生了对Fc受体亲和力降低了的Fc变异体(Cole et al.(1997)J.IMMUNOL.1593613)。本领域的技术人员可以用已知的分子生物学技术来制备这样的构建体。
在此处所公开的实施例中生产出了高水平的Fc-干扰素-α。起始克隆可生产50μg/mL的Fc-干扰素-α，其可由蛋白A亲和层析纯化到均质。通过亚克隆通常可将表达水平提高数倍。如上所述，当干扰素-α作为Fc融合分子表达时，可获得高表达水平，估计是由于Fc部分作为载体辅助C末端的多肽正确折叠并高效分泌。而且，Fc区是糖基化的并在生理pH下带有大量电荷，因此Fc区有助于溶解疏水蛋白。
除了表达水平高外，与单独的干扰素-α相比，干扰素-α融合蛋白在血清中还表现出长的半衰期，这部分归因于其较大的分子量。例如Fc-干扰素-α在小鼠中具有19.3小时的循环半衰期(参见实施例6)相比之下，干扰素-α的半衰期只有2-5小时(PHYSICIANS DESKREFERENCE，50thedition，19962156-2147和2364-2373)。干扰素-α分子量约为19kD，小到足以通过肾过滤来有效地清除。相反，由于有两个干扰素-α元件附加到每个Fc分子上Fc-干扰素-α的分子量约为100kD，(即Fc分子为二聚体形式因而有两个干扰素-α，)这样的二聚体结构可对干扰素-α受体表现出高结合亲和力。由于干扰素-α的活性是受体介导的，二价的干扰素-α融合蛋白潜在地较干扰素-α本身更为有效。
另外，已知许多蛋白配体以二聚体的形式结合到其配体上。由于干扰素-α属于具有弱二聚体化常数的蛋白配体类别，通过Fc与干扰素-α结合所形成的生理上约束使得二聚体化成为一个分子内过程，使平衡向二聚体移动进而加强其与受体的结合。半胱氨酸残基也可以通过标准的重组DNA技术引入到单体的适当位置上，通过形成二硫键使二聚体稳定。
本发明的融合蛋白有数项在临床上有益的作用。在Daudi细胞中进行的生物活性检验和细胞病变效果分析(实施例4)的结果表明Fc-干扰素-α的生理活性显著高于干扰素-α的生理活性。
本发明的另一实施例提供了具有多种结构构象的构建体，例如二价或多价的构建体，二聚体和多聚体的构建体或其组合。本发明分子的这些功能性构象使干扰素-α和其它将在动物模型中开发的抗病毒和抗癌蛋白产生协同效应。
本发明的一个重要的方面是各种干扰素-α蛋白的序列和特性以及编码DNA都非常相似。在Fc-X融合蛋白的组分中干扰素-α蛋白的特性和编码DNA本质上是同一的，所以可用常规的技术来生产任何Fc-干扰素-αDNA融合体，表达该融合体，纯化融合蛋白，进而将融合蛋白用于治疗目的。
本发明还提供生产作为Fc融合蛋白的非人种的干扰素-α的方法。因为在施用于人体前蛋白药物的效果和毒性研究必须要在动物模型系统中进行检验，所以非人的干扰素-α蛋白可用于干扰素-α的前临床研究。由于蛋白可能引起免疫应答，和/或表现出不同药物动力学性质，使检测结果发生偏移，所以人蛋白可能在小鼠模型中不起作用。因此，小鼠蛋白等效物是在小鼠模型中进行检测的最好的人蛋白替代物。
本发明提供通过对具有相关病症的哺乳动物施用本发明的DNA，RNA或蛋白以治疗各种癌症，病毒性疾病，及具有相关的病症和病因的其它疾病的方法。相关的病症可能包括，但并不限于乙型肝炎，丙型肝炎和丁型肝炎，生殖器的疣，毛细胞白血病，爱滋病相关的卡波西肉瘤，黑素瘤，前列腺癌和其它形式的病毒性疾病和癌症。鉴于干扰素-α对调节免疫应答具有广泛的用途，本发明还提供治疗可通过施用干扰素-α来缓解的病症的方法。这些方法包括，对具有是或不是与病毒感染或癌症直接相关的病症的哺乳动物，施用有效剂量的本发明的组合物。
本领域的技术人员可以认识到，本发明的蛋白不仅可以用作治疗剂而且可以用于生产有治疗作用的抗体。同样的，适当地施用所述DNA或RNA，例如在载体中或其它作上述用途的运载系统中也包括在使用本发明的方法的范围内。
作为带有免疫球蛋白Fc的融合蛋白，Fc-干扰素-α有非常适宜的组织分布和为达到临床效果稍有不同的作用方式，特别是考虑到其长血清半衰期和可施用的可溶蛋白的高剂量。具体说来，在肝脏中有高水平的Fcγ受体，其是引起乙型和丁型肝炎病毒的侵染位点。考虑到干扰素-α由于分子量小可以穿过血脑屏障，因此可引起神经病学上的副作用。分子量大大增加的Fc-干扰素-α可以显著减少这一蛋白穿越血脑屏障的程度。
