专利名称：一株枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法随着养鸡生产的规模化集约化，鸡舍内饲养密度增大，空间相对狭窄，空气流通能力差，产生的有害气体中，氨气(NH3)是对鸡危害最大、引起鸡舍环境恶臭的主要有害气体之一，而氨气是饲料中未被消化的蛋白质中的氮元素发酵产生的。在我国，多数地区以农户养鸡为主，普遍存在规模小，资金投入少，采用人工操作，工作量大的现状，不能做到每天及时清粪，因此很容易造成舍内鸡粪堆积和发酵，产生恶臭污染环境；如果生产管理不当，将会严重影响舍内空气质量、鸡只生产性能及工作人员的健康。·为了改善鸡舍空气质量，可以通过减少鸡粪中蛋白质的含量，降低鸡舍内氨气含量。然而，鸡的消化道较短，对于鸡饲料中的蛋白质消化率较低。芽孢杆菌是生产蛋白酶的主要菌种，在鸡饲料中使用芽孢杆菌具有以下优点耐高温、耐酸碱、耐挤压，能够耐受饲料加工的影响；在饲料保存过程中，以孢子形式存在，不消耗饲料养分；进入消化道后，在肠道中复活率接近100% ;能够产生各种消化酶类、氨基酸和维生素等益生物质；在肠道可以消耗大量氧，维持肠道厌氧环境。但现有枯草芽孢杆菌存在以下缺陷在鸡消化道内产蛋白酶能力不高。
本发明要解决的技术问题是提供一株枯草芽孢杆菌及其应用，在鸡消化道内产蛋白酶能力高、可显著提高鸡饲料蛋白质消化率，可应用于鸡饲料中。本发明的技术解决方案 一株枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5· 5· Α Υ7 5·)ΚΙ119,于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5789。所述的枯草芽孢杆菌KWl 19在鸡饲料中的应用。所述的枯草芽孢杆菌KW119在鸡饲料中的应用，以菌粉的形式添加到饲料中，菌粉中活菌数为2. OX 108cfu/g，在肉仔鸡饲料或产蛋鸡饲料中所述菌粉的添加量为O. 2%。本发明通过平板初筛、模拟鸡肠道生境复筛，最终得到一株能在鸡肠道生境条件下高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌KW119，其有益效果是 枯草芽孢杆菌KW119在鸡肠道生境条件下产蛋白酶能力较高，达到538. 5U/mL ;通过产生蛋白酶，能促进饲料中蛋白质的消化，提高饲料蛋白质的消化率，在鸡饲料里添加O. 2%活菌数为2. OX 108cfu/g的枯草芽孢杆菌KW119菌粉后，饲料蛋白质消化率提高17% ;提高饲料的利用率，减少粪便中的氮含量，降低了鸡舍中氨气质量浓度，改善了鸡舍环境，减少环境污染，有利于鸡只的健康生长。枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5· 5· Α Υ7Υ5·)ΚΙ119,于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5789。
I、培养基
富集培养基牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水lOOOmL，调节pH至6. 5 7. O ; 分离培养基豆柏40g, Na2HPO4 lg, KH2PO4 Ig,琼脂15g，蒸馏水IOOOmL,调节pH至
6.5 7. O ;
初筛培养基牛肉膏3g，酪素10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，调节pH至6. 5
7.O ；· 种子培养基葡萄糖IOg,蛋白胨5g，酵母膏5g, KH2PO4 lg, MgSO4 0. 2g, Na2CO3 10g,蒸馏水IOOOmL,调节pH至6. 5 7. O ;
发酵培养基豆柏40g,蒸馏水IOOOmL,调节pH至6. 5 7. O ;
固体斜面培养基葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2PO4 lg, MgSO4 0. 2g, Na2CO310g，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，调节pH至6. 5 7. O。2、菌株的分离
取IOg长期存放豆柏的土壤置于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，漩涡混合仪上震荡2min，静止30min，80°C水浴加热20min，杀死微生物营养细胞，所得液为原液I;取IOmL原液I加入到IOOmL富集培养基中，41°C，160r/min摇床增殖培养24h ;用无菌生理盐水对增殖培养后的菌液进行梯度稀释至10_4，取10_2、10_3、10_4稀释液各0. ImL分别涂布于分离培养基平板上，41°C培养24h，挑选出革兰氏阳性菌接入固体斜面培养基中，置于41°C培养箱中培养24h，放入4°C冰箱中保藏，待筛选。3、产蛋白酶菌株的初筛
