专利名称：一种以银杏内生解淀粉芽孢杆菌制备微生物杀菌剂的生产方法杨树是一种速生丰产树种，在我国广泛种植，资源较为丰富。但杨木纤维结构 疏松，砍伐后易受变色真菌侵蚀，产生变色，严重影响木材的美观，大大降低了其经济价 值。已有的研究表明，变色菌可可球二孢菌、Lasiodiplodia theobromae )和新月弯孢 iCurvularia)是导致杨木变色的主要原因。其中Z.因生长速度快,变 色迅速的特点，影响了杨树的价值。目前，从自然界中筛选出的可用于防治木材蓝变的细菌 有土霉素链霉菌ri麗 仰5·)及粘质沙雷氏菌(5krraiia marcescens、。芽抱 杆菌因其种类繁多，功能也各不相同，具有营养简单、生长快速、易分离、能产生多种活性代 谢产物的特点，已成为生物杀菌剂的首选菌种，而且在逆境环境下能产生芽孢，有利于生物 农药的开发、生产和应用。银杏内生解淀粉芽抱杆菌amyloliquefaciensCGMCC 5569 (B. A. 5569)菌株具有如下的细菌学特性I、形态特征 (I)菌落特征在NB或者LB培养基上生长，菌落呈淡黄色近似圆形、表面干燥、有褶皱、不透明、有一 定黏度、带特殊的臭味。(2)菌体特征革兰氏反应为阳性；可形成内生芽孢，芽孢中生，为椭圆形，稍膨大。电镜下观察，菌体 呈杆状，大小为2 μ mX O. 6 μ m，以二分裂方式进行繁殖。、生化特性注+ :表示反应呈阳性；一表示反应呈阴性；土 表示反应呈弱阳性。、对杨木变色真菌抑菌活性好该菌发酵液和乙酸乙酯相浸膏对三种变色真菌抑制情况见附图 4、菌株鉴定基因组DNA提取后，利用16S rRNA通用引物对其进行PCR扩增，回收扩增产物并测 序，然后对菌株16S rRNA序列在NCBI网站中进行同源性比较。结果表明16S rRNA保守 序列为1489bp ;在EZTaXOn数据库中进行有效种序列相似性比对(下图)，发现和芽孢杆菌 属的有效种汉amyloliquefaciens NBRC 15535相似性最高(相似性为99. 313%)，其次为 B. subtil is 仰办印·/aaijmosor 應(相似性为 99. 229%)和芽抱杆菌 ifeciBiAs tequilensis (相似性为99. 313%)。基于16S rRNA基因序列系统发育分析，发现菌株B. A. 5569与解淀粉 芽孢杆菌独成一个分支，并且自举值相对较高，同时结合菌落特征、菌体形态的观察以及生 理生化实验结果，可以确定菌株B. A. 5569为解淀粉芽孢杆菌的一个菌株。解淀粉芽孢杆菌B. A. 5569具有以下优点
1、广谱性好
对 j、麦赤霉病菌graminerum,油菜菌核病菌5by<9_ro(i/ ia sclero tiorum, 7jC 稻立枯丝核菌苹果轮纹病菌Aereflgeriaaa,棉花黄 萎病真菌&有明显的防治效果。尤其在杨木变色真菌防治方面具有突 出效果(见附图)
2、对杨木变色真菌抑制率高 在发酵液1. OmL/mL和乙酸乙酯相浸膏100 u g/mL时，对三株杨木变色真菌抑制率达到 65%以上。、适应范围广
在-18°C 50°C范围内均能存活，对盐浓度有一定的耐受性。、发酵周期短
发酵时间在72小时以内完成。


为了解决杨树砍伐后易受变色真菌侵蚀而导致经济价值降低的问题，本发明提供 一种以银杏内生解淀粉芽孢杆菌制备微生物杀菌剂的生产方法，该生产方法可以生产出抵 抗变色真菌的杀菌剂，且耐抗性和适应性强，可以在不同的气候条件和生态条件下推广使用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是以B.A. 5569菌株制备杨木变色菌 杀菌剂的生产方法其生产流程如下
(1)制备斜面菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为35°C -39°C，培养22-26 小时。(2)制备摇床菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为35°C _39°C，摇床 以160-200r/min旋转，振荡培养22-26小时。(3)制备一级菌种，种子液的接种量为2%，使用玉米粉培养基，保持培养基内的 温度为30 °C -34 °C，发酵罐转速140-180转/分，振荡培养46-50小时，保持培养基内 的pH=6. 5-8. 5，通气量1:1。玉米粉培养基所包含的成分比重为玉米粉1. 5-2.0%、蔗糖 0. 5-1. 0%、黄豆饼粉 2. 0-3. 0%、KC1 0. 3-0. 5%。(4)大罐发酵，50L发酵罐的工艺条件为保持发酵罐内的温度为30°C _34°C，发酵 罐转速140-180转/分，振荡培养70-74小时，保持发酵罐内的pH=6. 5-8. 5，通气量1:1，大 罐发酵后得到的液体就是所需产品——变色菌杀菌剂。本发明的有益效果是，该生产方法可以生产出抵抗变色真菌的杀菌剂，该杀菌剂 广谱性好，对杨木变色真菌抑制率高，发酵周期短，适应范围广，可以在不同的气候条件和 生态条件下推广使用，具有低价高效性和良好的市场前景。