本发明的组合物可以通过与特定的分子相容的任意一种途径来使用。可以预见本发明的组合物可以以任意一种合适的方式，直接地(例如局部地，通过注射，移植或对组织位点的局部处理)或系统地(非肠道地或口服地)施用于动物。通过非肠道地方式例如静脉内的，皮下的，眼用的，腹膜内的，肌内的，口腔的，直肠的，阴道的，眼眶内的，大脑内的，颅内的，脊柱内的，心室内的，鞘内的，脑池内的，囊内的，鼻内的，或气雾剂的方式施用本发明的组合物时，该组合物中优选地包括部分含水的，生理上可接受的液体的悬浮液或溶液。这样，该载体或赋形剂是生理上可接受的，因此除了向患者输送所需的组合物外，其不会对患者的电解质和/或容量平衡造成不利的影响。试剂的液体介质可以包括正常的生理盐水。
本发明的DNA构建体(或基因构建体)也可以用作基因治疗方案的一部分来输送编码干扰素-α或其融合蛋白构建体的核酸。本发明的特色是用于体内转染的表达载体和在特定的细胞类型中表达干扰素-α或其融合蛋白构建体，以重组或增补干扰素-α的功能。干扰素-α的表达构建体或其融合蛋白构建体可以用于任何生物学上有效的载体，例如任何在体内可向细胞有效地输送干扰素-α基因或其融合蛋白构建体的制剂或组合物。方式包括将被试基因插入病毒载体或重组的细菌或真核质粒，所述病毒载体包括重组的反转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒和单纯疱疹病毒-1。每次施用编码本发明的融合蛋白的核酸的优选剂量是在1μg/m2到10mg/m2的范围内，更优选20μg/m2到10mg/m2的范围内，最优选在400μg/m2到4mg/m2的范围内。可以预见本领域的技术人员用常规的实验来确定理想的剂量和施用方式是在其能力范围内的。
每次施用编码本发明的融合蛋白的优选剂量是在0.1mg/m2到100mg/m2的范围内，更优选1mg/m2到20mg/m2的范围内，最优选在2mg/m2到6mg/m2的范围内。可以预见理想的剂量也依赖于所治疗的疾病和所存在的副作用。但可以通过常规的实验来确定理想的剂量。使用该融合蛋白可以通过定期造影剂团注射，或通过从外部的贮存库(例如静脉袋)或内源(例如，从具有生物腐蚀能力的植入物中)连续在静脉内或腹膜内施用。而且可以预见本发明的融合蛋白也可以与多数具有不同生物功能的分子一起，施用于相关的受体。可以预见本领域的技术人员用常规的实验来确定融合蛋白和其它分子理想的结合，施用的方式和剂量是在其能力范围内的。
通过下述实施例对本发明作进一步的描述，但这些实施例不应理解为对本发明的限制。
实施例实施例1.人Fc-人干扰素-α(huFc-IFN-α)的表达从人外周血单核细胞制备mRNA，然后用反转录酶反转录。所得的cDNA用作多聚酶链式反应(PCR)的模板以克隆并使人干扰素-αcDNA使其适宜作为人Fc-人干扰素-α(huFc-IFN-α)融合蛋白表达。正向引物是5’C CCG GGT AAA TGT GAT CTG CCT CAG AC(SEQID NO5)其中序列C CCG GG(XmaI酶切位点)TAAA编码免疫球蛋白重链的羧基端，接下来的序列(黑体)编码干扰素-α的N末端。反向引物是5’CTC GAG TCA ATC CTT CCT CCT TAA TC(SEQ IDNO6)编码干扰素α的羧基末端序列及其翻译终止密码子(反密码子，TCA)，接下来是一个XhoI位点(CTC GAG)克隆了一个包含517个碱基对的PCR产物并进行了测序。序列分析结果确证了该PCR产物编码人干扰素α适于表达，即在5’末端带有XmaI酶切位点在3’末端带有XhoI酶切位点。
表达载体pdCs-huFc-IFN-α是按下述方式构建的。包含人干扰素αcDNA片段的XmaI和XhoI酶切片段依照Lo et al.(1998)ProteinEngineering 11495中的介绍连接到pdCs-huFc载体的XmaI和XhoI酶切片段上。huFc是人免疫球蛋白γ1的人Fc片段。所得的载体pdCs-huFc-IFN-α用于转染哺乳动物细胞以表达huFc-IFN-α。
实施例2.蛋白的转染和表达通过质粒DNA与磷酸钙共沉淀(Sambrook etal.eds.(1989)”MOLECULAR CLONING-A LABORATORYMANUAL，”Cold Spring Harbor Press，NY)或依制造商的说明用Lipofectamine Plus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)进行脂质转染，以瞬间转染的方式将质粒pdCs-huFc-IFN-α引入人肾293细胞。
