专利名称：高亲和力瘦蛋白和瘦蛋白拮抗剂的制作方法认为肥胖症是很多癌症的风险。在肥胖人中血清瘦蛋白水平通常升高。瘦蛋白在很多组织中作为有丝分裂剂起作用；因此，其可发挥作用以促进癌症细胞生长。事实上，在体外已显示瘦蛋白对前列腺癌细胞起生长因子的作用，诱导增加前列腺癌细胞的迁移和生长因子的表达，所述生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β I(TGF-β I)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，并且促进前列腺癌生长(Somasundar等，2004 ；Frankenberry 等，2004)。瘦蛋白除在调节食物摄取及脑能量消耗中起重要作用外，还在正常及瘤性乳腺癌细胞中起潜在的生长刺激剂的作用。最近在体外亦显示其诱导卵巢癌细胞的细胞增殖(Choi 等，2004)。最近业已显示瘦蛋白促进T辅助I (Thl)-细胞分化，并在若干动物疾病模型中调节自身免疫反应的开始和进展(La Cava和Matarese, 2004)。若在Thl-介导的自身免疫病或炎性疾病(例如炎性肠综合征)中瘦蛋白的作用是基本的，则可预期通过阻断外周瘦蛋白作用来起治疗作用(Matarese等，2005)。亦业已显示瘦蛋白参与类风湿性关节炎的发病机理和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发展，EAE为多发性硬化症的小鼠模型(Peelman 等，2005)。因此，瘦蛋白和瘦蛋白拮抗剂二者都具有治疗潜在性。过去已放弃将瘦蛋白作为治疗肥胖症的潜在药物，但最近报导其与糊精类似物(Turek等，2010)或化学蛋白伴侣(Ozcan等2009)联合有效。同样业已显示瘦蛋白联合胰岛素导致I型糖尿病小鼠好转(Wang 等 2010)。国际申请PCT/IL2005/001250 (通过引用以其整体如同本文所全部公开一样并入本文)公开了合成的瘦蛋白拮抗剂，其中对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的疏水结合位点的序列LDFI的至少两个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，以致该位点的疏水性变弱。瘦蛋白拮抗剂可用于治疗例如以下疾病代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症、自发性炎性疾病和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎。为了促进以低剂量有效治疗，有增加这些瘦蛋白拮抗剂和激动剂与其靶受体的亲和力的尚未满足的需要。发明简述我们现在业已发现，根据本发明，将某些突变引入如WO 2006/056987所公开的哺乳动物天然瘦蛋白或瘦蛋白拮抗剂，提高瘦蛋白或瘦蛋白拮抗剂与瘦蛋白受体的结合亲和力。因此，在一方面，本发明涉及由以下组成的合成的瘦蛋白拮抗剂对如WO2006/056987所公开的经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽进行进一步修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，所述进一步修饰如下进行用不带负电荷的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白的23位位置的天冬氨酸(D23)，或用疏水的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白12位位置的苏氨酸(T12);所述经进一步修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的片段，其中所述片段本身为瘦蛋白拮抗剂；或所述经进一步修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。在某些实施方案中，用亮氨酸取代D23，具体而言，合成瘦蛋白拮抗剂由SEQ IDNO: I所示的氨基酸序列组成。在另一方面，本发明涉及合成的瘦蛋白激动剂，其包含以下经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12 ;所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白激动剂；或经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。在又一方面，本发明提供编码所述瘦蛋白拮抗剂或激动剂的分离的DNA分子。在再一方面，本发明提供药物组合物，其包含所述合成的瘦蛋白拮抗剂或激动剂或其片段和药学上可接受载体。可将包含拮抗剂的药物组合物用于治疗其中涉及过量瘦蛋白或瘦蛋白信号转导的病况，所述病况例如代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症或自发炎症和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎，同时可将包含激动剂的药物组合物用于治疗其中涉及异常瘦蛋白信号转导或促进血管生成的疾病或病况，所述疾病或病况选自肥胖症、食欲过盛相关综合征、I型糖尿病、代谢 综合征和动脉粥样硬化。在又一方面，本发明提供转基因小鼠，其基因组包含这样的基因，其包含编码本发明合成瘦蛋白拮抗剂或具有D23和T12的合成瘦蛋白拮抗剂的DNA分子，所述DNA分子与诱导型启动子可操作地连接。本发明转基因小鼠优选表现出胰岛素抗性和增加的血液胰岛素和血糖水平，因此可用于筛选对选自高血糖、高血脂2型糖尿病和胰岛素抗性的疾病或病况具有治疗活性的物质的方法，所述方法包括以下步骤(I)将测试物质给予转基因小鼠；(2)确定在转基因小鼠中所述疾病或病况或所述疾病或病况的症状是否受到抑制；和(3)当转基因小鼠中的所述疾病或病况或所述疾病或病况的症状受到抑制时，选出测试物质作为对所述疾病或病况具有治疗活性的物质。附图简述 图I描述在酵母细胞中表达瘦蛋白的质粒的示意性结构。Aga2代表Aga2蛋白；HA代表血凝素。图2A-C显示小鼠瘦蛋白的酵母表面展示的流式细胞术分析。用缀合有FITC的山羊抗-小鼠抗体和小鼠单克隆抗体9elO(A)检测c-myc表位标签，用生物素化的可溶人瘦蛋白受体(hLBD)和链霉亲和素-藻红蛋白(SA - PE)缀合物(B)检测表达的瘦蛋白，可用FACSARIA流式细胞术系统同时检测两个标记(C)。图3A-B显示来自分选实验之一的代表性图。图3A显示与非标记的hLBD竞争之前的文库，图3B为竞争后的文库。收集未被竞争掉(competed-off)的酵母细胞用于两个另外的生长和选择循环。FLl-H和FL2-H指在流式细胞术实验中使用的2次发射滤光器(激发 488nm)。图4A-B描绘在第3轮筛选后的13个酵母克隆中对可溶性人瘦蛋白受体(hLBD)亲和力的测定。