图1为该菌的生化特性，其中“ + ”表示反应呈阳性；“一”表示反应呈阴性；“± ”
表示反应呈弱阳性。图2为该菌发酵液和乙酸乙酯相浸膏对三种变色真菌抑制情况。CN 102657233 A书
明
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图3为该菌基于16S rRNA基因序列系统发育分析图。通过分析，可以确定菌株 B. A. 5569为解淀粉芽孢杆菌的一个菌株。图4为该菌发酵液对5种病原菌的抑制折线图。图5为该菌发酵液对杨木变色菌的抑制情况。实施例1
(1)制备斜面菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为恒温37°C，培养24小时。(2)制备摇床菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为恒温37°C，摇床以 180r/min旋转，振荡培养24小时。(3)制备一级菌种，种子液的接种量为2%，使用玉米粉培养基，保持培养基内的温 度为恒温32°C，发酵罐转速160转/分，振荡培养48小时，保持培养基内的pH=7. 5，通气 量1: 1。玉米粉培养基所包含的成分比重为玉米粉1. 5%、蔗糖0. 5%、黄豆饼粉2. 0%、KC1 0. 3%。(4)大罐发酵，50L发酵罐的工艺条件为保持发酵罐内的温度为恒温32°C，发酵 罐转速160转/分，振荡培养72小时，保持发酵罐内的pH=7. 5，通气量1:1，大罐发酵后得 到的液体就是所需产品——变色菌杀菌剂。实施例2
(1)制备斜面菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为恒温37°C，培养24小时。(2)制备摇床菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为恒温37°C，摇床以 180r/min旋转，振荡培养24小时。(3)制备一级菌种，种子液的接种量为2%，使用玉米粉培养基，保持培养基内的温 度为恒温32°C，发酵罐转速160转/分，振荡培养48小时，保持培养基内的pH=7. 5，通气 量1: 1。玉米粉培养基所包含的成分比重为玉米粉1. 8%、蔗糖0. 7%、黄豆饼粉2. 5%、KC1
0. 4%。(4)大罐发酵，50L发酵罐的工艺条件为保持发酵罐内的温度为恒温32°C，发酵 罐转速160转/分，振荡培养72小时，保持发酵罐内的pH=7. 5，通气量1: 1，大罐发酵后得 到的液体就是所需产品——变色菌杀菌剂。实施例3
(1)制备斜面菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为恒温37°C，培养24小时。
(2)制备摇床菌种，准备LB肉汤培养基，保持培养基中的温度为恒温37°C，摇床以 180r/min旋转，振荡培养24小时。
(3)制备一级菌种，种子液的接种量为2%，使用玉米粉培养基，保持培养基内的温度为 恒温32°C，发酵罐转速160转/分，振荡培养48小时，保持培养基内的pH=7. 5，通气量1:1。 玉米粉培养基所包含的成分比重为玉米粉2. 0%、蔗糖1. 0%、黄豆饼粉3. 0%、KC1 0. 5%。
(4)大罐发酵，50L发酵罐的工艺条件为保持发酵罐内的温度为恒温32°C，发酵罐转 速160转/分，振荡培养72小时，保持发酵罐内的pH=7. 5，通气量1: 1，大罐发酵后得到的 液体就是所需产品——变色菌杀菌剂。实施例中的产品为水剂。
产品质量标准浓度大于等于l%(lX101C)cfu/mL)，浓度为lX101C)cfu/mL时，对杨木变 色真菌抑制率为
L theobromae 76. 88%
L rubropurpurea 68. 21%
L. crassispora73. 40%。


本发明涉及一种以银杏内生解淀粉芽孢杆菌制备微生物杀菌剂的生产方法，该生产方法其生产流程包括斜面菌种制备、摇床菌种制备、一级菌种制备和大罐发酵，该生产方法可以生产出抵抗变色真菌的杀菌剂，该杀菌剂广谱性好，对杨木变色真菌抑制率高，发酵周期短，适应范围广，可以在不同的气候条件和生态条件下推广使用，具有低价高效性和良好的市场前景。