专利名称：淀粉质原料酶解产物及其制备方法和应用以及发酵制备柠檬酸的方法淀粉质原料酶解产物广泛应用于柠檬酸等多种工业产品的发酵制备中，目前采用的淀粉质原料酶解产物一般是将玉米等淀粉质原料粉碎，用水将粉碎后的产物调浆，然后将浆液进行酶解得到。淀粉质原料酶解产物含有酶解得到的液化液，或者还含有将得到的液化液进行固液分离得到的液化清液。但是，目前采用的淀粉质原料酶解产物，调浆需要耗费大量的水，且在将淀粉质原料酶解产物用于柠檬酸的发酵制备中，柠檬酸的发酵周期较长，糖酸转化率较低。
本发明的目的是克服现有技术中淀粉质原料酶解产物用于发酵，特别是用于柠檬酸的发酵制备时，柠檬酸的发酵周期较长，糖酸转化率较低的缺陷，而提供一种可缩短柠檬酸发酵周期、提高糖酸转化率的淀粉质原料酶解产物的制备方法，并提供了一种由该方法制得的淀粉质原料酶解产物，及该淀粉质原料酶解产物在发酵制备柠檬酸中的应用，以及一种发酵制备柠檬酸的方法，并同时解决了酒糟滤液处理的问题。本发明的发明人在研究中意外发现，将酒糟滤液的残糖中的可水解糖水解为单糖后用于淀粉质原料调浆，并酶解得到酶解产物，将此酶解产物用于发酵制备柠檬酸，不仅可以缩短柠檬酸的发酵周期，提高糖酸转化率，还可以经济环保地处理酒糟滤液。因此，为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种淀粉质原料酶解产物的制备方法，其特征在于，所述方法包括(I)将酒糟滤液的残糖中的可水解糖水解为单糖，得到液体A ;(2)将淀粉质原料粉碎，并将得到的粉碎产物与步骤(I)得到的液体A混合调浆，得到浆液B ；(3)在第一酶解条件下，将浆液B酶解，得到酶解产物。第二方面，本发明提供了一种淀粉质原料酶解产物，该淀粉质原料酶解产物包括液化液和/或液化清液，其特征在于，所述液化液为如上所述的方法制得的酶解产物，所述液化清液为如上所述的方法制得的酶解产物经固液分离后得到的清液。第三方面，本发明提供了一种如上所述的淀粉质原料酶解产物在发酵制备柠檬酸中的应用。第四方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，所述发酵培养基含有如上所述的淀粉质原料酶解产物。本发明的淀粉质原料酶解产物用于发酵制备柠檬酸，可缩短柠檬酸的发酵周期，提高糖酸转化率；本发明的淀粉质原料酶解产物的制备方法经济环保地处理了酒糟滤液。本发明方法可广泛应用于工业生产。本发明的其他特征和优点将在随后的部分予以详细说明。进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。一方面，本发明提供了一种淀粉质原料酶解产物的制备方法，该方法包括(I)将酒糟滤液的残糖中的可水解糖水解为单糖，得到液体A ; (2)将淀粉质原料粉碎，并将得到的粉碎产物与步骤(I)得到的液体A混合调浆，得到浆液B ；(3)在第一酶解条件下，将浆液B酶解，得到酶解产物。根据发酵生产酒精的现状得知，发酵生产酒精的方法存在着发酵后产生的酒糟滤液污染环境等问题，我国酒精行业每年约排放酒糟滤液5000多万t，生物耗氧量(BOD)和化学耗氧量(COD)分别达到180万t和360万t，占全国工业废水BOD和COD的1/8。根据本发明的发明人了解，目前酒糟滤液的处理方法主要有以下两种一是将酒糟滤液固液分离后得到的湿糟与清液的浓缩液混合后进行干燥生产蛋白饲料(DDGS)，其主要优点是变废为宝，但设备投资大，运行费用高，企业负担较重，而且DDGS生产会产生大量的二次蒸汽冷凝液，其COD和BOD分别达3000mg/L-4000mg/L和2000mg/L-3000mg/L，仍需处理；二是直接将酒糟滤液排入环保进行废水处理，废水排放量大，处理费用高，周期长。因此，本发明的发明人在研究中意外发现，将酒糟滤液的残糖中的可水解糖水解为单糖后用于淀粉质原料调浆，并酶解得到酶解产物，将此酶解产物用于发酵制备柠檬酸，不仅可以缩短柠檬酸的发酵周期，提高糖酸转化率，还可以经济环保地处理酒糟滤液。本发明中，酒糟滤液指的是酒精发酵产生的废醪液经固液分离得到的滤液。本发明步骤(I)中，将酒糟滤液的残糖中的可水解糖水解为单糖的方法无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法，但为了使水解进行的更加快速，优选将酒糟滤液在普鲁兰酶存在下，在第二酶解条件下进行酶解。相对于Ig酒糟滤液，普鲁兰酶的用量优选为0. 1-1U，其中，酒糟滤液的残糖含量为0. 5-1. 0g/100mL。酒糟滤液中的残糖一般是指酒糟滤液中存在的单糖、二糖和多糖。本发明中，普鲁兰酶的酶活力单位的定义为在60°C、pH4. 5条件下，Imin水解普鲁兰多糖(以葡萄糖计)所需酶量为一个酶活力单位，即IU。本领域技术人员应该理解的是，第二酶解条件即是在普鲁兰酶存在下，将酒糟滤液的残糖中的可水解糖水解为单糖的条件，优选包括PH值为4-5，温度为58-65°C，时间为20_40mino本发明中，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。