专利名称：一种家禽冻干活疫苗耐热保护剂及其制备方法冷冻干燥技术是生物学的一个重要应用技术，常用于生物制品的科研和生产中， 以保持菌、毒种的生物学特性，稳定生物原料和半成品的生物活性，延长成品的有效期。国外活疫苗冻干制品在2 8°C的保存期为12 36个月，但保护剂配方属于专利，严格保密。我国同类产品在2 8°C的保存期与国外尚存在差距。我国现常用的兽医生物制品保护剂主要为5%蔗糖脱脂牛奶和1. 5 3%明胶、5 10%蔗糖，制品要求低温保存(_15°C )，2 8°C仅存3 6个月，在常温下要求尽快用完，这就为兽医生物制品的保存、 运输、使用等带来许多困难和不便，同时造成大量的能源浪费和资金流失。从现有的关于冻干耐热保护剂的资料可以知道，国内发明的一些耐热冻干保护剂在2 8°C下可以保存M 个月，但是有的保护剂配方复杂、成本高、不利于推广使用，例如中国专利CN1895675A “动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂及其制备方法”、CN1528457A “鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒冻干苗耐热保护剂及制备工艺”、CN1772302A “鸡新城疫活疫苗耐热冻干保护剂、 其制备方法及应用”、CN1168503C “鸡新城疫弱毒冻干疫苗耐热冻干保护剂及制备工艺”、 CN1426816A “兽医病毒类生物制品耐热冻干保护剂及制备工艺”、CN1528458A “鸡新城疫、 鸡传染性支气管炎(H120、H5》二联冻干疫苗耐热冻干保护剂及制备工艺”等；有的保护剂配方简单，成本低，但是只适用于一种疫苗，例如中国专利CN101491680A “鸡传染性法氏囊病活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法”;有的专利保护剂成分不多，但是制备过程既需要高压灭菌，又需要过滤除菌，例如中国专利CN101474410A ；有的专利配方相对简单，制备过程也不复杂，但是成本高，例如中国专利CN101947321A“活疫苗用耐热冻干保护剂及其制备方法及新城疫活疫苗”，其中配方中需要海藻糖、维生素C等，成本较高。因此迫切需要一种配方简单、成本低、制备方法简便，且可作为多种动物活疫苗的耐热冻干保护剂。
本发明的目的在于提供一种冻干耐热保护剂及其制备方法以克服现有技术的不足。本发明的耐热冻干保护剂由以下质量百分比的各组分组成磷酸二氢钾 0. 003% -0. 006%,磷酸氢二钠 0. 01% -0. 03%,氯化钾 0. 003% -0. 005%,乳糖 7% -8%, 丙氨酸0. 1% -0.3%、组氨酸0.3% _0.5%，剩余成份为蒸馏水。本发明的冻干耐热保护剂，可以由以下质量百分比的各组分组成磷酸二氢钾 0. 003 %、磷酸氢二钠0.02%、氯化钾0. 005 %、乳糖8 %、丙氨酸0.2%、组氨酸0.3%，剩余成份为蒸馏水。本发明的冻干耐热保护剂还可以由以下质量百分比的各组分组成磷酸二氢钾0. 005%、磷酸氢二钠0. 01%、氯化钾0. 004%、乳糖7%、丙氨酸0. 3%、组氨酸0. 3%，剩余成份为蒸馏水。本发明提供了制备上述冻干耐热保护剂的方法，是将上述各组分混合均勻，用孔径0. 22 μ m的滤膜过滤除菌即得。本发明冻干耐热保护剂的使用方法，是将本发明的冻干耐热保护剂与家禽疫苗以 1 1的体积比例进行配苗。本发明提供了耐热保护剂在保护家禽冻干活疫苗中的应用，是将本发明的冻干耐热保护剂与家禽疫苗以11的体积比例进行配苗。上述家禽疫苗为鸡新城疫活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗或鸡传染性法氏囊活疫苗。本发明提供的耐热冻干保护剂配方中的乳糖能防止有效物质随水蒸气一起升华飞散，丙氨酸和组氨酸能将疫苗中的活病毒调整到活性最稳定区域。本发明通过调整各种成分的含量，经反复试验最终确定了保护剂的配比。采用本发明制备的耐热保护剂保护效果良好，且配方简单，制备方法简便、成本低，适用于多种动物活疫苗，在使用过程中对环境无污染。家禽活疫苗在2-8°C条件下可保存M个月，能达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的要求。五、疫苗检验按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)(以下简称《规程》)对上述新城疫耐热保护剂活疫苗和传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗进行检验，包括1、产品的物理性质2、无菌检验按照《规程》进行检验，应无菌生长。如有菌生长，应进行杂菌计数和病原性鉴定、禽沙门氏菌检验，应符合规定。