MFI，平均荧光强度；ml印wt，小鼠野生型瘦蛋白。图5A-C显示在D23处突变的小鼠瘦蛋白拮抗剂(MLA)的8个变体的SDS-PAGE，其在存在⑴或不存在(_) 巯基乙醇时在15%凝胶中泳动。WT小鼠瘦蛋白(ml印wt)泳动作为对照。分子量标记大小(从顶部到底部，kDa)为250、150、100、75、50、37、25、20、15 和 10。 图6A-H描绘在D23处突变的8个MLA变体的凝胶过滤分析，其在Superdex 75柱上在TN缓冲液，pH 8中以O. 8 ml/分钟进行。图7A-D显示小鼠瘦蛋白拮抗剂(MLA)和强效(superactive) MLA(SMLA) (A, C)及聚乙二醇(PEG)-MLA和PEG-SMLA (B, D)的生物活性(A，B)和结合特性(C，D)的比较。FI，荧光强度。图8A-B显示在用小鼠OBRb稳定转染的CHO细胞中比较SMLA和MLA抑制STAT3磷酸化的蛋白质印迹(A)。(B) (A)中由柱状图代表的条带的定量。FI，荧光强度；D23L，SMLA. P-STAT，磷酸化的 STAT ； t-STAT，总 STAT。图9A-B显示⑷在β -巯基乙醇存在(+)或不存在(_)时于12%凝胶中泳动的PEG-SMLA 的 SDS-PAGE (分子量标记(从顶部到底部，kDa)为:150、100、75、50、37、25 和20)，和(B)在Superdex 200柱上于TN缓冲液，pH 8中以O. 7 ml/分钟进行的PEG-SMLA凝胶过滤分析。图10显示PEG-MLA和PEG-SMLA (标记为superANT)对小鼠增重的影响的比较。两种物质都每日一次以6. 25 mg/kg注射。20天后停止注射，对小鼠重量再检查10天。图11显示PEG-MLA和PEG-SMLA在剂量-反应实验中对小鼠增重的影响的比较。两种物质都每日一次以20、6. 7、2. 2和O. 72 mg/kg注射17天的时间。结果为平均值土SEM, η = 8。图12A-D 显示 HLA、SHLA, SMLA, PEG-HLA 和 PEG-SHLA 的生物活性(Α, B)和结合特性(C，D)的比较。FI，荧光强度。图13Α-Β显示PEG-SMLA和PEG-SHLA对雌性小鼠增重影响的比较⑷。两种物质都从O时开始(箭头)每日一次以6. 25 mg/kg注射17天。在⑶中我们看到食物和水摄取的平均值比较。在带*标记的所有点两种治疗都显著(p〈0.05)不同于溶媒，但它们之间无显著差异。结果为平均值土 SEM，η = 8。PEG-SMLA, PEG-强效(super)小鼠瘦蛋白拮抗剂；PEG-SHLA，PEG-强效人瘦蛋白拮抗剂。图14描述小鼠瘦蛋白中结合位点II的分子模型。影响与CRH2结合的结合位点II中的残基为黄色。既影响与瘦蛋白受体的CRH2亚-结构域结合又影响瘦蛋白受体激活的结合位点II中的残基为橙色，D23为绿色。T12残基是结合结构域II的部分。来自Iserentant 等(2005)。图15A-B显示强效瘦蛋白拮抗剂通过抑制浸润单核细胞来诱导防护免于发生先天炎症。将PEG-SMLA (20mg/kg)或PEG-瘦蛋白(PEG-L印；0. 4mg/kg)腹膜内给予雌性C57bl小鼠4天。此后接着是诱导肝炎，这通过激活先天免疫反应来诱导，所述激活经由在O时给予脂多糖(LPS ；10ug/kg)和D-半乳糖胺(DgalN ；600mg/kg)进行。稳态,在给予LPS和DgalN前时间段的细胞群；1. 5小时LPA/D-GalN，在给予LPS和DgalN后I. 5小时时间段的细胞群；在门(gate) P4和门P5分别描绘肝炎⑶45+⑶1化+^1144/80+浸润和驻留巨噬细胞群的群体KDllb和F4/80为巨噬细胞标记。发明详述 WO 2006/056987教导，用其它氨基酸取代野生型人或非-人哺乳动物瘦蛋白序列的39-42位的LDFI疏水结合位点的至少两个氨基酸，致使该位点疏水性减弱，使野生型瘦蛋白激动剂转化为瘦蛋白拮抗剂。所述拮抗剂对瘦蛋白受体具有与原始激动剂相同的亲和力。为通过利用对瘦蛋白受体具有与野生型激素相同亲和力的瘦蛋白拮抗剂在体内有效抑制瘦蛋白作用，需要10-100倍过量的拮抗剂。有两种方法来降低该高比率(I)通过聚乙二醇化延长拮抗剂的半衰期；和(2)提高拮抗剂对瘦蛋白受体的亲和力，并随后联合这两种方法。在本申请中实施了后一方法。·在本发明工作中，我们使用了 PCR易错随机诱变瘦蛋白(激动剂)基因，接着用酵母表面展示方法选择和鉴定高亲和力瘦蛋白突变体，随后制备作为大肠杆菌{Escherichia, coif)中的重组蛋白的高亲和力突变体。筛选鉴定了具有单个突变的高亲和力突变蛋白和具有多个突变的突变蛋白。具有增加亲和力且具有很少突变的突变蛋白比具有多个突变的突变蛋白有优势，因为在将突变蛋白给予哺乳动物后，其免疫原性可能更弱，由此诱导中和抗体产生的可能性更低。在第三次筛选中，发现两种具单个突变的高亲和力突变蛋白，其如下文所示具有用组氨酸取代的D23的突变蛋白和具有用异亮氨酸取代的T12的突变蛋白(参见实施例I)。后来，将使瘦蛋白激动剂转化为瘦蛋白拮抗剂的突变引入到对瘦蛋白受体具有高亲和力的瘦蛋白突变体。用此种方式，产生了对瘦蛋白受体具有高亲和力的瘦蛋白激动剂和瘦蛋白拮抗剂二者。如以下实施例3所示，通过用不带负电荷的氨基酸残基合理诱变D23的取代，产生了最有效的瘦蛋白拮抗剂。本文将TO 2006/056987的瘦蛋白激动剂称为MLA (小鼠瘦蛋白拮抗剂)或HLA(人瘦蛋白拮抗剂)，同时通过加上前缀“强效”来称呼本发明改良的瘦蛋白激动剂和拮抗齐[J ;因此，例如，改良的小鼠瘦蛋白拮抗剂称为“SMLA”或强效的小鼠瘦蛋白拮抗剂，而改良的人瘦蛋白拮抗剂本文称为“SHLA”或强效的人瘦蛋白拮抗剂。本文公开的蛋白质或其片段中的某些氨基酸残基位置按照SEQ ID NO: 2中所示的野生型人瘦蛋白的编号，其通过参考氨基酸残基的一个字母密码及其在野生型人瘦蛋白中的位置来命名。因此，例如，本文亦称作D23的对应于野生型人瘦蛋白23位位置的天冬氨酸，按照蛋白质化学领域熟知的比对算法，在瘦蛋白片段或在不同大小的同源哺乳动物瘦蛋白中可亦被称为D23。通过参考氨基酸残基的一个字母的编码及其如上所定义的位置和取代原始氨基酸残基的氨基酸残基的一个字母密码，来命名用另一氨基酸残基对某一位置氨基酸残基的取代。因此，例如，用甘氨酸取代D23将命名为D23G。尽管13年前已报道3-D瘦蛋白结构(Zhang等1997)，但至今未阐明瘦蛋白和瘦蛋白受体之间的结晶复合物。缺乏所述结构妨碍对本申请中报道的D23L或其它D23突变的有效结构阐释。因此，所提出的阐释基于过去多年报道的理论复合物模型(Peelman等2004，Iserentant等2005，Peelman等2006)。这些报道提示瘦蛋白具有与瘦蛋白受体相互作用的3个结合位点。未很好地阐述位点I，其重要性与形成推定的六聚体复合物有关联，所述复合物由与4个瘦蛋白受体反应的2分子瘦蛋白组成。在螺旋A和C的表面发现结合位点II，其为主要结合位点，并且其与瘦蛋白受体的CRH2亚结构域结合。