大试管(2.0cmX20cm)内装5mL富集培养基，分别接入分离纯化得到的菌株，41°C条件下160r/min旋转摇床发酵培养48h,发酵培养后的菌液经3500r/min离心后，以0. 5cm直径圆形滤纸片沾上清液贴于初筛培养基平板上，于30°C保温24 h，形成蛋白酶水解圈，然后用直尺测蛋白酶水解圈直径，选出水解圈直径和菌落直径的比值(R/r)大于3的菌株。4、摇瓶发酵试验模拟鸡肠道生境复筛高产蛋白酶的菌株 4. I模拟胃消化环境，评价耐酸性
配置人工胃液取质量分数为10%的盐酸16. 4mL加蒸懼水稀释,使pH值分别为2. O、6. 5 (对照组)，每IOOmL溶液中加Ig胃蛋白酶，充分溶解后用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌；
将初筛得到的菌株经斜面活化后，接种于种子培养基中，41°C条件下160 r/min振荡培养12h，按体积比为5%的接种量转接至人工胃液中，放入41 °C恒温水浴锅内，120 r/min振荡培养，放入5min后开始计时，3h后取培养菌液0. 1ml，进行平板菌落计数，计算存活率；存活率计算公式A1/A0X100%
AlipH为2的处理组的活菌数，AOipH为6. 5的对照组的活菌数；
筛选出存活率大于80%的菌株。4. 2模拟肠道消化环境，评价耐胆盐性
配制人工肠液取KH2PO4 6. 8g，加蒸馏水500mL溶解，用浓度为0. 4%的NaOH溶液调节pH值至6. 8，加水至lOOOmL，每IOOmL溶液中添加O. 3g禽胆盐，以不加禽胆盐的为对照组，充分溶解后用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌；
将耐酸性筛选出的菌株经斜面活化后，接种于种子培养基中，41°C条件下160r/min振荡培养12h，按体积比为5%的接种量转接至人工肠液，放入41 °C恒温水浴锅内，120r/min振荡培养；放入5min后开始计时，4h后取培养菌液O. 1ml，进行平板菌落计数，计算存活率；存活率计算公式A1/A0X 100%
Al:添加禽胆盐处理组的活菌数，A0:未添加禽胆盐对照组的活菌数；
筛选出存活率大于80%的菌株。4.3产蛋白酶能力复筛
将耐胆盐性筛选得到的菌株经斜面活化后，接种于种子培养基中，41°C条件下160r/·min振荡培养12h，按体积比为5%的接种量转接至发酵培养基中，41 °C继续振荡培养48 h，3500 r/min离心30min，取上清液采用福林-酚法测定蛋白酶活力(ImL酶液在pH为7. 2、40°C温度下，每分钟水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以“U/mL”表示)，筛选酶活力大于538. OU/mL的菌株,得到一株芽孢杆菌。5、菌种鉴定
通过菌体的群体形态观察、个体形态观察、生理生化试验结果及菌株的16 S rDNA序列对菌株进行菌种鉴定。菌落形态特征圆形或不规则形，乳白色，不透明菌落中心呈同心环状隆起； 菌体的个体形态特征细胞大小为(O. 7μπ O. 8μπΟ X (2. Ομ 3. ΟμπΟ，杆状，
芽孢呈椭圆形，中生或偏生；
生理生化特性革兰氏反应阳性，接触酶阳性，能发生乙酰甲基甲醇反应，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖产酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚，培养温度5°C 55°C，最适生长温度33°C 43°C，pH=6 8，最佳pH=6. O 7. 0，产蛋白酶能力较高，达到538.5 U/mL ；
结合该菌株的16 S rDNA序列经Genbank比对结果,确定该菌株为芽孢杆菌科芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌心subtilis)WH9,已于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院，中科院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 5789。二、枯草芽孢杆菌KWl 19在肉仔鸡饲料中的应用 I、试验动物AA+白羽肉仔鸡。2、试验菌种实验室保存的普通益生菌菌种枯草芽孢杆菌4622、枯草芽孢杆菌Kff119 (CGMCC No. 5789)，两种芽孢杆菌以菌粉的形式添加到饲料中，菌粉采用喷雾干燥法制得，其具体步骤如下