本发明步骤(2)中，对于将淀粉质原料粉碎的方法无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法，对于粉碎的程度，只要粉碎产物调浆后适于酶解即可，优选情况下，粉碎产物的粒径为300-800微米。浆液B的固含量优选为22-26重量％。本发明步骤(3)中，在第一酶解条件下，将浆液B酶解，得到酶解产物。本领域技术人员应该理解的是，本发明的酶解产物是用于柠檬酸发酵，因此，在第一酶解条件下，将浆液B酶解，即是在产酶微生物和/或酶的存在下，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下将浆液B中的淀粉质原料酶解成适于黑曲霉利用的糊精糖液。产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。酶包括淀粉酶。
由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。酶优选为淀粉酶，淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，淀粉酶一般包括a-淀粉酶、3 -淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。本发明中，优选使用a-淀粉酶和/或异淀粉酶。本发明中，对于酶的用量，越多越好，出于成本考虑，优选相对于Ig淀粉质原料粉碎产物，淀粉酶的用量为15-50U。本发明中，淀粉酶的酶活力单位的定义为在70°C、pH 6.0条件下，Imin将I毫克淀粉转化为糊精糖液所需的酶量为一个酶活力单位，即IU。对于第一酶解条件无特殊要求，可以采用本领域的常规条件，酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105°C，更优选为80-95°C。酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选酶解的时间为90-150min，更优选为100_120min。酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5. 0-7.0，更优选为5. 4-5.7。第二方面，本发明提供了一种淀粉质原料酶解产物，该淀粉质原料酶解产物包括液化液和/或液化清液，液化液为如上所述的方法制得的酶解产物，液化清液为如上所述的方法制得的酶解产物经固液分离后得到的清液。本发明中，固液分离的方法与装置为本领域技术人员所公知，例如，采用压滤机或离心机进行压滤或离心。第三方面，本发明提供了如上所述的淀粉质原料酶解产物在发酵制备柠檬酸中的应用。第四方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，发酵培养基含有如上所述的淀粉质原料酶解产物。本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液体培养基(该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基)，经过一段时间的培养后所得产物。发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，优选淀粉质原料酶解产物的量占发酵培养基总量的80-100重量％。淀粉质原料酶解产物包括液化液和/或液化清液，通常可以将液化清液用于制备发酵培养基，也可以将液化清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。发酵培养基优选由液化液和液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以发酵培养基的总量为基准，液化清液为80-85重量％，液化液为15-20重量％。本领域技术人员应该理解的是，在将黑曲霉接种至发酵培养基中之前，需要将黑曲霉经过种子罐培养,之后将得到的成熟种子液加入到发酵培养基中。本发明中,种子罐的培养液优选为将上述液化液加水稀释至总糖为8-12重量％，得到培养液。本发明中，对于发酵制备柠檬酸的具体方法无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法。例如，可以采用如下方法发酵制备柠檬酸。将培养液投入种子罐，加热到115-125°C消毒，维持25-35分钟后快速降温至34-380C，接入黑曲霉菌株A，每升培养液中黑曲霉的接种量为2X 108-3X IO8个孢子。在34-38°C、起始pH值为5-6、压力0. 02-0. 04MPa下进行菌种培养，其中，在培养0_14h过程中，通气量为0. 2-0. 4体积(体积 分钟)，在培养14-20h过程中，通气量为0. 7-0. 9体积(体积 分钟)，在培养20h后，通气量为0. 5-0. 7体积(体积 分钟)。术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V min)，例如通气比为1:0. 1-1，简称通气量为0. 1-1体积(体积 分钟)。下同。