我们实验室已亚克隆该人瘦蛋白受体亚结构域，表达为称作瘦蛋白结合结构域(LBD)的可溶重组蛋白质，其能够与人或其它哺乳动物瘦蛋白形成高亲和力1:1复合物(Sandowski等2002)。在本申请中将这种亦称为CHR2 (细胞因子同源区域II)的蛋白质，用作钓出在如上所述的酵母细胞表面表达的高亲和力瘦蛋白突变体的吊钩(hook)。推测位点III与LR的Ig-样结构域结合(Peelman等2004，Zabeau等,2003),并且其为激活瘦蛋白受体所必需。用分子建模和诱变方法(Peelman等2004)，显示结构上相似并面对同一方向的位于螺旋A的D9、T12、K15、T16和R20及位于螺旋C的Q75、N82、D85和L86 (参见图14)，很可能参与与CHR2 的相互作用。这些残基例如 D9S、T12Q、K15S、T16N、R20N、Q75S、N82S、D85S 和 L86A、 L86S、L86N和L86Q的突变，显著降低瘦蛋白对CRH2的亲和力，既影响与CRH2的结合又影响LR信号转导(Peelman等2004，Iserentant等2005)。迄今尚无关于D23的假定作用的报告发表，但本发明发现(参见表7)强烈表明，通过任何不携带负电荷的氨基酸取代D23，足以增加对人瘦蛋白结合结构域(hLBD;CHR2)的亲和力，并继而提高生物活性。在结合和细胞测定中观察到用D23L突变体的最大作用(表6和7和图7A-D)，并在小鼠体内增重实验中确证(图10和图11)。尽管通过结合测定测定的亲和力增加高达50倍，但在体外生物测定中的增加仅约13-14倍，很可能是因为在这些测定中所用的细胞具有过量的多余受体。体内实验中效力的提高更难计算，但如上所示其在9-27倍范围内。如所证明，在人和绵羊(ovine)瘦蛋白拮抗剂中的相同D23L突变得到相似结果。应该注意，小鼠和人序列的螺旋A的氨基酸序列相同。此外，在所有哺乳动物序列中保留D23，螺旋A的氨基酸序列几乎相同。D23位于螺旋A的C-末端，其在与R20、T16、T12相同的方向定向(图14)。其被不带负电荷的氣基酸取代可能废除一些(但未确定的)排斥效应，因此，提闻与LBD的相互作用。在拮抗剂和激动剂突变体二者中都出现亲和力增加，但与拮抗剂相反，体外基于细胞的测定中激动剂的生物活性未增加。该差异的原因可能与这一事实有关，即SMLA和SHLA的亲和力增加主要不是来源于km的增加而是来源于kf (未显示)的降低，这导致延长受体占有。所述延长占有使得拮抗剂更有效但可能不增加激动剂活性。这与人生长激素的情况相似，其通过噬菌体展示选择的突变体亦展现对hGH受体的高达400倍的增加亲和力，但在细胞生物测定中却并未更活跃(Lowman和Wells 1993, Pearce等1999 )。本发明由此提供合成的瘦蛋白拮抗剂，其包含经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中(i)修饰对应于野生型人瘦蛋白的39-42或39-41位位置的LDFI疏水结合位点，以使所述疏水结合位点的2-4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，以致所述位点疏水性变弱，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽为瘦蛋白拮抗剂；和(ii)用不带负电荷的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白23位位置的天冬氨酸(D23)，或用疏水的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白12位位置的苏氨酸(T12);所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白拮抗剂；或经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。 在某些实施方案中，用疏水或带正电荷的氨基酸残基取代D23，其中疏水氨基酸残基可为亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；带正电荷的氨基酸残基可为精氨酸或赖氨酸。具体而言，如下文实施例2所示，在所测试的突变蛋白中对瘦蛋白受体具有最高亲和力的突变蛋白中，D23被亮氨酸取代。因此，在某些实施方案中，D23被亮氨酸取代。在其它实施方案中，T12被异亮氨酸取代。亦已鉴定与野生型瘦蛋白比较对瘦蛋白受体具有增加的亲和力的突变蛋白，其中除用甘氨酸取代D23外，还引入进一步的突变。例如，在一·种突变蛋白中，用其它氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白的L68、S97和S132位位置的氨基酸残基；在另一突变蛋白中，用另一氨基酸残基取代对应于野生型瘦蛋白的G112位位置的氨基酸残基；在又一突变蛋白中，用其它氨基酸残基取代对应于野生型瘦蛋白的T37和G44位位置的氨基酸残基。因此，在某些实施方案中，除用疏水或带正电荷的氨基酸残基取代D23外，还如下取代另外的氨基酸残基(a)用甲硫氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白68位位置的亮氨酸(L68)，用苯丙氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白97位位置的丝氨酸(S97)，用酪氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白132位位置的丝氨酸(S132) ；(b)用丝氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白的112位位置的甘氨酸(G112);或(c)用丙氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白37位位置的苏氨酸(T37)和用天冬氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白44位位置的甘氨酸(G44)。此外，合成的瘦蛋白拮抗剂可任选除D23取代外，还具有选自以下的至少一个取代T12I、L68M、S97F、S132Y、G112S、Τ37Α和G44D ;和这些取代的两个或多个的任意组合。如上所述，用其它氨基酸取代野生型人或非-人哺乳动物瘦蛋白序列的LDFI疏水结合位点的2-4个氨基酸以使该位点疏水性变弱，使野生型瘦蛋白激动剂转化为瘦蛋白拮抗剂。在某些实施方案中，2-4个氨基酸残基被选自以下的氨基酸取代丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和丝氨酸，尤其是丙氨酸。在下文提供的实施例中，瘦蛋白拮抗剂具有4个中3个被丙氨酸取代的氨基酸残基。因此，在某些实施方案中，4个氨基酸残基有3个被丙氨酸取代；尤其是L39A、D40A和F41A。在这些测试中具有最高亲和力的瘦蛋白拮抗剂的D23被亮氨酸取代。