一种动物用可鉴别灭活疫苗的制备方法 【技术领域】 [0001]本发明涉及动物疫苗【技术领域】，具体涉及一种动物用可鉴别灭活疫苗的制备方法。 [0002]现在动物疾病越来越多，疫苗已经成为预防和控制疾病的主要工具，减毒活疫苗在预防传染性疾病发生和控制传染病爆发起到了十分重要的作用。但是，运用减毒活疫苗生产用菌毒种的安全问题，是动物长期在使用减毒活疫苗可能出现疫苗毒株残留，基因重组、基因变异、毒力返强等现象，造成疾病再次流行，不利于传染性疾病的净化和清除。 [0003]动物疫苗对预防动物疾病的发生起到至关重要的作用，国内外许多传染性疾病均通过免疫接种疫苗进行预防和控制，但是要进行疾病净化和清除则需要可鉴别疫苗，尤其是可鉴别的灭活疫苗。

[0004]本发明的目的之一是为了弥补现有技术的不足，提供一种可有效淘汰和清除带毒动物、实现疾病净化的动物用可鉴别灭活疫苗的制备方法。
[0005]本发明实现其目的采用的技术方案是:
[0006]一种动物用可鉴别灭活疫苗的制备方法，所述制备过程为采用基因工程方法、自然传代方法或化学合成方法，致使抗原物质减少了一段或多段基因，进而产生新的特征性，再将所述具有新特性的抗原物质制备成可鉴别灭活疫苗。
[0007]作为优选的技术方案:所述抗原物质为细菌、病毒、寄生虫、支原体或衣原体。
[0008]作为优选的技术方案:所述病毒为伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒、蓝耳病毒、流行性腹泻病毒、禽流感病毒、减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒或鸭肝炎病毒。
[0009]作为优选的技术方案:所述抗原物质可以是具有免疫原性的蛋白质或合成肽。
[0010]作为优选的技术方案:所述基因工程方法为将抗原物质的一段或者多段基因敲除或导入，通过表达后产生新的特征性，并保持抗原良好培养特性和免疫原性不变。
[0011] 作为优选的技术方案:所述自然方法为通过细胞、胚胎、动物体内连续传代培养致使抗原物质缺失一段或多段基因，表达后产生新的特征性，并保持抗原良好培养性和免疫原性不变。
[0012]作为优选的技术方案:所述可鉴别灭活疫苗可通过乳化工艺生产成乳剂灭活苗，或者通过冷冻干燥制成冻干灭活苗。
[0013]作为优选的技术方案:所述乳剂灭活疫苗为含油佐剂灭活疫苗。
[0014]作为优选的技术方案:所述含油佐剂灭活疫苗包括水包油型、油包水型、水包油包水型，其中油包括矿物油或植物油。
[0015]作为优选的技术方案:所述乳剂灭活疫苗为亲水剂型灭活疫苗，所述亲水剂型灭活疫苗采用溶剂包括氢氧化铝胶、磷酸铝胶、蜂胶、高分子聚合物、树脂。
[0016]传染性疾病防控的最后阶段是疾病的净化和清除，这个阶段则需要运用灭活疫苗，尤其是带有特征可鉴别的灭活疫苗，此类疫苗接种动物后不仅可以产生坚强的保护力，而且通过检测可鉴别抗体，可以鉴别诊断动物是否感染过野毒，从而可以清除和淘汰带毒动物，达到动物群体疾病净化的目的。灭活疫苗所需要的菌/毒种虽是毒力强的菌/毒种，由于在制备疫苗过程将菌毒种彻底灭活，因此，在使用过程中不会出现基因重组、基因变异、毒力返强等现象。在不影响病毒培养特性、免疫原性、免疫效力的情况下，通过基因工程方法和自然传代方法使疫苗生产用菌毒种或蛋白质、合成肽等带有特征性可鉴别，再生产成可鉴别灭活疫苗，可产生可鉴别物对应的抗体。动物免疫接种这样的疫苗后，检测可鉴别抗体，可以区分疫苗和野毒产生的抗体，诊断出感染过野毒的动物，从而淘汰和清除带毒动物，有利于养殖场疾病的净化。
[0017]疫苗生产用菌(毒)株培养方法和常规方法相同，只是通过筛选优化出最佳的可鉴别后疫苗菌(毒)株的培养条件，然后根据疫苗的质量标准把培养的原液稀释成所需的抗原含量，进行灭活，筛选合适的免疫佐剂，按照最优比例配制成灭活疫苗。当然安全检验和效力检验要合乎要求。
[0018]本发明具有的有益效果:
