专利名称：使用蛋白酶制备皮革的方法和使用它处理来自皮革加工的废物的方法 通常，作为需要昂贵的设备和技术的粗皮加工工业，皮革工业是决定皮革制品如鞋，袋，服装和皮带的质量的主要工业(chiefindustry)。在皮革工业中，当将各种动物的生皮或兽皮进行复杂的皮革制备过程时，生产终产品，即皮革。将使用物理化学和生物方法的皮革制备方法分为需要水的湿法和干法。湿法包含为了防止由细菌或霉菌导致生皮腐败的卤腌，为了去除生皮多余成分的浸湿，为了产生用石灰处理的粗皮的浸灰，为了去除石灰的脱灰，为了生物处理多余成分的软化，为了降低pH值的酸浸，中和，复鞣，染色和乳液加油(或脂)的步骤。更具体地，在浸湿步骤中，去除大量附着于生皮或兽皮的多余蛋白质，和盐类或污物。在浸灰步骤中，使用石灰去除毛发和非必需蛋白质。在脱灰步骤中，去除在先前步骤中使用的石灰。在用于彻底的表面清洗的软化步骤中，去除多余蛋白质。一种保留毛发的方法，其是一种有利于环境的皮革制备方法，将蛋白水解酶用于浸灰和脱灰步骤。在皮革制备过程中浸灰步骤极大影响COD(化学需氧量)。尽管主要是轻工业，皮革工业是有代表性的产生污染的工业，因为大量废水和固体废物导致水污染和土壤污染。在湿法中使用它们之后将在各个步骤中使用的大部分化学品作为废水排放。为了从粗皮制备皮革制品，使用了大量化学品。另外，使用大量水，活化剂，石灰，硫化物，盐类，酸类，铬，合成单宁，染料，乳液加油(或脂)试剂，粘合剂，补充剂，增亮剂和溶剂。然而，通过在浸灰步骤中过度使用去除粗皮中各种非结构蛋白质所需的硫化物和碱金属，废水污染变得严重。在从皮革制备中产生的废水中，包含大量有机和无机物质，如高浓度的含盐硫化物和有机物质，从而增加了污染水平。另外，在皮革制备中，浸灰，脱灰，鞣革和染色步骤需要大量的水，因而将用过的水作为废水排放。排放的废水包含具有高污染负荷的兽皮碎屑，毛发，可溶性蛋白和中间降解产物，流入废水蓄水池。该废水特征在于存在高毒性重金属一铬，并且BOD(生物需氧量)和COD非常高，其是因为大量的有机和无机物质，和浮游物。为了纯化废水，需要各种设备和试剂，从而导致高三废水处理成本。此外，从皮革制备过程中产生的生皮的各种固体废物，如刮肉碎屑，毛皮碎屑，刮皮碎屑，修剪碎屑相当于50％或更大的粗皮重量。该固体废物的处理成本增加了生产成本。发明概述本发明人对皮革制备方法和废物处理方法进行彻底和深入的研究，其目的在于避免在现有技术中遇到的问题，结果发现使用蛋白水解酶制备皮革和处理废物，由此可以获得高质量皮革并且可以减少来自皮革加工的废物的量并可再循环废物，从而完成本发明。
因此，本发明的一个目的是提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生产的蛋白酶HY-3制备皮革的方法。
本发明的另一个目的是提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生产的蛋白酶HY-3处理来自皮革加工的废物的方法。
在本发明的一个方面，提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生产的蛋白酶HY-3制备皮革的方法。
在本发明的另一方面，提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生产的蛋白酶HY-3处理来自皮革加工的废物的方法。
附图简述