因此，在某些实施方案中，合成的瘦蛋白拮抗剂是这样的突变蛋白，其中(i)修饰对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点，以使对应于野生型人瘦蛋白39位位置的亮氨酸被丙氨酸取代(D39A);对应于野生型人瘦蛋白40位位置的天冬氨酸被丙氨酸取代(D40A)；和对应于野生型人瘦蛋白41位位置的苯丙组氨酸被丙氨酸取代(F41A);和(ii) D23被亮氨酸取代(D23L)。在某些实施方案中，携带突变D23L的人瘦蛋白拮抗剂具有在SEQ ID NO: I中所示的氨基酸序列，携带突变D23L的小鼠瘦蛋白拮抗剂具有在SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列。本文所述术语“哺乳动物”包括人哺乳动物以及非人哺乳动物。因此，根据本发明，天然瘦蛋白可为人瘦蛋白或非人哺乳动物瘦蛋白，所述非人哺乳动物瘦蛋白例如但不限于绵羊、大鼠、小鼠、马和猪瘦蛋白，并且LDFI序列代表人瘦蛋白或非人哺乳动物瘦蛋白的39-42位LDFI序列。在某些实施方案中，瘦蛋白为人、小鼠或绵羊瘦蛋白。如下文表6中所见，在第一次筛选测定中鉴定的瘦蛋白激动剂和拮抗剂对瘦蛋白受体的亲和力，与野生型小鼠瘦蛋白比较介于约I. 5倍-约35倍范围内。然后合理诱变瘦蛋白拮抗剂中的D23，显示具有对瘦蛋白受体亲和力范围介于约18-约64范围的突变蛋白(表7)。因此，在某些实施方案中，本发明合成瘦蛋白拮抗剂与具有以下亲和力的瘦蛋白受体结合亲和力为经修饰的哺乳动物瘦蛋白的高达100倍、90倍、80倍、70倍、50倍、30倍或20倍，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白仅在对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点修饰，以使所述疏水结合位点的2-4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，由此使该位点疏水性变弱。在又一实施方案中，本发明合成瘦蛋白拮抗剂呈聚乙二醇化形式，且具有连接在其上的不同数目的聚乙二醇(PEG)分子。分子量约20 kDa的PEG适合该目的。本发明瘦蛋白拮抗剂的聚乙二醇化提高了其稳定性、其血浆半衰期和药代动力学。亦包括在本发明范围内的是本发明经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的盐。本文所述 用术语“盐”指肽分子的羧基盐和肽分子氨基的酸加成盐二种。羧基盐可通过本领域已知手段来形成，包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁或锌盐等等；和与有机碱形成的盐，例如与例如胺(例如三乙醇胺)、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等等形成的盐。酸加成盐包括例如与无机酸的盐，例如盐酸或硫酸；和与有机酸的盐，例如乙酸或草酸。优选将所述盐用于改进牵涉到稳定性、溶解性等方面的多肽药物特性。在另一方面，本发明涉及编码本发明瘦蛋白拮抗剂的分离的DNA分子。在某些实施方案中，拮抗剂具有通过以下取代来修饰的对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点L39A、D40A和F41A及另外D23被亮氨酸取代。具体而言，DNA分子包含SEQID NO: 4的DNA序列，其可操作地连接能够驱动DNA分子表达的诱导型或组成型主动启动子。在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明合成的瘦蛋白拮抗剂及药学上可接受载体，特别是如SEQ ID NO: I中所描绘的氨基酸序列的合成瘦蛋白拮抗剂。在某些实施方案中，药物组合物包含呈聚乙二醇化形式的合成瘦蛋白拮抗剂。此外，根据本发明，业已发现给予小鼠的强效瘦蛋白拮抗剂提供显著的保护作用，其中通过激活先天免疫反应诱导肝炎，所述保护作用通过抑制单核巨噬细胞浸润到发炎器官中来介导。认为先天免疫反应的改变是很多自发性炎性病症和代谢病症的初始发病机理的关键事件，所述病症实例包括炎性肠病和非酒精性脂肪性肝炎。假定代谢途径例如瘦蛋白途径通过多种机理与先天免疫武器(arm)互相作用并对其进行调节。因此，包含本发明合成瘦蛋白拮抗剂的药物组合物可用于治疗以下任何病症，在所述病症中牵涉内源性瘦蛋白的非合乎需要或有害的活性或改变的先天免疫反应，所述病症例如代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症(通过提高罹患厌食症的对象的食欲来实施治疗)、恶病质、癌症、自发炎症和自身免疫病(例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎)。因此，在某些实施方案中，本发明提供用于治疗人或非人哺乳动物的II型糖尿病和用于治疗胰岛素抗性(特别是与肥胖症有关的II型糖尿病和胰岛素抗性)的药物组合物。在其它一些实施方案中，可将药物组合物用于抑制恶性细胞生长，由此可用于治疗癌症，例如但不限于乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌。可以以常规方式用一种或多种生理上可接受载体或赋形剂来配制供本发明使用的药物组合物。载体应该在与组合物的其它成分相容及对其受者无害意义上为“可接受的”。给予本发明药物组合物的方法包括但不限于胃肠外给药，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下；粘膜给药(例如经口、鼻内、含服、阴道、直肠、眼内给药)；鞘内给药；局部和皮内给药。给药可为全身给药或局部给药。在另一方面，本发明涉及用于治疗以下疾病的方法代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症、自发性炎性疾病和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎，所述方法包括给予需要治疗的患者有 效量的本发明合成瘦蛋白拮抗剂。在又一方面，本发明涉及用于治疗以下疾病的本发明合成瘦蛋白拮抗剂代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症或自发性炎性疾病和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎。除了其可能的药物用途外，本发明瘦蛋白拮抗剂还可用作研究瘦蛋白激素生物活性的研究工具。本发明进一步提供合成瘦蛋白激动剂，其由经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽组成，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽具有完整未经修饰的对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点，其中对瘦蛋白多肽进行修饰以改进其与瘦蛋白受体的结合亲和力，其如上文对合成瘦蛋白拮抗剂所述。