通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH< 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养，得到成熟种子液。将成熟种子液加入到发酵罐的发酵培养基中开始发酵。以每升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量为2. 2 X 107-2. 6 X IO7个孢子。接种量通常用接入发酵培养基的成熟种子液的体积占接入种子液后发酵培养基的体积的百分比来表示，当接入发酵培养基的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基的体积的8-11%时，能够满足以每升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量在2.2X 107-2.6X 107个孢子范围内，因此，接入发酵培养基的黑曲霉的接种量可以表示为接种量为8-11%。发酵条件包括温度为34-38°C，起始pH值为4-5，压力0. 03-0. 06MPa，在培养0_8h过程中，通气量为0. 7-0. 9体积(体积 分钟)，在培养8-24h过程中，通气量为0. 9-1. I体积(体积 分钟)，在培养24-48h过程中，通气量为0. 7-0. 9体积(体积 分钟)，在培养48h后，通气量为0. 5-0. 7体积(体积 分钟)。当发酵液中还原性糖浓度检测值低于0. 2g/100ml时停止发酵，确定为发酵终点。从在发酵培养基中接入黑曲霉菌种开始至发酵终点所经历的时间为发酵周期。然后固液分离得到柠檬酸溶液。按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。实施例以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。在以下实施例和对比例中
黑曲霉囷种为黑曲霉Co827。根据GB 1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度(即终点柠檬酸含量或称酸度)。转化率(％)=单罐供酸量/用糖的总重量X 100%，其中用糖的总重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。 以下实施例和对比例中均以发酵培养基中还原性糖浓度检测值低于0. 2g/100ml时停止发酵，确定为发酵终点。从在发酵培养基中接入黑曲霉菌种开始至发酵终点所经历的时间为发酵周期。按照GB/T5009. 7-2008的方法测定发酵培养基中还原性糖的浓度。实施例I本实施例用于说明本发明提供的淀粉质原料酶解产物及发酵制备柠檬酸的方法。(I)将酒糟滤液(残糖含量为0. 8g/100mL)的pH值调至4. 5，相对于Ig酒糟滤液，加入0. 5U普鲁兰酶(诺维信公司，Promozyme诺维信普鲁兰酶，本发明实施例和对比例中均为此普鲁兰酶)，在60°C下静置30min，得到液体A ;(2)将玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为500微米的粉碎产物，将粉碎产物与液体A混合调浆，得到浆液B，浆液B的固含量为24重量％。(3)相对于I克粉碎产物，向浆液B中加入30U的淀粉酶(诺维信公司，AquazymUltra高温淀粉酶，本发明实施例和对比例中均为此淀粉酶)，在93°C、pH为5. 9的条件下将浆液B酶解100分钟得到酶解产物，即液化液。(4)将部分酶解产物通过液压式板框压滤机进行压滤，分离得到液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为51重量％。(5)配制发酵培养基，将180. 5千克的上述液化清液、35. 5千克的液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。(6)将部分液化液加水稀释至总糖为10重量％，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121°C消毒，维持30分钟后快速降温至36°C，接入黑曲霉菌种，每升培养液中黑曲霉的接种量为2X IO8个孢子。在36°C、起始pH值为5、压力0.03MPa下进行菌种培养，其中，在培养0-14h过程中，通气量为0.3体积(体积 分钟)，在培养14-20h过程中，通气量为0. 8体积(体积 分钟)，在培养20h后，通气量为0. 6体积(体积 分钟)。通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH< 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养，得到成熟种子液。