图1是显示能够使用本发明蛋白酶HY-3的皮革制备方法的结构示意图。
图2是显示在使用本发明的蛋白酶HY-3时从皮革洗脱的蛋白质的量的曲线图；●对照■上清液▲浓缩的上清液发明详述本发明关于通过使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生产的蛋白酶HY-3制备皮革的方法。
本发明的方法包含浸湿，浸灰，脱灰和软化的步骤(参见图1)。
至于用于本发明皮革制备方法的蛋白酶HY-3，从培养Aranicolaproteolyticus HY-3菌株的培养基中分离微生物，从而使用剩余的包含酶的上清液，或者使用配制为制剂的蛋白酶HY-3与用于提高酶的稳定性的添加剂或者每步引入的物质的混合物。
优选以0.1-15重量％的量将本发明的蛋白酶HY-3加至浸湿，浸灰，脱灰和软化步骤，并且其是来自微生物培养基的去除微生物的含酶液体，或者可以是与用于提高酶稳定性的添加剂或者每步引入物质混合的制剂。
本发明的蛋白酶HY-3在37℃具有最大活性，在20-40℃具有75％或更高的相对活性。此外，该蛋白酶在pH8.0显示最大活性，在pH7.0-9.5显示80％或更高的相对活性(韩国专利申请号2000-5479)。通常，浸湿，浸灰和软化步骤是在25-35℃和pH8-9下进行，因此使用蛋白酶HY-3可以稳定分解生皮中的蛋白质。此外，当将大量的盐类加至浸湿，浸灰，脱灰和软化步骤时，大部分蛋白水解酶的活性降低，而本发明的蛋白酶HY-3保持它的活性，即使在10％的高盐浓度下，因此可以用于各个步骤。
通过使用蛋白酶HY-3，可以急剧减少常规使用的用于皮革制备的有机和无机化学品的量，从而可以进行环境中性的皮革加工。
因此，可以将该蛋白酶HY-3用于皮革加工，特别是可以用于贯穿浸湿，浸灰，脱灰和软化步骤的表皮，毛发和可溶性蛋白质的去除。
在浸湿步骤中，当将进行揉盐处理的动物生皮或兽皮运送至皮革加工厂时，为了去除各种污物和多余成分应该将足量的水加至划槽或桶中，其后在长时间内吸收于生皮组织中的水使得生皮组织能够恢复活的动物的正常生皮柔度。因此，可以分解附着在粗皮或兽皮的多余的可溶性蛋白质，污物和毛发，然后通过蛋白酶HY-3的处理去除。通过该方法，兽皮组织变得光滑，可以容易的进行接下来的浸灰步骤。
在强烈影响从皮革加工产生的废水中COD的浸灰和脱灰步骤中，蛋白酶HY-3可以分解生发层细胞或毛根基底细胞(base cell)，其应用不分解毛发的皮层而分解髓质的原理。另外，去除毛根和毛发滤泡，这样毛腔肯定膨胀，于是消除毛发，因此石灰和其它化学品可以容易地渗透，这样可以减少化学品的处理量。
在软化步骤中，蛋白酶HY-3去除粗皮中多余的蛋白质并疏松皮肤组织，由此在软化步骤后供应的用于皮革加工的化学品可以容易地渗透于组织中并且提高了化学品和组织之间的粘合强度。因此，减少了该化学品所需的量，抑制了废水中由未结合化学品导致的COD和BOD的增大。通过使用蛋白酶HY-3可以生产柔软和柔顺的皮革并可去除生皮上的污染物。由此，在染色时，改善了颜色的染色均匀性，因此减少了染料的量和极大提高了皮革商品的质量。
在本发明的另一个实施方案中，提供使用蛋白酶HY-3处理来自皮革制备过程的废物的方法。
通过使用本发明的蛋白酶HY-3处理从浸湿，浸灰，脱灰，软化和整理步骤产生的废物(参见图1)。
废物可以以液态或固态的形式形成，并且还可以再循环。
作为适用于本发明皮革制备的蛋白酶HY-3，可以使用微生物培养基，将微生物从上述培养基中分离之后剩余的含酶液体，或者与用于增加酶稳定性的添加剂或者每步引入物质混合的配制的制剂。
为了处理来自皮革制备过程的废物，将选自脂酶和淀粉酶中的一种与蛋白酶HY-3一起使用。
为了处理来自皮革制备过程的废物，将生产蛋白酶HY-3的微生物的培养基，将微生物从上述培养基中分离之后剩余的含酶液体，或者与用于增加酶稳定性的添加剂或者每步引入物质混合的配制制剂加至在浸湿和浸灰步骤期间产生的废水和固体废物，在软化步骤期间产生的固体废物，和在整理步骤后的固体废物之中。
从皮革制备中产生的废物相当于40-70重量％粗皮或兽皮的初始重量。大部分排放的固体废物被归类为工业废物并因此烧尽或简单地掩埋。因此，从生产成本来看，这些固体废物的处理成本相当高。
可以通过蛋白酶HY-3处理的固体废物的实例有在浸湿和浸灰步骤期间产生的来自粗皮的刮肉碎屑，修剪碎屑和毛发；在软化步骤后的毛皮碎屑；和在最后染色后的整理步骤中产生的生皮碎屑。
在刮肉碎屑和修剪碎屑中，蛋白质和脂类未完全分离并以混合状态存在，其中脂类组分相当于总组分的30-50％。对于刮肉碎屑和修剪碎屑，可以加入选自蛋白酶HY-3，脂酶或淀粉酶中的至少一种酶。
固体废物，如从在浸灰步骤之后的软化步骤产生的毛皮碎屑，包含大约40％的从皮革加工产生的总废物。毛皮碎屑包含4.0％脂类，1.5％钙，5.5％灰分，50-55％水和35-40％蛋白质。本发明的蛋白酶HY-3，可用作金属蛋白酶，当金属离子存在时它的活性增大。在1mM的钙离子的存在下蛋白酶HY-3的活性增大约1.5倍，在其它金属离子的存在下增大1.2-1.4倍。金属离子如钙离子在毛皮碎屑中大量存在，因此本发明的蛋白酶HY3有效分解毛皮碎屑中的蛋白质。
为了从粗皮制备皮革商品，必须使用大量化学品。此外，使用水，活化剂，石灰，盐类，酸类，铬，合成单宁，染料，乳液加油(或脂)试剂，粘合剂，补充剂，增亮剂和溶剂。在浸灰步骤中过度使用去除生皮中各种非结构蛋白质所需的硫化物和碱金属导致严重的废水污染。从皮革加工设备排放的废水包括有机、无机和浮游物质，其特征在于废水中的BOD和COD非常高并且存在铬，一种具有高毒性的重金属。通过使用蛋白酶HY-3，可以减少活化剂，石灰，硫化物，盐类，酸类和铬的量。
同时，报道了使用蛋白水解酶的废物再循环(韩国专利号1994-0007333)，然而，还未报道在废物中使用产生蛋白酶的微生物分解蛋白质。本发明的微生物即使在少量碳源和氮源的存在下也能茁壮成长，由该微生物分泌的蛋白酶HY-3可以分解来自皮革加工的固体废物。使用蛋白酶HY-3，可以将废物中的蛋白质水解成肽来制备食品，化妆品和工业产品。另外，可以将该蛋白酶用于在浸湿和浸灰步骤期间产生的含盐废水，由此通过蛋白酶HY3的分解可以再循环废水中的蛋白质。
此外，通过切割胶原蛋白分子中的多肽链可以将废皮革用作饲料和可食用明胶。通过将蛋白酶HY-3用于固体皮革废物的处理，可以防止环境污染并且可以获得二级产品。
实施例借助下列实施例可以获得对本发明更好的理解，阐明所述实施例是为了举例说明而不可理解为是来限制本发明。
实施例1生产蛋白酶HY-3为了生产蛋白酶HY-3，将用于培养微生物的标准培养基在高压下121℃灭菌20分钟，然后基于培养基总体积加入0.1-5体积％的量的生产蛋白酶HY-3的Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC 0268BP)并在25-30℃培养25-30小时。将培养基进行膜过滤，这样将上清液从生物量中分离。当需要时，通过10kDa的膜过滤将上清液浓缩3-10倍。
实施例2分析洗脱自使用蛋白酶HY-3的浸灰和脱灰步骤的蛋白质为了研究在极大影响COD的浸灰和脱灰步骤中蛋白酶HY-3的作用，实施下列程序。
具体地，将20g生皮切割成适当的大小，放入50ml试管中，然后向其中加入10ml水。此后，加入0.5％亚硫酸氢钠和0.5％硫酸铵并且在室温下反应15分钟。反应后，将0.2％洗涤剂和0.5％脱脂剂加至得到的溶液中并在室温下反应30分钟。将三支试管分为不含蛋白酶HY-3的对照，和含有如上述实施例1中制备的上清液和浓缩的上清液。使每支试管在室温静置，并获得样品。使用改进Bradford法(Bradford，M.，Anal.Biochem.，1976，72，248)的蛋白质分析试剂盒(Bio-rad，USA)来进行从样品洗脱的蛋白质的分析。
从实验结果，可以发现与对照相比，包含蛋白酶HY-3的试管具有更多的洗脱蛋白质，此外培养微生物的培养基的浓缩上清液比未浓缩上清液洗脱的蛋白质要多的多。
实施例3在软化步骤使用蛋白酶HY-3为了在皮革加工中提高蛋白酶HY-3的稳定性和性能，将蛋白酶配制为制剂并从而用在软化步骤中。
将冻干的本发明的蛋白酶HY-3以0.5-10重量％的量加至40-50％氯化铵(NH4Cl)，40-50％硫酸铵((NH4)2SO4)，0.005-0.01％氯化钙(CaCl3)和0.025-0.1％乳糖之中。为了检验配制的蛋白酶HY-3的软化作用，将生皮进行脱灰步骤，然后进行使用不同酶制剂的软化步骤，其后对生皮的表面状态进行观察。另外，将生皮进行鞣革和整理步骤，然后观察表面状态。作为在用于比较的软化步骤中使用的蛋白酶制剂，使用Amoron(ChungmuFermentation，Korea)和Oropon K(TFL，Germany)。实验步骤在下面表1中总结。
表1