换言之，本发明提供由以下组成的合成瘦蛋白激动剂经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12;所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白激动剂；或经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。改进经修饰的瘦蛋白多肽对瘦蛋白受体的亲和力的特定修饰选自D23L、D23G、D23A、D23T、D23H、D23F、D23R、D23K和T12I。任选除D23和/或T12取代外，还可将其它取代引入到瘦蛋白多肽中，例如L68M、S97F、S132Y、G112S、T37A和G44D及这些取代的两个或多个的任意组合。在其它方面，提供药物组合物，其包含药学上可接受载体和对瘦蛋白受体具改进的结合亲和力的本发明合成瘦蛋白激动剂。迄今为止，在有限的其中已鉴定瘦蛋白遗传缺陷的病例中使用瘦蛋白治疗(Bluher等2009),或基于实验在人脂肪萎缩中使用(Chong等2010)。然而，利用瘦蛋白作为抗肥胖症药物的持续努力一直在继续，尽管失败了，但目前出版了阐述成功联合瘦蛋白和糊精治疗的报告(Turek等2010)。另一报告显示用化学蛋白伴侣例如苯丁酸钠制剂(biphenyl，4-PBA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA)预先治疗小鼠提高了瘦蛋白的敏感性(Ozcan等，2009)。此外，最近的报道显示，用与胰岛素联合的瘦蛋白治疗I型糖尿病小鼠，与单用胰岛素治疗I型糖尿病小鼠相比，降低了血糖波动，胆固醇水平更低，体脂肪沉积更少(Wang等，2010)，鉴于该最近的报道，高亲和力瘦蛋白激动剂可与胰岛素或其它介导葡萄糖稳态的药剂联合用于治疗I型糖尿病。因此，药物组合物可包含一种或多种另外的活性药剂。例如，为了治疗I型糖尿病，药物组合物除瘦蛋白激动剂外还可包含胰岛素；为了治疗肥胖症，药物组合物除瘦蛋白激动剂外还可包含糊精激动剂，例如SYMLINe (乙酸普兰林肽)或化学蛋白伴侣例如苯丁酸钠制剂(4-PBA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA)。在另外方面，本发明涉及用于治疗选自以下的其中牵涉异常瘦蛋白信号转导或促进血管生成的疾病或病况的方法肥胖症、食欲过盛相关综合征、I型糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的本发明合成瘦蛋白拮抗剂。在某些实施方案中，所述方法 用于治疗肥胖症，并进一步包括给予所述患者糊精类似物例如SYMLIN (乙酸普兰林肽)或化学蛋白伴侣例如苯丁酸钠制剂(4-PBA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA)。在某些实施方案中，所述方法用于治疗I型糖尿病，并进一步包括给予所述患者胰岛素。同样，本发明合成瘦蛋白激动剂用于治疗其中牵涉异常瘦蛋白信号转导或促进血管生成的疾病或病况，所述疾病或病况选自肥胖症、食欲过盛相关综合征、I型糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化。合成瘦蛋白激动剂可与给予糊精类似物或化学蛋白伴侣联合用于治疗肥胖症，或与给予胰岛素联合用于治疗I型糖尿病。根据本发明，业已发现在雄性和雌性两种小鼠中注射聚乙二醇化的瘦蛋白拮抗剂(PEG-MLA或PEG-SMLA)诱导极强的开胃作用，即对食欲的刺激作用，这导致极快速的增重，其主要起因于脂肪积累(参见实施例4和7)。这种增重可在停止PEG-MLA或PEG-SMLA注射时逆转。本文亦显示，与对照比较，用PEG-MLA长期注射雄性小鼠逐渐出现胰岛素抗性，并逐渐出现胰岛素水平及稳态模型评估(HOMA)记分方面的显著差异(Η0ΜΑ是用于定量胰岛素抗性和β_细胞功能的方法)。亦观察到显著增加血糖、血液甘油三酯和总胆固醇-这是出现糖尿病前代谢综合征的指征。这种与高血糖、高血脂和胰岛素抗性有关的可逆性瘦蛋白拮抗剂-诱导的肥胖症，可用作小鼠的可快速逆转2型糖尿病模型。可通过注射PEG-SMLA，或通过产生条件性表达编码SMLA的DNA序列的转基因小鼠，来获得所述模型。因此，在另一方面，本发明提供转基因小鼠，其基因组包含这样的基因，其包含编码本发明合成瘦蛋白拮抗剂的DNA分子，所述基因可操作地连接诱导型启动子。在某些实施方案中，DNA分子编码由具有SEQ ID NO: I (并且优选为SEQ ID NO:4)氨基酸序列的多肽组成的合成瘦蛋白拮抗剂。如WO 2006/056987所指出，为了产生功能性瘦蛋白拮抗剂，野生型哺乳动物瘦蛋白的39-42位的至少两个氨基酸残基可被选自以下的一个或多个氨基酸残基取代丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和丝氨酸。因此，本发明转基因小鼠基因组可包含编码这些瘦蛋白拮抗剂的基因，其另外具有如上所定义的D23或Τ12突变。当然，亦可将编码WO 2006/056987的瘦蛋白拮抗剂的基因引入到转基因小鼠。因此，瘦蛋白拮抗剂中的哺乳动物瘦蛋白多肽序列的39-42位的任何位置处的任何两个氨基酸残基被丙氨酸取代，例如，在39、40或39、41或39、42或40、41或40、42或41、42位置处。在某些实施方案中，分离的DNA分子编码源自人瘦蛋白的瘦蛋白拮抗剂。具体而言，DNA分子为SEQ ID NO: 5，其编码双重人瘦蛋白突变体L39A/D40A。在另一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 6，其编码双重人瘦蛋白突变体F41A/I42A。
在另一实施方案中，分离的DNA分子编码源自绵羊瘦蛋白的瘦蛋白拮抗剂。具体而言，DNA分子为SEQ ID NO: 7，其编码绵羊瘦蛋白的双重突变体L39A/D40A。或者，DNA分子为SEQ ID NO: 8，其编码羊瘦蛋白的双重突变体F41A/I42A。在本发明另一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 9，其编码人瘦蛋白的三重突变体L39A/D40A/F41A。在另一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 10，其编码绵羊瘦蛋白的三重突变体L39A/D40A/F41A。在又一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 11，其编码人瘦蛋白的四重突变体L39A/D40A/F41A/I42A。在又一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 12，其编码绵羊瘦蛋白的四重突变体L39A/D40A/F41A/I42A。