一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备方法【技术领域】，涉及一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备方法。[0002]大鲷(Andrias davidianus Olarchand)),也称娃娃鱼,是我国特有的珍稀有尾两栖动物，国家二级保护动物，其经济价值高，具有广泛开发利用的前景[I]。近年来随着大鲵养殖规模不断扩大，人工养殖大鲵经常暴发各种疾病，给广大养殖户造成惨重的经济损失。烂腿病即为人工饲养大鲵的常见疾病之一，其主要病原菌为嗜水气单胞菌[2]。[0003]嗜水气单胞菌是一种人兽鱼共患的病原菌，该菌的致病性与其产生的多种毒力因子如黏附素、毒素胞外蛋白酶等密切相关[3]。在大鲵中，已知嗜水气单胞菌还可导致细菌性败血症病[4]、腐皮病[5]、腹水病[6]、细菌性感染综合症[7]等疾病发生，引起大批死亡。本研究以大鲵及中华鳖为试验对象，研究大鲵烂腿病病原菌嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫保护效果，旨在为相关疾病的防治提供参考依据。
[0004]本发明的目的在于提供大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备及免疫效应，解决了目前大鲵烂腿病发病率高、治愈率的技术难的问题。 [0005]本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行:[0006]步骤1:将嗜水气单胞菌接种于LB培养基中，28°C培养48h ；[0007]步骤2:离心法集菌，以灭菌生理盐水将菌液浓度调至I X 108cfu/ml，置于70°C恒温水浴灭活3h，将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000r/min离心机离心35min，分离出上清液；
[0008]步骤3:向分离出的每IOml上清液中添加7500-8500U的青霉素和福尔马林溶液摇匀；
[0009]步骤4:使用平皿法证实嗜水气单胞菌已被彻底灭活后，用灭菌生理盐水清洗3次，调浓度至lX108cfu/ml，制成福尔马林灭活的菌苗液，即为大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗；
[0010]步骤5:将稀释后的灭活菌苗液分装后，置于4°C冰箱中保存备用。
[0011]进一步，所述嗜水气单胞菌编号为WL3-X2 ;所述嗜水气单胞菌为分离自患烂腿病大鲵肝脏组织的病原菌。
[0012]进一步，所述步骤3中，福尔马林最终与在溶液里的含量为0.5%
[0013]本发明的有益效果是疫苗对大鲵烂腿病免疫率高。



[0014]图1是本发明注射免疫后大鲵血清抗体滴度示意图；[0015]图2是本发明注射免疫后大鲵血清溶菌酶活性示意图；
[0016]图3是本发明注射免疫后大鲵血清补体C3含量示意图；
[0017]图4是本发明攻毒后试验动物的存活情况示意图。

[0018] 下面结合附图和对本发明进行详细说明。
[0019]本发明一种大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗制备方法按照以下步骤进行:
[0020]步骤1:将嗜水气单胞菌接种于LB培养基中，28°C培养48h (小时)；
[0021]步骤2:离心法集菌，以灭菌生理盐水将菌液浓度调至I X 108cfu/ml，置于70°C恒温水浴灭活3h，将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000r/min离心机离心35min，分离出上清液；
[0022]步骤3:向分离出的每IOml上清液中添加7500-8500U的青霉素和福尔马林溶液摇匀；
[0023]步骤4:使用平皿法证实嗜水气单胞菌已被彻底灭活后，用灭菌生理盐水清洗3次，调浓度至lX108cfu/ml，制成福尔马林灭活的菌苗液，即为大鲵烂腿病病原菌灭活疫苗；
[0024]步骤5:将稀释后的灭活菌苗液分装后，置于4°C冰箱中保存备用。
[0025]进一步，所述嗜水气单胞菌编号为WL3-X2 ;所述嗜水气单胞菌为分离自患烂腿病大鲵肝脏组织的病原菌。
[0026]进一步，所述步骤3中，福尔马林最终与在溶液里的含量为0.5%。
[0027]下面对上述制备的疫苗进行实验:
[0028]I) 1.1试验动物:
[0029]试验大鲵优选来自重庆某中国大鲵繁育基地人工的养殖大鲵子二代，体重规格为(163±56.5)g，体质健壮，活力能力强，摄食正常。将试验大鲵饲养在规格一致养殖池(150cmX IOOcmX45cm)中，每池放养大鲵密度为10尾。养殖室内温度用空调调控，常年温度为20°C。养殖用水为山泉水，通过管道自流供水，达到生活饮用水标准。饵料为鲜活草鱼、白鲢以及虾蟹等，投喂前严格检查饵料的品质状况，并经盐水浸泡消毒后进行投喂。2d换水I次，每隔7d对养殖池进行消毒I次。
[0030]试验中华鳖购自重庆某中华鳖养殖场，体重规格为(59±8.3)g，体质健壮，活力能力强，摄食正常，饲养在规格一致养殖池(150cmX IOOcmX45cm)中，每池放养大鲵密度为30尾，暂养期间投喂新鲜白鲢苗，I周后进行试验。
[0031]1.2菌株毒力测定:
[0032]取60尾健康中华鳘(Trionyx sinensis),体重约(286±67.1) g,随机分为6组,除对照组腹腔注射生理盐水外，其余5组分别腹腔注射I X 105、I X IO6,1 X IO7,1 X 108、I X 109cfu/g嗜水气单胞菌，每组设3个平行组，观察3周，实验期间的水温为(28土 1.5) °C。另外，按照上述分组及剂量感染大鲵，每组10尾健康大鲵，不设平行组。记录注射菌量，统计大鲵与鳖的死亡率，并通过病理检验确定死亡为嗜水气单胞菌感染所致。按Karber统计法计算LD5tl。
[0033]1.3注射免疫:[0034]随机将健康的大鲵分为2组，即灭活全菌免疫组及对照组，每组15尾，试验组注射
0.2ml灭活菌苗，对照组注射同体积生理盐水，各组试验动物均注射2次，时间间隔为2周，每次注射前停饲6h。分别于注射前(Od)和注射后第7、14、21、28、35d随机在每组取3尾大鲵，采集动脉血液，于_40°C保存。
[0035]1.4抗体滴度检测及溶菌酶、补体C3测定:
[0036]抗体滴度检测参照孙翰昌等[8]方法进行进行，溶菌酶及补体C3参照孙金辉等
[9]的方法进行测定。
[0037]1.5免疫保护率测定:
[0038]注射免疫4周后取试验大鲵和对照大鲵各15尾，肌肉注射0.2ml浓度为1.0X108的菌液攻毒，观察5周。记录死亡个数，并进行病理检验，计算相对存活率。按下列公式计算免疫保护力(RPS):
[0039]免疫保护力(％ )=(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率X 100 %。
[0040]1.6统计学处理:
[0041]实验数据结果以“平均数土标准差表示。统计分析采用SPSS11.0软件处理，组间差异显著性分析采用t检验法，P < 0.05是差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
[0042]2)结果分析:
[0043]2.1致病菌的毒力测定:
[0044]采用从患病大鲵组织分离所得的致病菌嗜水气单胞菌(编号为WL3-X2)进行毒力测定，分别感染健康大鲵及健康中华鳖。结果显示，其对健康鳖的LD5tl为106_8cfu/g，而对健康大鲵的LD5tl为107 3cfU/g。实验过程中，细菌攻毒后大鲵和中华鳖的死亡状况如表1，经病理检验所有死亡试验动物均为嗜水气单胞菌感染致死。
[0045]表1病原菌CQWL2-18对大鲵、中华鳖的LD50测定
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