在软化步骤加入本发明的蛋白酶HY-3和对照(Amoron和Oropon K)。更具体地，在脱灰步骤，加入上面表1中所示化学品1小时，然后在软化步骤加入0.2重量％乳酸和0.1-15重量％蛋白酶。软化步骤进行80分钟，然后进行使用包含盐分的强酸化学品处理的酸浸步骤12小时或更久，含铬的鞣革步骤进行大约12小时，接着干燥生皮。此后，观察生皮。
为了比较使用的酶制剂在每步的作用，将生皮进行脱灰，软化和酸浸步骤而仅在软化步骤使用不同的酶制剂。观察软化后的生皮并分析生皮的湿铬鞣革状态。
在软化后，与对照相比，用配制的蛋白酶HY-3处理的生皮在perioplie真皮的粒面(grain)和表面方面更清洁和更光滑。至于湿铬鞣革的粒面，通过蛋白酶HY-3处理的生皮表面更软并且白度更高。
比较例1比较通过在软化步骤加入脱灰剂制备的皮革的性能为了研究在不同脱灰剂的存在下蛋白酶HY-3的活性，除了在软化步骤加入每种脱灰剂，如3重量％氯化铵(NH4Cl)，3重量％硫酸铵((NH4)2SO4)，2重量％硫酸铵((NH4)2SO4)和1重量％氯化铵(NH4Cl)，和上面表1同样的方法实行本实施例，然后往那里加入蛋白酶HY-3。对于每种脱灰剂的加入比较生皮的物理性质。
通常，加入脱灰剂以增大软化作用。在加入脱灰剂时，检查由该脱灰剂导致的对蛋白酶HY-3的影响。
1-1加入氯化铵在进行与上面表1相同步骤的同时，在软化步骤中加入3重量％氯化铵(NH4Cl)并搅拌60分钟。此外，加入蛋白酶HY-3，Amoron和OroponK中的每一个。将生皮切割成宽30cm×长20cm。作为对照，在软化步骤未使用脱灰剂。
比较如此获得的生皮它们的性能。结果在下面表2中给出。
表2