为了允许时空调控，很重要的是，控制瘦蛋白拮抗剂基因表达的启动子为诱导型 的。例如，期需基因仅在发育的成年阶段开启，并且可在实现某一作用后关闭。迄今为止，在转基因小鼠中成功使用了两种主要系统，即四环素-诱导型系统和Cre/loxP重组酶系统(为组成型或诱导型)。为了在体内使用这些系统，有必要产生两组转基因动物。一种小鼠系在所挑选的基因或组织特异性启动子调控下表达激活因子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一组转基因动物表达“受体”构建体，其中在tTA/rtTA反式激活因子靶序列调控下(或其侧翼为IoxP序列)表达瘦蛋白拮抗剂转基因。让两种小鼠品系交配使得可时空调控转基因的表达。业已阐述其它诱导型系统，例如，包含合成的类固醇激素结合结构域的启动子，并且其可用于本发明。因此，在某些实施方案中，诱导型启动子为四环素-调控的反式激活因子依赖性启动子，转基因小鼠的基因组进一步包含四环素-调控反式激活因子。反式激活因子可选自两类反式激活因子；一类使其仅在四环素不存在时能转录，或一类使其仅在四环素存在时转录。用于产生转基因小鼠的方法是常识，可选择任何合适的方法用于产生本发明转基因小鼠，例如，其如在“Transgenic animal technology: a laboratory handbook,第2版(Carl A. Pinkert编辑,Gulf Professional Publishing, 2002)中教导，该书在此以其整体并入。如上所述，本发明转基因小鼠优选表现出胰岛素抗性和增加的血液胰岛素和血糖水平。因此，在另外方面，本发明提供筛选对选自以下的疾病或病症具有治疗活性的物质的方法高血糖、高血脂、2型糖尿病和胰岛素抗性，所述方法包括以下步骤(I)将测试物质给予转基因小鼠；(2)确定转基因小鼠中所述疾病或病症是否受到抑制；和(3)当转基因小鼠中的所述疾病或病症受到抑制时，选择所述测试物质作为对所述疾病或病症具有治疗活性的物质。本发明现在将通过以下非限制性的实施例来阐明
实施例。材料和方法
材料-我们实验室制备了重组人瘦蛋白结合结构域(hLBD) (Sandowski等,2002)以及小鼠和瘦蛋白，和小鼠和人瘦蛋白拮抗剂，如前所述的(Salmon等,2006，Niv-Spector等，2005)。由 Entelechon Co. Rensberg, Germany (Salomon 等 2006)合成优化用于在大肠杆菌中表达的合成小鼠瘦蛋白野生型(WT) cDNA。人瘦蛋白和小鼠白介素-3 (mIL3)购自蛋白质实验室Rehovot (Rehovot, Israel)。在分子生物学实验中使用的限制性酶来自 Fermentas (Vilnius, Lithuania)。自 Syntezza (Jerusalem, Israel)订购高纯
DNA引物。裂解缓冲液、萘啶酸、3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)_2，5- 二苯基溴化四唑雜
(噻唑蓝，MTT)、嘌呤霉素(puromycin)和卡那霉素(kanamycin)购自Sigma (Sigma,Israel)。Superdex 75 HR 10/30, 26/60 和 Superdex 200 HR 10/30 柱和 Q-S印harose和 SP-Sepharose 来自 Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Sweden)。用于SDS-凝胶电泳和Bradford蛋白质测定的分子标记购自Bio-Rad (Bio-Rad, Israel)。细菌用蛋白胨来自Laboratories Conda (Madrid, Spain)。细菌用酵母提取物和细菌用酪蛋白氨基酸(_Trp, -Ura)来自 Difco (Becton Dickinson, Maryland, USA)。横基-NHS-LC-生物素购自Pierce (Rockford, IL, USA)。质粒pCT302和酵母酿酒酵母 {Saccharomyces cerevisiae)的 EBYlOO 菌株由 Dr. E. T. Boder (来自 University ofTennessee Knoxville, TN, USA)惠赠。单克隆Ab 9el0购自(Covance, Emeryville, CA),FITC-标记的F(ab’)2山羊抗小鼠IgG来自(Chemicon)，链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)缀合物来自(BD PharMingen, San Jose, CA)。p-STAT-3 (Tyr705)和 STAT-3 抗体来自(Cell Signaling Danvers, MA, USA), mPEG-丙酸基-ALD 20 kDa 购自 JenkemTechnology USA Inc. (Allen, TX)。胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素(‘pen-strep’ ；10, 000 单位/ml 和 10, 000 mg/ml)和加强化学发光试剂(ECL)来自 Biological IndustriesLtd. (Beit Haemek, Israel)。RPMI-1640 和 DMEM 培养基来自 GIBCO (Invitrogen -Carlsbad, CA. ), PelletPaint 共沉淀剂来自(Novagen, EMD Biosciences, Darmstadt,Germany)。突光素酶测定试剂来自Promega (Madison, WI, USA),缀合过氧化物酶的链霉亲和素来自 Jackson Tmmuno Research 实验室(West Grove, PA, USA), TMB 来自 Dako(DakoCytomation, Denmark)。其它试剂例如Tris、半胱氨酸、精氨酸、NaOH> HC1、硼酸、吐温20、超纯尿素、脱脂奶皆为分析级。购买以下试剂盒StratageneGeneMorph 试剂盒、Stratagene QuickChange 诱变试剂盒和 XL-1 Blue 细胞(Stratagene - La Jolla, CA, USA)。Qiagen 小量制备和Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)。Zymoprep II酵母质粒小量制备试剂盒(Zymo Research, Orange, CA)。在我们实验室制备以下试剂LB (10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/LNaCl，无菌)；TB (80 g/L胰蛋白胨、160 g/L酵母提取物、33. 3 g/L甘油，无菌)；YH)培养基(10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖，无菌)；SD-CAA培养基(20 g/L葡萄糖、6. 