为了获得稳定的转染克隆，通过电转化将质粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/O细胞。简言之，NS/O细胞在经修饰的添加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Dulbecco氏Eagle’s培养基中生长。用磷酸盐缓冲液(PBS)将约5×106的细胞洗一次，然后悬浮于0.5mL的PBS中。在基因脉冲比色杯(0.4cm电极间隔，BioRad)中将10μg线性化的质粒DNA与上述细胞一起在冰上保温10分钟。用设定在0.25V和500μF的基因脉冲仪(BioRad，Hercules，CA)进行电穿孔。然后让细胞在冰上复苏10分钟，接下来将其悬浮于生长培养基中，置于两个96孔细胞培养板中。稳定的转染克隆选自在100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下能够生长的克隆，氨甲蝶呤是在转染后两天加入的。每隔3天喂细胞2到3次或更多次，抗氨甲蝶呤(MTX)克隆在2到3周内出现。用抗-Fc ELISA分析克隆的上清液(参见实施例3)以鉴定高产克隆。分离高产克隆并使其在含有100nM氨甲蝶呤(MTX)的生长培养基中繁殖。
用凝胶电泳进行常规的定性，Fc融合蛋白在条件培养基中与蛋白A琼脂糖凝胶相结合(repligen，Cambridge，MA)然后通过含有或不含有2-巯基乙醇的标准蛋白样品缓冲液中煮沸，将融合蛋白从蛋白A琼脂糖凝胶上洗脱下来。在SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳后，经考马斯蓝染色可见蛋白带。由SDS-PAGE结果可知，huFc-huIFN-α的表观分子量约为52Kd。
为了纯化，用磷酸盐缓冲液(100mM NaH2PO4，pH3，和150mMNaCl)洗脱结合在蛋白A琼脂糖凝胶上的融合蛋白。洗脱液立即用0.1倍体积的2M Tris-盐酸盐pH8中和。
实施例3.ELISA操作用抗-huFcELISA对抗MTX克隆和其它样品上清液中人的含Fc片段的蛋白产物的浓度进行了鉴定。其步骤详细描述如下A.包被滴定板用含5μg/mL亲和纯化的羊抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)的PBS包被ELISA滴定板，在96孔板(Nunc-Immuno plate Maxisorp)上每孔加入100μL上述包被液。封闭经包被的滴定板在4℃下温育过夜。然后用含0.05％Tween(Tween20)的PBS洗板4次，再用200μL含1％BSA/1％羊血清的PBS封闭。用封闭缓冲液在37℃下温育2小时后，再用含0.05％Tween的PBS洗板4次后在纸巾上轻轻拍打使板干燥。
B.供试样品与第二抗体的温育供试样品用样品缓冲液(含1％BSA/1％羊血清/0.05％Tween的PBS)适当稀释。用浓度已知的嵌合抗体(带有人Fc)制备标准曲线。为制备标准曲线，需在样品缓冲液中进行一系列的稀释使标准曲线的范围在125ng/mL到3.9ng/mL。将稀释的供试样品和标准样品以100μL/孔的量加到滴定板后，将滴定板在37℃下温育2小时。温育后用含0.05％Tween的PBS洗板8次。在每一孔中添加100μL第二抗体，与辣根过氧化物酶相连接的抗人IgG(Jackson Immuno Research)，在样品缓冲液中以约1∶120,000的比例稀释。需对每一份与辣根过氧化物酶相连接的抗人IgG进行测定来确定第二抗体的精确稀释度。将滴定板在37℃下温育2小时，其后用含0.05％Tween的PBS洗板8次。
C.显色向滴定板中每孔添加100μL底物溶液。通过在含新添加了0.03％过氧化氢的15mL 0.025M的柠檬酸/0.05M Na2HPO4缓冲液，pH 5，中溶解30mgOPD(邻苯二胺二氢氯化物)(一片)来制备底物溶液。室温下在暗处显色30分钟。显色时间依所包被滴定板批次，第二抗体等因素的不同而变化。每孔添加100μL 4N硫酸终止反应。用滴定板读数仪读数，读数仪的程序设定在490nm和650nm，从490nm下的OD值中除去650nm下的OD值以消除背景。
实施例4.生物分析huFc-huIFN-α与其中的人干扰素α((hu-IFN-α)人白细胞干扰素，Sigma，St.Louis，MO)的生物活性用两种不同的方法进行了比较。第一种分析确证了Daudi人成淋巴细胞瘤疹B细胞系(ATCC CCL 213)增殖的抑制作用。第二种分析测定了人肺癌A549细胞系(ATCC CCL185)上的脑心肌炎病毒(EMCV)的细胞病变效果的抑制作用。
