专利名称：金属硫蛋白的制备方法
本发明的目的是研究一种操作简单，成本较低，产率高，纯度高，蛋白兼容性好的金属硫蛋白的制备方法。本发明首先用蛋白质工程方法表达金属硫蛋白或其突变体基因，该方法本领域技术人员均能用现有技术实现。将上述产物的工程菌接种于2YT(含100μg/ml氨苄青霉素)培养液，常规温度35～38℃下快速振荡培养7～16小时，再用新鲜2YT按1∶90～100比例稀释后，继续在常规温度下扩大培养3～4小时，当A600＝0.6-1.0时，加入异丙基β-硫代半乳糖甙(ITPG)至终浓度0.001～1.0mM时，加入金属离子，如Cd2+，Zn2+等，至其浓度是0.1～5.0mM时，继续培养3～6小时，离心收集菌体。上述菌体超声波破菌，离心后，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态亲和吸附，吸附效果用谷胱甘肽硫转移酶(GST)反应来检测，用磷酸缓冲溶液(PBS)淋洗至UV A280的吸收小于0.02时，用缓冲溶液洗去磷酸盐；再用凝血酶酶切缓冲液淋洗，室温下静置酶切，酶切时加入金属离子如Cd2+，Zn2+等，至其浓度为0.1～1.0mM。酶切后经柱层析脱盐，离子交换柱层析柱吸附，盐梯度洗脱等步骤纯化，即可获得目标蛋白。本发明的表达载体可以是pGEX-4T-2等质粒；工程菌可以是大肠杆菌，如缺失部分蛋白水解酶的大肠杆菌BL21等；用GST的酶反应监测破菌效率和柱结合效率。本发明常规培养，再经稀释后继续扩大培养的温度是30～35℃。本发明中酶切时加入的金属离子是两价金属离子如Cd2+，Zn2+等。本发明用凝血酶酶切缓冲液淋洗吸附有GST-MT的树脂，然后加入凝血酶酶切缓冲液和适量的凝血酶，在室温下，如15～25℃下静置酶切7～16小时。最后经脱盐，盐梯度洗脱等纯化步骤即可获纯度高达95％以上的目标蛋白。
本发明用蛋白质工程方法表达金属硫蛋白，亲和柱静态吸附、凝血酶静态酶切方法分离、纯化表达产物，在表达、纯化过程中通过加入金属离子，大大提高了制备效率和产品纯度，成本低，制备蛋白的兼容性好，为高效制备金属硫蛋白提供了有广阔应用应用前景的方法。

用缺失部分蛋白水解酶的大肠杆菌BL21作为发酵工程菌。
在金属硫蛋白及其突变体基因上，用PCR方法接入BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)两个内切酶位点，然后将其组装在pGEX-4T-2质粒上，构建成表达质粒。
将表达质粒转入BL21中，小规模培养后，与甘油溶液(65％(V/V)甘油，0.1M MgSO4，25mMTris-HCl，pH 8.0)1∶1混合均匀，制成甘油菌，-70℃长期保存。发酵前，将含表达质粒的BL21从-70℃取出，接入新鲜2YT(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃快速振荡(270-330rpm)培养7-16小时，按1∶100转接后，30～35℃继续扩大培养至A600＝0.6-1.0，加入IPTG至终浓度0.01-1.0mM，继续培养，然后加入金属离子如Cd2+至终浓度为0.1-5.0mM，继续培养3-6小时，4℃离心收集菌体。
菌体沉淀重悬于1×PBS(含10mM巯基乙醇)中，加溶菌酶(1.5mg/g湿菌体)消化约1小时后，超声波破菌，随后高速离心，用CDNB(1-chloro-2，4-dinitrobenzene)作底物的GST的酶反应，监测破菌效率，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态亲和吸附，GST的酶反应监测结合效率，用1×PBS溶液淋洗至UV A280吸收小于0.02，用Tris-HCl缓冲溶液淋洗，再用加有Cd2+的酶切缓冲液淋洗吸附有GST-MT的树脂，然后加入2倍柱体积的凝血酶酶切缓冲液和适量的凝血酶，静置酶切(25℃，10小时)，得含少量凝血酶和目标蛋白的流出液，再经Sephadex G-25柱层析脱盐，经过DEAE-Cellulose DE52离子交换层析柱吸附，用0-1.0M NaCl的缓冲溶液线性盐梯度洗脱，收集含目标蛋白的洗脱液，浓缩，脱盐后，得到纯度达95％以上的目标蛋白。
根据上述事例，制备了猴MT1野生型重组蛋白。
产品经12％SDS-PAGE电泳，呈现单一条带，分子量经ESI-MS测定为6284.07 Dalton(计算值为6285.27 Da)。其UV、CD光谱与生物体中获得的野生型蛋白的完全相同。
根据本发明，我们制备了猴MT1的六个突变体蛋白。产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。


本发明是一种用蛋白质工程技术高效制备金属硫蛋白的方法。现有技术一直难以得到比较高的产率,虽然融合蛋白表达技术为金属硫蛋白的表达提供了新方法,但是仍存在产率低这个不足之处。本发明用基因工程方法构建金属硫蛋白或其突变体基因的表达质粒,转入大肠杆菌工程菌中培养发酵,诱导后加入金属离子,继续培养,收集菌体。菌体超声破菌、离心后用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析柱静态吸附,柱上凝血酶酶切,再经柱层析脱盐,盐梯度洗脱,收集目标蛋白。本发明方法可得纯度达95%以上的目标蛋白。用本发明方法制备的猴金属硫蛋白I的六个突变体蛋白,产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。