7 g/L Difco酵母氮源、5 g/L细菌用酪蛋白氨基酸、5. 4 g/L Na2HPCM和8. 56 g/LNaH2P04，无菌)；SG-CAA培养基(如SD-CAA，只是用20 g/L半乳糖代替葡萄糖)；FACS缓冲液-PBS 缓冲液(8 g/L NaCl.O. 2 g/L KCl,1. 44 g/L Na2HP04、0. 24 g/L KH2P04)调整pH至7. 4，补充5 %牛血清白蛋白和0.05%叠氮化物；用于荧光素酶活性的裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸、2mM DTT、2mM CDTA、10% 甘油、1% Triton-100, pH 7. 8);用于凝胶过滤实验的 TN 缓冲液(含有 300 mM NaCl 的 25 mM Tris-HCl，pH 8 或 9)。hLBD的生物素化-让hLBD (O. 12 mg/ml)对PBS (pH 7. 5)透析，并在室温与10倍摩尔过量的生物素化试剂磺基-NHS-LC-生物素孵育40分钟。通过对PBS缓冲液透析去掉过量的未反应的生物素。生物素化的LBD能够与瘦蛋白或瘦蛋白拮抗剂形成I: I复合物，其与非生物素化的LBD相似(未显示)。Vvfif蛋办效療摩表愈展禾-通过PCR修饰小鼠瘦蛋白野生型(WT) cDNA，以分别在5’和3’末端引入船e/和BamHI限制性位点，这使得能随后亚克隆到用NheI和BamHI线性化的受者载体PCT302中。在PCR中使用的引物对于5’末端为5’ - GTACGCAAGCTAGCGCTGTTCCGATCCAGAAAGTTCAGG - 3’ (SEQ ID NO: 5)，对于 3’ 末端为 5’- CGTAGGATCCGCATTCCGGAGAAACGTCCAACTG - 3’ (SEQ ID NO: 6)。用船e/和及丽奴消化小鼠瘦蛋白的PCR产物，提取并连接到线性化PCT302表达载体中。用新的质粒转化XL-I Blue细胞，铺板在含有100 μδ/πι1氨苄西林的LB-琼脂板上。分离4个大肠杆菌菌落，通过用NheI取BamHI限制性酶消化确证含有小鼠瘦蛋白cDNA。所有菌落都是阳性，对其中之一进行测序。·通过在含有半乳糖的培养基中诱导酵母酿酒酵母EBY100菌株，小鼠瘦蛋白表达为Aga2p蛋白融合物(Boder ET, Wittrup KD, 1997·)。在编码瘦蛋白的DNA的5’上游表达血凝素(HA)表位标签,而c-myc表位标签与Aga2p -瘦蛋白融合构建体的3’连接,示意结构呈现在图I中。可用缀合FITC的山羊抗小鼠抗体和小鼠mAb 9e 10检测c-myc表位标签。在Aga2p_瘦蛋白融合物C-末端检测到c-myc表位标签,表明在酵母细胞表面上展示全长瘦蛋白融合物。让用pCT302/小鼠瘦蛋白Wt转化的酵母细胞在3 ml选择葡萄糖培养基SD-CAA中在30°C过夜振荡生长。约18 - 20小时后，在30°C于5 ml选择半乳糖培养基(SG-CAA，其中2%半乳糖代替SD-CAA中的葡萄糖)中振荡诱导Agalp (膜酵母蛋白质)+ Aga2p-瘦蛋白的表达。在约20 - 24小时(I - 2次加倍)后通过离心收获培养物，用含有5%牛血清白蛋白和O. 05%叠氮化物(FACS缓冲液)的PBS洗漆，与抗ciyc mAb 9el0 (1:100稀释)和生物素化的-hLBD (终浓度为约50 nM)在冰上孵育60分钟，用PBS洗涤，与FITC-标记的F (ab’)2山羊抗小鼠IgG (1:50)或链霉亲和素-藻红蛋白(SA - PE)缀合物(I: 50)或二者一起在冰上孵育30分钟。在Weizmann Institute的流式细胞术中心的Beckton DickinsonFACSCalibur流式细胞仪上分析标记的酵母细胞。小鼠瘦蛋白文库的构建-觅 )traXagene GeneMorph 试剂盒随机诱变野生型小鼠瘦蛋白wt基因，以获得闻诱变率。如Raymond等(1999)研究中所述，为获得最好的转化效率，设计同源重组引物以便插入物可在每一末端将与切割的受者载体具有约50 bp重叠。为使插入物与切割载体5’同源而使用的引物为5’- GTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCTGT TCCGATCCAGAAAGTTC- 3’ (SEQ ID NO: 7)，为使插入物与切割载体 3’ 同源而使用的引物为 5’ -GATCTCGAGCTATTACAAGTCCTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCGGATCCGCATTCCGGAGAAACGTCCAACTG-3’ (SEQ ID NO: 8)。凝胶纯化 PCR 产物，用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取。用随机诱变试剂盒进一步扩增所获得的PCR产物，再次提取。将最终的PCR产物连同线性化pCT-小鼠瘦蛋白一起转化到酵母中。PCR产物的5’和3’侦U翼的50个碱基对与有缺口的质粒之间在酵母中的体内同源重组，产生大约5xl05小鼠瘦蛋白变体文库。用Pellet Paint (Novagen)浓缩41 Kg的诱变DNA插入物和8· 2 Kg限制性酶线性化的PCT302载体骨架，并通过5次电穿孔(Meilhoc等，1990)将其转化到EBYlOO感受态酵母细胞(Boder和Bittrup, 1997)中。获得5x10s酵母转化株文库,其通过对等分试样文库铺板及菌落计数来估测。对于所 有转化，总插入片段与切割受者载体的比率保持在5:1。制备用于同源重组的电感受态酵母-酵母制备方法严格遵循Meilhoc等(1990)所述方法。首先，用酿酒酵母菌株EBYlOO (Boder和Wittrup, 1997)的来自YPD中EBYlOO过夜培养物接种50 ml的YPD至光密度(OD) O. I。接下来，让细胞在30°C振荡生长到OD为I. 3-1. 5 (约生长6小时)。通过离心收获细胞，悬浮在50 ml冷无菌水中。用25 ml冷无菌水洗涤细胞，悬浮在2 ml冰冷无菌的IM无菌山梨醇中。通过离心收获细胞，悬浮在50μ IM无菌山梨醇中。随后，用Bio-Rad基因脉冲仪在O. 2 cm小池(电压I. 5 kV，电容25KF)对悬浮细胞实施电穿孔。在脉冲后，立即将等分试样的细胞悬浮在I ml冷I M山梨醇中，将整个转化混合物转移到含有卡那霉素(25 Pg/ml)和pen-str印(I :100稀释)的50ml SDC-AA选择培养基中于30°C生长。移走少量等分试样，铺在SDC-AA板上以测定转化效率。由流式细胞术筛选小鼠瘦蛋白文库-将在SD-CAA选择培养基中于30°C振荡过夜生长的50 ml体积的转化库(pool)稀释至IJ OD600 = O. 05，在30°C过夜生长到OD600 >1. O。然后接种5 ml体积SG-CAA至OD6tltl约O. 5，过夜生长到0D_为3_4。