干扰素-α抑制Daudi(人伯基特淋巴瘤)细胞。Daudi细胞用无血清的RPMI1640洗两次，悬浮于包含RPMI1640和20％热灭活(56℃)胎牛血清的生长培养基中。细胞以1×105cells/mL/孔涂于存在不同浓度的αIFH(2.1×106国际单位/mg)和huFc-huIFN-α的24孔滴定板上。3到4天后，可以发现以huFc-huIFN-α形式存在的50pg/mL IFN-α与750pg/mL的huIFN-α等效地对Daudi细胞具有50-100％的抑制作用。以100ng/mL的IFN-γ(Pharmingen，San Diego，CA)作为对照，其在该分析中不表现活性。这说明上述抑制是干扰素-α特异性的。
实施例5.抗病毒活性的测定在细胞培养过程中病毒的复制常常造成细胞毒性，一种已知的致细胞病变效应(CPE)，干扰素能诱导细胞培养物的抗病毒状态，使细胞不受CPE的影响。抗病毒活性的IFN-α可通过如由M.Clemens，A.G.orris和A.J.H.Gearing，I.R.L.编写，牛津出版社1987出版的“淋巴因子和干扰素实用方法”中所描述的致细胞病变效应还原作用CPER分析来定量。用人肺癌细胞系A549(ATCC CCL 185)和脑心肌炎病毒(ATCC VR 129B)依照上述参考文献中描述的CPER方法来比较了huFc-huIFN-α和huIFN-α的抗病毒活性。提供50％CPER(即50％的保护)的有效剂量为570pg/mL的huFc-huIFN-α(基于干扰素α的量)和570pg/mL的huIFN-α。据此huFc-huIFN-α和huIFN-α基本上具有等效的抗病毒活性。
实施例6.药物动力学以4只Balb/c小鼠为一组对huFc-huIFN-α的药物动力学进行了鉴定。将25mg的huFc-huIFN-α注射到每只小鼠的尾静脉。在注射后立即(即t＝0时刻)，和在注射后0.5，1，2，4，8和24小时通过眶后放血来采血。血样收集在含肝素的管子里以防凝血。在Eppendorf高速微量离心机中离心4分钟去除细胞。用抗-huFc抗体通过抗-huFc ELISA和Western blot测定血浆中huFc-huIFN-α的浓度，结果同时显示huFc-huIFN-α完整地存在于循环中(huFc-huIFN-α的52kD带)。未检测到降解产物(huFc的32kD带)。据测定huFc-huIFN-α的循环半衰期为19.3小时，这显著长于已报道的人IFN-α2到5小时的循环半衰期(PHYSICIANS DESK REFERENCE，50thedition，19962145-2147和2364-2373)。
实施例7.在SCID小鼠中对人伯基特淋巴瘤的弥散性生长的治疗Daudi细胞(人伯基特淋巴瘤)作为弥散性的肿瘤在C.B-17SCID(严重的结合免疫缺陷)小鼠中生长(Ghetie et al.(1990)INT.J.CANCER45481)。在一份0.2mLPBSB单细胞悬浮液中约5×106的Daudi细胞以静脉内的方式注射6到8周大的SCID小鼠。三天后，将这些小鼠以8只为一组，随机地分成三组，每天接受腹膜内注射0.2mL的PBS，含30μg huFc-huIFN-α(包含约12μg的干扰素α)或含60μghuFc-huIFN-α的PBS。每天监测小鼠。所得结果列于图2中。
在Daudi细胞注射28天后，在作为对照的PBS组(钻石形)发展为后腿瘫痪。在这一PBS对照组中的小鼠在第38天时开始表现垂死状态到第61天全部死亡。相比之下，在治疗组中的小鼠存活的时间要长得多，且是以剂量依赖的方式。在接受了30μg huFc-huIFN-α(十叉)的组中，第一只小鼠死亡出现在第70天，在第134天所有的小鼠才都死亡。在接受了60μg huFc-huIFN-α(三角)的组中，直到第126天才有一只小鼠死亡，另有四只在第153天死亡，其余的小鼠呈病态被处以安乐死。
实施例8.在SCID小鼠中对人伯基特淋巴瘤的定位性生长的治疗在这一模型中，Daudi细胞(人伯基特淋巴瘤)作为皮下肿瘤在C.B-17SCID小鼠中生长(Ghetie et al.(1990)INT.J.CANCER45481)。在一份0.1mLPBS单细胞悬浮液中的约6×106的Daudi细胞通过皮下注射于6到8周大的SCID小鼠。当肿瘤长到200-400mm3时开始实施治疗，这大约需要4周时间。将这些小鼠以8只为一组随机地分成三组，每天接受腹膜内注射0.2mL的PBS，含30μg huFc-huIFN-α(包含约12μg的干扰素α)或含60μg huFc-huIFN-α的PBS。所得结果列于图3中。每周测量两次肿瘤的大小。