1-2加入硫酸铵在进行与上面表1相同步骤的同时，在软化步骤中加入3重量％硫酸铵((NH4)2SO4)并搅拌60分钟。此外，使用蛋白酶HY-3，Amoron和Oropon K。将生皮切割成宽30cm×长20cm。作为对照，在软化步骤未使用脱灰剂。
比较如此获得的生皮它们的性能。结果在下面表3中给出。
表3

1-3加入氯化铵和硫酸铵在进行与上面表1相同步骤的同时，在软化步骤中加入1重量％氯化铵(NH4Cl)和2重量％硫酸铵((NH4)2SO4)并搅拌60分钟。此外，使用蛋白酶HY-3，Amoron和Oropon K。将生皮切割成宽30cm×长20cm。作为对照，在软化步骤未使用脱灰剂。
比较如此获得的生皮它们的性能。结果在下面表4中给出。
表4

如上所述，在软化步骤中单独使用硫酸铵((NH4)2SO4)之后的生皮的表面类似于使用Amoron和Oropon K之后的生皮表面。当单独使用氯化铵(NH4Cl)和氯化铵(NH4Cl)与硫酸铵((NH4)2SO4)的混合物时，伸长率极好。与Amoron和Oropon K相比，生皮具有更平滑的表面和更清洁的粒面。在收缩率和柔软度方面，结果相似。
当蛋白酶HY-3仅与硫酸铵一起使用时，发现中等效果，当单独加入氯化铵或氯化铵与硫酸铵的混合物时，发现协同效应。
比较例2测量实际使用的生皮的性能将具有1.2-1.4mm厚度的生皮进行浸灰步骤，分为两片，其中一片加入蛋白酶HY-3，另外一片加入进口软化剂。然后，进行软化。将生皮制成外皮(即进行鞣革过程以制备准备制备皮革商品(例如手提包和鞋)的生皮)，其然后进行如下面表5中的方法。观察生皮的表面状态并测量生皮的机械强度。
表5