业已阐述用于筛选酵母多肽文库的详细方案(Boder和Wittrup，2000)。简言之，然后用生物素化的hLBD以50 nM浓度于37°C在FACS缓冲液中标记3 X IO8个诱导的酵母细胞达I小时。为了检测C-末端c-myc表位标签的表达，在同一次孵育中同时加入单克隆抗体9el0 (以1:100稀释)。然后用冰冷的FACS缓冲液洗涤酵母细胞，在含有2000 nM浓度的过量冷非生物素化的hLBD的FACS缓冲液中于37°C重悬2小时。洗涤细胞，用第二抗体缀合有R-藻红蛋白(PE)的链霉亲和素(1:50)和缀合有FITC的山羊抗小鼠抗体(1:50)标记I小时。洗涤细胞，通过在Beckton Dickinson FACSAria III细胞分选仪上双色流式细胞分选酵母来筛选，以分离相对于野生型瘦蛋白具改进的与可溶性hLBD结合的克隆。培养收集的酵母细胞并诱导表达。通过流式细胞术进行三轮分选，在每一次分选之间使其重新生长并重新诱导表面表达。在第一轮分选期间检查总共约IxlO7细胞，收集约5%细胞群。在第二轮分选后，以O. 5-1%严格性收集I. 6 X IO5细胞，在第三轮筛选后，以O. 1%严格性收集5000个细胞。冷冻每一文库，按照实验方案保存在_80°C (Chao等，2006)。DNA分离和测序-在三轮分选后，将收集的细胞铺在选择培养平板上，以分离单个克隆。用Zymoprep试剂盒(Zymo Research)按照厂商方案提取来自40个单克隆的DNA。通过转化到XL-I Blue细胞(Stratagene )中来扩增DNA。将细胞铺到补充100 Kg/ml氨苄西林的选择性LB平板上。让来自这些板的菌落在37°C于LB培养基加100 μδ/πι1氨苄西林中过夜生长，用Qiagen小量制备试剂盒按照厂商说明分离DNA，测定DNA的序列。在第三轮筛选后选择的酵母克隆中测定对可溶性人瘦蛋白受体(hLBD)的亲和力-在第三轮筛选后让单个酵母细胞JT廢和Wt小鼠瘦蛋白生长并诱导。用不同浓度(1000、333、111、37、12、4、1. 37 nM)的生物素化的hLBD连同抗cifc Ab和第二荧光Ab，如上所述标记IxlO6细胞。用Beckton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪获得c_myc阳性酵母的荧光数据。为了计算解离常数Kd，然后用平均荧光强度(MFI)对hLBD浓度作图，用每一待测生物素化的hLBD浓度获得所述MFI,通过Prism软件(Prisma, GraphPad Prism ,第4. O版GraphPAD软件，San Diego, CA)用含双曲线方程的非线性回归(曲线拟合)来分析。制备编码小鼠瘦蛋白突变蛋白的细菌表达质粒-实施PCR以分别在5’ _和3’ _末端引入AfcoI和历/^III限制性位点，这使得随后能将最好的突变体小鼠瘦蛋白结合剂DNA亚克隆到用AfcoI和历ii/III线性化的pM0N3401载体中。所用引物对瘦蛋白突变体的5’末端为 AAAAAACCATGGCTGTTCCGATCCAGAAAG (SEQ ID NO: 9)，对瘦蛋白突变体 3’ 末端为AAAAAAAAGCTT TCAGCATTCCGGAGAAACGTCC(SEQ ID NO: 10)。用AfcoI 和历/ /ΙΙΙ 消化pCT302的小鼠瘦蛋白突变蛋白的cDNA，提取并连接到线性化的pMon3401表达载体中。用新表达质粒转化大肠杆菌M0N105感受态细胞,铺在含有75 Kg/ml大观霉素(spectinomycin)的LB-琼脂平板上用于质粒选择。分离四个大肠杆菌菌落，通过用Afc0I///i/7dIII限制性酶消化来确认含有小鼠瘦蛋白cDNA。所有菌落都为阳性，对其中之一测序。将L39A/D40A/F41A突变插入到小鼠瘦蛋白突变蛋白_将突变插入到瘦蛋白以制备瘦蛋白拮抗剂的程序如国际申请PCT/1L2005/001250所公开，以如同完全公开一样·以其整体通过引用并入本文。为了制备具有拮抗剂活性的瘦蛋白突变体，使用编码6种所选择的小鼠瘦蛋白突变蛋白的pMon3401表达质粒(参见以上部分)作为起始材料。用Stratagene QuickChange诱变试剂盒(La Jolla, CA)按照厂商说明用两种互补引物(表
I)修饰瘦蛋白插入物。设计引物以含有碱基变化(以粗体标记)，来获得相应突变，但仍保留合适的氨基酸序列，并且不改变用于菌落筛选的特异性限制性位点(下划线)。程序包括用Pfu聚合酶的18个PCR循环。然后用Dpnl限制性酶(其对甲基化及半甲基化的DNA(靶序列5’-Gm6ATC-3’)为特异性的)消化突变的构建体，以消化模板并选择含有合成DNA的突变。用突变的质粒转化XL-I感受态细胞，在5 ml LB培养基中生长，分离质粒。用设计的特异性限制性位点筛选每一突变体的5个菌落的突变，显示至少80%效率。测定每一突变体的两个菌落的序列，确定含有突变但无不想要的错误掺入的核苷酸。然后用质粒转化Monl05感受态细胞并用于表达。将D23突变体插入到编码小鼠瘦蛋白拮抗剂的质粒-如先前段落所述制备D23A、D23G、D23L、D23R、D23K、D23F和D23W突变体，将编码小鼠瘦蛋白拮抗剂(MLA)的pMon3401表达质粒用作起始材料。引物详述于表I。小鼠瘦蛋白突变蛋白的表达、重折叠和纯化-当用萘啶酸诱导并再生长4小时后，在2. 5-L培养物中表达于N-末端与另外的Met-Ala (通过细菌裂解甲硫氨酸)重组突变的小鼠瘦蛋白。然后如前所述(Gertler等，1998 ;Salomon等，2006)制备包涵体(IB)并冷冻。随后，将自O. 3L细菌培养物获得的包涵体(IB)溶解在含有I mM半胱氨酸的50 ml的4. 5 M尿素、40 mM Tris碱中。用NaOH将溶液的pH调整到11. 3。于4°C搅拌2小时后，将3体积的O. 67 M Arg加到终浓度O. 5 M，再搅拌I. 5小时。然后将溶液对10 L 10 mMTris - HCl, pH 9透析60小时，且更换5或6次外部溶液。将NaCl加到终浓度100 mM,然后将蛋白质溶液以最大流速(400 - 500 ml/小时)上样到Q-Sepharose柱(5_ml珠体积),用含有100 mM NaCl的10 mM Tris-HCl, pH 9预平衡。收集含有各自瘦蛋白突变蛋白的穿透流分(breakthrough fraction),并浓缩为2-3 mg蛋白质/ml。然后将18_ml部分上样到制备性 Superdex 75 柱(26/60cm)上，用含有 300 mM NaCl 的 25 mM Tris-HCl, pH9预平衡。合并含有单体蛋白的流分，其如通过在分析性Superdex 75 HR 10/30柱(1/30cm)上的凝胶过滤所测定，将该流分对NaHCO3透析以确保4:1蛋白质-比-盐的比率并冻
干。


本发明提供了对瘦蛋白受体具有提高的结合亲和力的瘦蛋白突变蛋白，特别是瘦蛋白拮抗剂。这些化合物以及包含所述化合物的药物组合物可用于治疗其中牵涉内生瘦蛋白的非期需或有害活性或经改变先天性免疫反应的任何病症。