a)菌种枯草芽孢杆菌4622、枯草芽孢杆菌KWl19 ；
b)斜面培养将冷冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，33°C 43°C培养24h；
c)一级种子培养将培养好的斜面，接种于IOOmL种子培养基中，33°C 43°C条件下160 r/min振荡培养12h，制得一级种子液；
d)扩大培养以5%的接种量将一级种子液接种于IOOOmL种子培养基中，33°C 43°C条件下160 r/min振荡培养12h,制得二级种子液；e)发酵罐培养以5%的接种量将二级种子液接种于富集培养基中，33°C 43°C条件下160 r/min振荡培养24h ；
f)收集发酵产物待发酵罐中发酵液粘度达到15000cP时，收集发酵液，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；
上述喷雾干燥中的培养基配方为
富集培养基牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水lOOOmL，调节pH至6. 5 7. O ;种子培养基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5g，KH2PO4 I g,MgSO4 O. 2g,Na2CO3 10 g,蒸馏水lOOOmL，调节pH至6. 5 7. O ;
固体斜面培养基葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2PO4 lg, MgSO4 O. 2g，Na2CO3 10g,琼脂20 g,蒸懼水IOOOmL,调节pH至6. 5 7. O ;
所得菌粉活菌数为2. OX 108cfu/g，在鸡饲料中的添加量为0. 2%。3、试验方法
(1)试验分组及饲养管理
1800只I日龄AA+白羽肉仔鸡，体重健康状况基本相同，随机分为3组，即对照组和试验组，每组600只,分别饲养于三栋建筑结构、型式、大小、布局完全一致的鸡舍内。每组设3个重复，每个重复200只鸡。以不含抗生素的全价饲料为基础日粮，设为对照I组；在基础日粮中添加0. 2%枯草芽孢杆菌4622菌粉，设为对照2组；在基础日粮中添加0. 2%枯草芽孢杆菌KW119菌粉，设为试验组。按照常规对鸡舍进行消毒，采用笼养方式，自由采食，自由饮水，试验期21天；测定生长性能(包括采食量、日增重和料重比)；试验期间每周连续3天于每天5:30测定氨气质量浓度(采用气体检测管法)。22日龄时按照排空强饲法(全收粪法)进行代谢试验，选择体重相近的肉仔鸡40只，随机分为四组，每组10只，单笼饲养。四组试验鸡分别采用以下饲料饲喂 第I组试验鸡，基础日粮；第2组试验鸡，在基础日粮中添加0. 2%枯草芽孢杆菌4622菌粉；第3组试验鸡，在基础日粮中添加0. 2%枯草芽孢杆菌KWl 19菌粉；第4组试验鸡，不饲喂饲料，用于测定代谢性粪中蛋白质含量；即第I组、第2组、第3组为常规组，第4组为饥饿组。将四组试验鸡预饲5d后，饥饿32h(停料不停水)，然后迫使第I组、第2组、第3组试验鸡在30min内食入50g饲料，第4组试验鸡继续饥饿。随后四组试验鸡继续饥饿(停料不停水)，以笼为单位，收集32h排泄物，无损失地将全部排泄物转入已知重量的培养皿中，放入65°C 70°C烘箱，制成风干样本，用于测定蛋白质的消化率。其中蛋白质含量的测定按凯氏定氮法进行。饲料蛋白质消化率计算公式如下
癣入簡科中蛋白雜含靈—r龚宇1+白趱舍靈一代if僅翼字+ 白β含靈}
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(2)测定指标
生长性能测定(包括采食量、日增重和料重比)、饲料蛋白质消化率、鸡舍氨气质量浓度。4、试验结果
(I)生长性能表I枯草芽孢杆菌KW119对肉仔鸡生长性能的影响


一株枯草芽孢杆菌及其应用。所述菌株(Bacillussubtilis)KW119，于2012年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.5789。 枯草芽孢杆菌KW119在鸡肠道内生境条件下产蛋白酶能力较高，达到538.5U/mL；通过产生蛋白酶，能促进饲料中蛋白质的消化，提高饲料蛋白质的消化率，饲料蛋白质消化率提高17%；提高饲料的利用率，减少粪便中的氮含量，降低了鸡舍中氨气质量浓度，应用于鸡饲料中，能改善鸡舍环境，减少环境污染，有利于鸡只的健康生长。