[0019]动物免疫接种这样的疫苗后，通过检测特征可鉴别抗体，鉴别该抗体是由处理前的抗原(即野毒)产生还是处理后抗原(疫苗毒)产生，可以区分疫苗和野毒产生的抗体，诊断动物是否感染过野毒株，从而淘汰和清除带毒动物，实现疾病净化，有利于养殖场疾病的净化。


[0020]下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不仅仅局限于实施例。
[0021]实施例1
[0022]猪伪狂犬病毒可鉴别灭活疫苗的制备:
[0023]猪伪狂犬新流行毒株的分离:从猪场发病死亡的仔猪无菌操作采集脑和肺、肾等组织，混合后在灭菌的研钵内剪碎，按此方法处理了 3头仔猪的病料，用DMEM作1:5倍稀释成悬液，_70°C反复冻融3次。经3000r/min离心30分钟，取上清液经0.22 μ m微孔滤膜过滤后，加入适量青、链霉素，接种于已长成单层的BHK-21细胞的培养瓶中，置于37°C恒温箱吸附I小时，然后加入DMEM维持液培养72小时收毒。纯化、鉴定为伪狂犬病毒。
[0024]gE 的敲除:转化前 2 小时于 LB平板上涂x-gal(40y g/ml)和 IPTG (20 μ g/ml) 37°C温箱中倒置平皿，使X-gal和IPTG充分吸入琼脂中；从_70°C冰箱中取出2管感受态细胞，融化后，立即把管转移到冰浴中，放置10分钟后，于冰浴中将管中加入待转化质粒(体积〈10 μ 1，<50ng)，轻轻旋转混匀，干冰上放置30分钟，而后迅速转入42°C水浴中热冲击90秒，再迅速转入冰浴中冷却2分钟，加入400 μ 137°C预热的LB液体培养基，37°C摇床缓慢摇动(250转/分)温育45分钟，分别涂布含有Amp (50ug/ml)的LB平板上，37°C温箱中过夜培养。将重组质粒PBsA转化DH5，挑取单个菌落，用LB液体培养基增殖，提取质粒，BamHI酶切，回收大小约为6.6kb的片段。将此PRV6.6kbDNA片段连接到pUC18BamHI位点中，获得重组质粒pUc6.6，同时继续用Kpnl酶切此PRV6.6kb DNA片段，回收PRV4.1kb片段，作为疫苗毒株。
[0025]将该可鉴别疫苗毒株接种PK15、BHK、VER0、ST等细胞进行培养、24~48小时收获病毒培养液，然后在培养液中添加0.1%~0.5%的灭活剂,摇匀，置2~8°C 48小时。检验完全灭活病毒液后，将病毒也与适宜佐剂或冻干保护剂混匀，分装进行乳化或冻干，制备成半成品，然后分装，检验合格后为成品，置2~8 °C保存。
[0026]实施例2
[0027]猪瘟可鉴别灭活疫苗的制备:
[0028]目前预防猪瘟的疫苗是C株活疫苗，免疫效果良好，但是不能和野毒株区分。在C株的基础上，E2基因人工敲除，使其缺失了 54个氨基酸，即B/C区693~746。敲除后不影响该毒株的培养和免疫原性和效力，能够抵御猪瘟强毒的攻击。
[0029]将该可鉴别猪瘟疫苗毒株接种ST细胞、犊牛睾丸细胞等进行培养、36~48小时收获病毒培养液，然后在培养液中添加0.1 %~0.5%的灭活剂，摇匀，置2~8°C 48小时。检验完全灭活病毒液后，把灭活后的病毒液和冻干保护剂按照体积比1:1混合，分装到安玻瓶中(2ml)，按照合适的冻干曲线，冻干成粉状，制备成半成品，按照质量标准做无菌检验、外源病毒检验、安全性检验和效力检验，检验合格后为成品，置2~8°C保存。
[0030]实施例3
[0031]链球菌可鉴别灭活疫苗的制备:
[0032]扩增了 srtA基因的上、下游同源臂Pl和P2及其全长序列，利用温度敏感型“自杀性”质粒pSET4s构建了重组质粒pSET4s-Pl-P2，并将该质粒电转化入野生菌株SS2 (SC21)中，通过抗生素和温度双重筛选，得到srtA基因缺失菌株，缺失突变菌株能够稳定遗传，不影响培养特性，仍保有很好的免疫原性。
[0033]疫苗的培养、灭活、配苗，和常规疫苗制作方法相同。
[0034] 本发明的疫苗经以下检验:无菌检验、外源病毒检验、安全性检验、效力检验都合格方可使用。
[0035]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。