当使用蛋白酶HY-3和进口Oropon K时，关于生皮的性能在下面表6中显示。
表6

从上面表6的结果，可以发现蛋白酶HY-3在几乎所有性能上比进口的Oropon K更优异。在拉伸强度方面，蛋白酶HY-3处理的皮革是2.5-2.7kg/mm2，而Oropon K处理的皮革是1.1-2.4kg/mm2。在抗撕强度方面，前者是5.1-7.3kg/mm2，而后者是4.1-5.8kg/mm2。此外，在崩裂强度方面，前者是40kg/mm2或更大，而后者是32-40kg/mm2。至于延伸率和柔软度，Oropon K处理的皮革显示为59-82％和3.5-4.2％，而本发明的蛋白酶HY-3生产延伸率为60-77％并且柔软度为3.3-3.9％的皮革。
比较例3通过蛋白酶HY-3的蛋白分解为了比较通过由Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC 0268BP)生产的蛋白酶HY-3和其它蛋白酶的蛋白质分解，使用本发明的蛋白酶HY3和进口的Oropon K。作为胰酶制剂，将Oropon K广泛用于增大粒面的拉伸强度和柔软度，并通过分解胶原蛋白而不损伤皮革的粒面来保持柔软的粒面。
Braun，V.& Schmitz，G.，Arch，Microbiol.1980，12455-61测量蛋白酶HY-3的活性。将0.24g偶氮酪蛋白(Sigma，USA)溶解在10ml 50mM的磷酸盐缓冲液，pH7.5中来制备底物溶液。将300μl的底物溶液与100μl培养基混合并在37℃反应30分钟。向反应物加入300μl 10％三氯乙酸盐并在室温下另外反应1小时。将得到的反应物在7,000rpm下离心并将沉淀从上清液中分离。在300μl上清液中加入30μl 10％氢氧化钠，然后在420nm测量吸光度。将1单位本发明的酶定义为在37℃，消化偶氮-酪蛋白测试底物1分钟后释放足以将吸光度提高1.0的偶氮和酪蛋白的量的酶量。
将1单位蛋白酶HY-3和Oropon K各自加入酪蛋白，清蛋白，血红蛋白和角蛋白的蛋白质底物混合物(1mg/ml)，和胶原蛋白与弹性蛋白的蛋白质底物混合物(5mg/ml)，然后在37℃反应2小时。此后，使用Bradford法测量样品中蛋白质的量(参见表7)。然后将1单位酶定义为在37℃从底物的蛋白水解消化1分钟产生1μg蛋白质等价物(equivalent)所需的量。
因此，与Oropon K相比，对于除了血红蛋白的大部分底物，本发明的蛋白酶HY-3显示更高的分解活性。通常，动物生皮包含胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白，和清蛋白，球蛋白等非结构蛋白。蛋白酶HY-3可以分解在生皮中也存在的酪蛋白和清蛋白，特别是具有针对毛发主要成分角蛋白的极好分解活性，以致它因此可以在浸灰和脱灰步骤中发挥作用。
通过用蛋白酶消化10分钟，可以将角蛋白和胶原蛋白分解40％或更多。在下面表7中表示通过蛋白酶HY-3分解除了血红蛋白之外的蛋白质的结果。
表7

另外，与Oropon K相比，蛋白酶HY-3对胶原蛋白的活性高4倍多。结果在下面的表8中显示。结构蛋白，构成大多数动物生皮，组成大约60％或更多的胶原蛋白，胶原蛋白另外在骨，肌肉和腱中存在。因此认为如果给定的蛋白酶可以有效分解胶原蛋白，它对于皮革加工具有极好的效果。
表8

工业适用性如上所述，通过使用蛋白酶HY-3制备皮革的方法和本发明处理来自皮革加工的废物的方法，可以获得优秀品质的皮革并且还可以急剧减少在皮革加工中使用的化学品的量，由此以有利于环境的方式处理或者再循环废物。
已经以举例说明的方式描述了本发明，应当理解使用的术语是意欲具有描述而不是限制的性质。根据上述教导可对本发明进行许多修饰和改变。因此，应当理解在后附权利要求的范围内，可以不同于具体描述来实施本发明。


本发明涉及使用蛋白酶制备皮革的方法和使用它处理来源于皮革加工的废物的方法，其在制备优异品质的皮革，通过减少化学品的量减少废物产量和以有利于环境的方式处理或再循环废物方面是有利的。将从Aranicola proteolyticusHY－3菌株生产的蛋白酶HY－3加至皮革加工中的浸湿，浸灰，脱灰和软化步骤，从而制备皮革。另外，将蛋白酶HY－3加至在浸湿和浸灰步骤期间产生的废水和固体废物，和在浸灰，脱灰，软化和整理步骤期间产生的固体废物中，以便处理废物。