专利名称：大鲵大脚病组织灭活疫苗及其制备方法大鲵，俗名娃娃鱼，两栖类动物，距今已有三亿伍仟万年演化史，是极珍贵的“活化 石”，在中国属国家二类保护动物，具有极高的科研、营养、药用、人文及观赏价值。近年来在 中国秦岭山区兴起的大鲵仿生态养殖已有长足发展，而且全国年繁殖量已达到百万尾。然 而，随着大鲵集约化养殖的发展和养殖规模的不断扩大，大鲵病害不断发生，症状越来越复 杂，发病率逐年上升，尤其是以四肢肿大、头肿大、体表溃烂为主要临床病状特征的大鲵大 脚病在全国各主产地相继爆发，许多繁殖场的种鲵及养殖场的成鲵和幼鲵相继发病死亡， 损失惨重，直接经济损失累计数亿元人民币，间接损失更是高达上百亿元人民币。研究显示，大鲵大脚病是大鲵感染蛙虹彩病毒后继发感染其他病原微生物所致， 死亡率高达90-100 %，而且传染性极强，是对大鲵养殖危害最大的疫病和制约大鲵产业发 展的最大瓶颈。可是截至目前为止，尚无治疗该病的有效药物，也无预防该病的任何疫苗。
本发明的目的在于公开一种大鲵大脚病的组织灭活疫苗及其制备方法，预期通过 该疫苗能有效预防大鲵大脚病的发生，切实保护这一珍稀濒危物种，并确保大鲵产业稳定 发展。实现上述目的的技术方案是一种大鲵大脚病组织灭活疫苗，其特征是按下述方 法制得1.抗原液的制备1. 1挑选自然感染大脚病症状典型、经检测确定为蛙虹彩病毒感染且濒死的病鲵， 无菌打开其腹腔，取出肝、脾、肾器官，现用或-20°C冻存备用，冻存的器官组织3个月内有 效；1. 2将上述新鲜的大鲵病变器官或冻存的病变器官解冻，去除筋腱等结缔组织，剪 成小于20mm3的小块，加1倍量0. 8%的生理盐水，在组织勻浆机中勻浆，得到病毒组织勻浆 液；1. 3将1. 2的病毒组织勻浆液连续作三次冻融处理，再用20kHz超声波裂解5次， 得到病毒裂解液；1.4将1.3的病毒裂解液用150目滤网真空抽滤，收集抽滤液，然后将抽滤液用大 容量离心机在4°C环境中先以5000rpm离心lh，去除上部的油脂和下部沉淀，再以SOOOrpm 离心lh，去除沉淀，上清液即是用作制备疫苗的抗原液；2.灭活抗原液的制备向1.4所得抗原液中加入浓度为37%的甲醛，使抗原液中甲醛含量达到0.4%灭活剂量，室温放置24h_48h灭活，当检测确定抗原液已完全灭活后，每毫升该灭活抗原液添 加1000单位青霉素和1000单位链霉素，混勻后即得灭活抗原液；3.组织灭活疫苗的制备3. 1配制8%的AlCl3和4%的NaOH溶液，按1 0. 955的体积比混合，形成氢氧 化铝胶体，高压灭菌，冷却至室温备用；3. 2在无菌间超净台内将灭活抗原液和氢氧化铝胶体按1 4比例混合均勻，即得 本发明预防大鲵大脚病的组织灭活疫苗；3. 3将上述3. 2所得组织灭活疫苗按IOml/瓶分装于灭菌塑料瓶内，密封瓶口即可 成为成品组织灭活疫苗。疫苗的保存方法本发明组织灭活疫苗4°C保存，有效期为6个月。疫苗的使用方法1.幼鲵及0. 25kg以下的成鲵免疫把疫苗用50倍无菌水稀释，将开口 60天以上、 消化道充分发育的幼鲵或0. 25kg以下的成鲵浸浴其中60分钟。2. 0. 25kg以上的成鲵免疫按体重0. lml/kg剂量肌注疫苗。本发明疫苗是完全灭活疫苗，应用安全，针对性很强，对能感染大鲵致大鲵患大脚 病的蛙虹彩病毒株型有免疫保护效果，对大鲵的免疫保护率达到60-80%。形成氢氧化铝胶体，并经高压灭菌，冷却至室温备用；(7)在无菌间超净台内将灭活抗原液和氢氧化铝胶体按1 4比例混合均勻，并用 无菌注射器按IOml/瓶分装于灭菌塑料瓶内，4°C保存，即为预防大鲵大脚病的组织灭活疫苗。实施例2(1)挑选大脚病症状典型、经实验室检测确定有虹彩病毒感染且濒死的病鲵，无菌打开腹腔，取其肝、脾、肾器官组织，-20°C冻存备用；(2)将⑴的病变器官解冻，去除筋腱等结缔组织，剪成小于20mm3的小块，加1倍 量0. 8%的生理盐水，在组织勻浆机中勻浆，得到组织勻浆液；后续按实施例1所述的(2)至(7)步骤完成，制得本发明组织灭活疫苗。实施例3开口 60天以上幼鲵的疫苗免疫先取实施例1或实施例2所得到的疫苗IOOml于水盆中，用无病毒无菌养殖用水 5L稀释，将100尾幼鲵放入其中进行浸浴，浸浴时间为60min，在浸浴过程中每IOmin摇动 水盆一次予以增氧，然后将幼鲵放入消毒处理过的养殖池中。根据幼鲵的生长情况，1个月 以后再按如上浸浴方法进行一次加强免疫。实施例4成鲵的疫苗免疫对于0. 25kg以下的成鲵，按照实施例3所述方法完成疫苗免疫即可。对于0. 25kg以上的成鲵，均采用肌注疫苗的方法进行免疫，注射剂量按0. lml/kg 体重，具体步骤如下(1)将养殖池水放干，称量大鲵的体重；(2)用70%酒精棉球轻轻擦拭大鲵尾侧肌注射区；(3)将实施例1或实施例2所得到的疫苗摇勻后，用无菌注射器吸取疫苗，根据大 鲵体重肌肉注射疫苗即可。(4)将注射疫苗后的大鲵放入养殖池中，重新加入养殖用水，按常规管理。一个月 后，在大鲵尾侧肌另一侧按本实施例(2)至(3)所述的方法再注射一次疫苗。本发明公开了一种大鲵大脚病组织灭活疫苗，它是按下述方法步骤制得1.选自然感染大脚病且濒死的病鲵，取出肝、脾、肾器官经过匀浆和超声波裂解，再经离心处理，去除油脂和沉淀，得抗原液；2.抗原液中加入甲醛灭活24h-48h，每毫升该灭活抗原液添加1000单位青霉素和1000单位链霉素，混匀后即得灭活抗原液；3.将灭活抗原液与氢氧化铝胶体按1∶4比例混合均匀即得组织灭活疫苗。疫苗4℃保存。幼鲵及0.25kg以下的成鲵免疫采用疫苗稀释液浸浴方式；0.25kg以上的成鲵免疫采取肌肉注射。本发明疫苗应用安全，针对性很强，对能感染大鲵致大鲵患大脚病的蛙虹彩病毒株型有免疫保护效果，对大鲵的免疫保护率达到60-80％。