专利名称：动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂及其制备方法 动物用冻干活疫苗是控制动物病毒或细菌感染的有利武器，将冻干活疫苗常温保存除可大大降低生产成本外，还可为此类制品的运输、保存与使用提供方便，另外，它还可降低疫苗的现场应用损失率，进而提高疫苗单位有效免疫保护率。冻干活疫苗在制作过程中常造成疫苗大量失活，所以需要添加保护剂予以保护。目前，常用的兽医生物制品保护剂主要组成物为脱脂牛奶、蔗糖和明胶，它成本低易制备，但在保护剂中缺乏对动物免疫时促进抗原提升的成分。此外，使用普通保护剂的冻干活疫苗要求在-15℃的低温下保存，它在2～8℃条件下保存期仅3～9个月，在常温下必须尽快使用。这就为兽医生物制品的保存、运输、使用等带来诸多困难和不便，同时，严格的低温保存也造成能源的消耗及储存成本的加大。
本发明所要解决的技术问题是提供一种可提高疫苗免疫效力、常温保存期长的动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂，另外，本发明还要提供这种制剂的制备方法。本发明所称问题是由以下技术方案解决的一种动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂，它由下述重量百分比的物质混合配制而成明胶1.5～3％、Vc 0.1～0.3％、乳糖5～6％、牛肉蛋白胨1～2％、PVP(聚乙二烯吡咯烷酮K30)5％、山梨醇1～3％、谷氨酸钠1～3％、牛血清白蛋白1～2％、EDTA(乙二胺四乙酸二钠)1～3％、复方胞肽2％，余量为蒸馏水。上述动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂，它按如下步骤制备a.按配方称取明胶、乳糖、牛肉蛋白胨、EDTA、PVP(K30)和蒸馏水总量的1/2，将上述物质溶于蒸馏水中，120～125℃灭菌15分钟；b.按配方称取Vc、山梨醇、谷氨酸钠、牛血清白蛋白、复方胞肽和蒸馏水总量的1/2，将上述物质溶于蒸馏水中，用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌；c.将上述两组分混合均匀，即制成动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂。本发明优选配方组分，添加胞肽等成分，并分别通过对耐高压成分按比例溶于蒸馏水中高压除菌、对不耐高压成分按比例溶于蒸馏水后过滤除菌，然后再行混配，可促进抗原提升，提高疫苗的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫应答，显著提高了疫苗的免疫水平。采用本发明制作的动物用冻干活疫苗在2～8℃条件下可保存24个月以上，是普通疫苗在同等条件下保存期的三倍。经检测，各项指标均可达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》规定的要求。本发明在配方中添加复方胞肽，试验表明，胞肽可以促进抗原提升，提高疫苗的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫应答，显著提高免疫水平。可用如下方法进行测定将同批ND(鸡新城疫病毒)毒液，采用不同保护剂冻干所得的活疫苗对7日龄的健康雏鸡进行免疫，免疫后21天，对试验鸡进行采血测定ND HI(鸡新城病毒血液凝集价)，判定耐热保护免疫增强剂对疫苗的影响。测定结果表明，使用本发明制备的冻干ND活疫苗免疫的试验鸡，其平均抗体水平比用普通保护剂冻干所的ND活疫苗免疫试验鸡的平均抗体水平高1～2个滴度，并且抗体水平均匀整齐。
以下给出本发明其它技术参数及检测方法1.本发明产品经除菌后，无菌检验呈阴性。
2.耐热保护免疫增强剂的毒性试验按产品中含耐热保护免疫增强剂的10倍量，对7日龄健康雏鸡分别进行饮水、滴鼻、点眼及其皮下注射各10只，观察21天，雏鸡全部健活，无任何不良反应。
3.冻干周期不超过42小时。
4.产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分测定和真空度测定均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》的有关标准。
5.疫苗病毒含量的测定及标准(以ND活疫苗为例)测定方法用灭菌的生理盐水按实含病毒液的量作10倍系列稀释，取3个适宜的稀释度，分别于尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5个，0.1ml/胚，置37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚，随时取出，收获鸡胚液，将同一稀释度的鸡胚液等量混合，分别测定红细胞凝集价。至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1∶128(微量法)者判为感染，计算EID50。
按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌的生理盐水稀释至1羽份/0.1ml，再作10倍系列稀释，其它方法同上。
达到的标准冻干后病毒损失率≤0.2个滴度。冻干后每羽份病毒含量≥106.5EID50。产品放在37℃保存7天，病毒含量下降不超过1个滴度。产品放在2～8℃保存24个月，每羽份病毒含量≥106.0EID50。
以下给出几个具体实施例实施例1按重量百分比取下列物质明胶1.5％、Vc 0.3％、乳糖5％、牛肉蛋白胨1.5％、PVP(K30)5％、山梨醇2％、谷氨酸钠2％、牛血清白蛋白2％、EDTA 1％、复方胞肽2％，余量为蒸馏水。
实施例2按重量百分比取下列物质明胶3％、Vc 0.2％、乳糖6％、牛肉蛋白胨2％、PVP(K30)5％、山梨醇1％、谷氨酸钠3％、牛血清白蛋白1％、EDTA 2％、复方胞肽2％，余量为蒸馏水。
实施例3按重量百分比取下列物质明胶2％、Vc 0.1％、乳糖5.5％、牛肉蛋白胨1％、PVP(K30)5％、山梨醇3％、谷氨酸钠1％、牛血清白蛋白1.5％、EDTA 3％、复方胞肽2％，余量为蒸馏水。
对每个实施例中的组分物质分别进行除菌处理(1)对可高压灭菌的物质组分如明胶、乳糖、牛肉蛋白胨、EDTA、PVP(K30)，溶于1/2蒸馏水总量中，120～125℃灭菌15分钟；(2)将不耐高压灭菌的物质组分Vc、山梨醇、谷氨酸钠、牛血清白蛋白、复方胞肽，溶于剩余的1/2蒸馏水中，用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌；分别完成除菌后把两种溶液混合，即得耐热保护免疫增强剂。
使用时按1∶1比例加入病毒抗原液中，分装后再进行冷冻干燥。


一种动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂及其制备方法，属医用制品技术领域，用于提高疫苗的储存期及免疫效力的问题。其技术方案是，它由下述重量百分比的物质混配而成明胶1.5～3％、Vc 0.1～0.3％、乳糖5～6％、牛肉蛋白胨1～2％、PVP 5％、山梨醇1～3％、谷氨酸钠1～3％、牛血清白蛋白1～2％、EDTA 1～3％、复方胞肽2％，余量为蒸馏水。本发明优选配方组分，添加胞肽等成分，并分别通过高压除菌和过滤除菌，再行混配，使用时按1∶1比例加入病毒抗原液中，分装后再进行冷冻干燥，从而促进了抗原提升，提高疫苗的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫应答，显著提高了免疫水平和抗体水平均匀度。采用本发明制作的动物用冻干活疫苗在2～8℃条件下可保存24个月以上。