每羽份疫苗含非病原菌应不超过1个。3、支原体检验按照《规程》进行检验，应无支原体生长。4、外源病毒检验按照《规程》进行检验，应无外源病毒污染。5、特异性检验(1)新城疫耐热保护剂活疫苗的特异性检验将疫苗用生理盐水作适当稀释(0. 1羽份/0. ImL)，与等量的抗新城疫病毒特异性血清混合，在室温中和1小时，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0. lmL。置37°C 孵育120小时。在M 120小时内应不出现特异性死亡及鸡胚病变，至少有8个鸡胚健活， 对鸡胚液作红细胞凝集应试验应为阴性。(2)传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗的特异性检验将疫苗用生理盐水作适当稀释(0. 1羽份/0. ImL)，与等量的抗传染性支气管炎病毒特异性血清混合，在室温中和1小时，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0. 2mL。 置37°C孵育144小时，在M 144小时内应不出现特异性死亡及鸡胚病变，至少有8个鸡胚健活。6、安全检验(1)新城疫耐热保护剂活疫苗的安全性检验用7-10日龄SPF雏鸡20只，随机分成2组，每组10只。其中一组10只每只点眼或口服疫苗10羽份，作为免疫组，另外一组10只不接种，作为健康对照组。同样条件下，两组分别隔离饲养，观察14日，均应健活。如有非特异性死亡，两组总和不应超过3只，且免疫组死亡数不应超过对照组。(2)传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗的安全性检验用7日龄SPF鸡20只，10只各滴鼻接种疫苗10羽份，另10只作对照。观察10 日，应全部健活，且无呼吸异常及神经症状。任何一组非特异性死亡鸡应不超过1只，否则重检1次。7、剩余水分测定按照《规程》进行检验，采用真空烘干法，应不超过4%。8、病毒含量的测定(1)新城疫耐热保护剂活疫苗中病毒含量测定冻干前病毒含量测定用灭菌生理盐水按实际含病毒液的量进行10倍系列稀释， 取3个适宜稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0. lmL，置37°C继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48 120小时死亡的鸡胚，随时取出，收获鸡胚液， 将同一稀释度的鸡胚液等量混合，分别测定红细胞凝集价。至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1 160(微量法1 128)者判为感染，计算半数感染量(EID5tl)。冻干后病毒含量测定按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0. lmL，再作10倍系列稀释，其他方法同冻干前病毒含量测定。按照《规程》要求，每羽份病毒含量应该不低于106_ ciEID5tlt5(2)传染性支气管炎耐热保护剂活疫苗中病毒含量测定冻干前病毒含量测定用灭菌生理盐水按实际含病毒液的量进行10倍系列稀释， 取3个适宜稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0. lmL，置37°C继续孵育，24小时以内死亡的鸡胚弃去不计，根据接种后M 144小时的死胚及144小时的活胚中具有胎儿失水、蜷缩、发育小等特异性病痕的鸡胚总数计算半数胚致死量(ELD5tl)。 冻干后病毒含量测定按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份 /0. lmL，再作10倍系列稀释，其他方法同冻干前病毒含量测定。按照《规程》要求，每羽份病毒含量应该不低于103_ 5EID5tltl 9、检验结果，新城疫疫苗检验结果见表1，传染性支气管炎疫苗检验结果见表2表1新城疫疫苗检验结果本发明提供了一种家禽冻干活疫苗的耐热保护剂及其制备方法。本发明的冻干耐热保护剂由以下质量百分比的组分组成磷酸二氢钾0.003％-0.006％、磷酸氢二钠0.01％-0.03％、氯化钾0.003％-0.005％、乳糖7％-8％、丙氨酸0.1％-0.3％、组氨酸0.3％-0.5％，剩余成份为蒸馏水。通过将以上各组分混合均匀，用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌，即得本发明冻干耐热保护剂。本发明耐热保护剂对家禽冻干活疫苗的保护效果良好，可在2-8℃条件下保存24个月，病毒含量均高于《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》的标准，且在使用过程中对环境无污染。