在对照组的小鼠中，第35天肿瘤已迅速生长到平均体积为5602mm3(4343-6566mm3)，此后该组中所有的小鼠均被处以安乐死。相比之下，在治疗组中的小鼠的肿瘤以剂量依赖的方式受到抑制。在第35天时，接受了30μg huFc-huIFN-α和60μg huFc-huIFN-α的小鼠的肿瘤的平均体积分别为214和170mm3，小于治疗前的268和267mm3。事实上，8只接受了30μg huFc-huIFN-α小鼠中的5只和8只接受了60μghuFc-huIFN-α小鼠中的4只的皮下肿瘤已经完全萎缩了。在没有进一步治疗的情况下，一些肿瘤出现复苏并生长。但是，在本实验结束时，即直到第205天仍有两只小鼠保持没有肿瘤。
实施例9.用Fc-IFN-α治疗肝脏疾病可以预见Fc-IFN-α比IFN-α或IFN-α-Fc对治疗肝脏疾病例如，肝炎或肝脏转移瘤更为有效。
例如可以预见Fc-IFN-α对治疗肿瘤细胞转移到肝脏的小鼠模型有效。在手术前约5分钟通过腹膜内注射0.2mL含80mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪的PBS使小鼠麻醉。接下来进行的步骤通过层流覆盖以保证无菌状态。用聚维酮碘和乙醇清洗每一只小鼠的皮肤。用27号针在脾脏囊下向肿瘤细胞，例如Daudi细胞，在约一分钟的时间里，注射100μl无添加物的RPMI1640培养基。两分钟后脾蒂与4.0丝缝相连接，脾脏被清除了。
有些细胞从注射位点运送到肝脏，在那里它们可以形成转移瘤。用Fc-IFN-α治疗带有转移的肝脏肿瘤的小鼠。可以预见相对于IFN-α或IFN-α-Fc融合蛋白，用等摩尔量的Fc-IFN-α治疗的小鼠肿瘤生长明显降低。
而且，可以预见Fc-IFN-α对治疗肝脏疾病的特异效果比治疗定位于其它组织的疾病的效果更加显著，在其他组织中Fc-IFN-α不集中。
等价物在不背离本发明的精神或其中的基本特征的情况下，本发明可以包括其它特定的形式。因此以上实施例在各个方面仅仅是对本发明的阐述而非对本发明的限制。本发明的保护范围由所提交的权利要求所界定，而非通过上述描述限定，在不超出本发明权利要求的意义和范围的所有改变均视为已包括在此。
引入参考文献上文所公开的每一篇科学文章和专利文献均在此引入作为参考。
序列表<110>劳健明(Lo，Kin-Ming)孙亚萍(Sun，Yaping)S.D.吉利斯(Gillies，Stephen D.)利思进药品公司(Lexigen Pharmaceuticals Corp.)<120>干扰素-α蛋白作为Fc融合蛋白的表达和运输<130>LEX-009 PC<140><141><150>US 60/134,895<151>1999-05-19<160>29<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>498<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(498)<223>人IFNαDNA序列<400>1tgt gat ctg cct cag acc cac agc ctg ggt aat agg agg gcc ttg ata 48Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1 5 10 15ctc ctg gca caa atg gga aga atc tct cct ttc tcc tgc ctg aag gac 96Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30aga cat gac ttt gga ttc ccc cag gag gag ttt gat ggc aac cag ttc 144Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45cag aag gct caa gcc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag acc 192Gln Lys Ala Gln Ala Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct act tgg gaa cag agc 240Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser65 70 75 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