(7)将得到的成熟种子液加入到发酵罐的发酵培养基中开始发酵，接种量为10%，发酵条件包括温度为35°C，起始pH值为5，压力为0. 04MPa,在培养0_8h过程中，通气量为0. 8体积(体积 分钟)，在培养8-24h过程中，通气量为I. 0体积(体积 分钟)，在培养24_48h过程中，通气量为0. 8体积(体积 分钟),在培养48h后,通气量为0. 6体积(体积 分钟)。当发酵液中还原性糖浓度检测值低于0. 2g/100ml时停止发酵，统计发酵周期。然后进行固液分离，得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度(即终点柠檬酸含量，下同)，计算转化率见表I。实施例2
本实施例用于说明本发明提供的淀粉质原料酶解产物及发酵制备柠檬酸的方法。(I)将酒糟滤液(残糖含量为0. 5g/100mL)的pH值调至4，相对于Ig酒糟滤液，加A 0. IU普鲁兰酶，在58°C下静置40min，得到液体A ；(2)将玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为80·0微米的粉碎产物，将粉碎产物与液体A混合调浆，得到浆液B，浆液B的固含量为26重量％。(3)相对于I克粉碎产物，向浆液B中加入50U的淀粉酶，在105°C、pH为7的条件下将浆液B酶解90分钟得到酶解产物，即液化液。(4)将部分酶解产物通过液压式板框压滤机进行压滤，分离得到液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为50重量％。(5)配制发酵培养基，将177. I千克的上述液化清液、38. 9千克的液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。(6)将部分液化液加水稀释至总糖为8重量％，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到115°C消毒，维持35分钟后快速降温至34°C，接入黑曲霉菌种，每升培养液中黑曲霉的接种量为2. 5X IO8个孢子。在34°C、起始pH值为5. 5、压力0. 02MPa下进行菌种培养，其中，在培养0-14h过程中，通气量为0.2体积(体积 分钟)，在培养14-20h过程中，通气量为0. 7体积(体积 分钟)，在培养20h后，通气量为0. 5体积(体积 分钟)。通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH< 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养，得到成熟种子液。(7)将得到的成熟种子液加入到发酵罐的发酵培养基中开始发酵，接种量为8%，发酵条件包括温度为34°C，起始pH值为4. 5，压力为0. 03MPa,在培养0_8h过程中，通气量为0. 7体积(体积 分钟)，在培养8-24h过程中，通气量为0. 9体积(体积 分钟)，在培养24_48h过程中，通气量为0. 7体积(体积 分钟),在培养48h后,通气量为0. 5体积(体积 分钟)。当发酵液中还原性糖浓度检测值低于0. 2g/100ml时停止发酵，统计发酵周期。然后进行固液分离，得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度(即终点柠檬酸含量，下同)，计算转化率见表I。实施例3本实施例用于说明本发明提供的淀粉质原料酶解产物及发酵制备柠檬酸的方法。(I)将酒糟滤液(残糖含量为1.0g/100mL)的pH值调至5，相对于Ig酒糟滤液，力口A IU普鲁兰酶，在65°C下静置20min，得到液体A ;(2)将玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为300微米的粉碎产物，将粉碎产物与液体A混合调浆，得到浆液B，浆液B的固含量为22重量％。(3)相对于I克粉碎产物，向浆液B中加入15U的淀粉酶，在70°C、pH为5的条件下将浆液B酶解150分钟得到酶解产物，即液化液。(4)将部分酶解产物通过液压式板框压滤机进行压滤，分离得到液化清液和酶解残渣,其中，酶解残渣的固含量为49重量％。(5)配制发酵培养基，将169千克的上述液化清液、42. 2千克的液化液灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。(6)将部分液化液加水稀释至总糖为12重量％，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到125°C消毒，维持25分钟后快速降温至38°C，接入黑曲霉菌种，每升培养液中黑曲霉的接种量为3 X IO8个孢子。在38°C、起始pH值为6、压力0. 04MPa下进行菌种培养，其中，在培养0-14h过程中，通气量为0.4体积(体积 分钟)，在培养14-20h过程中，通气量为0. 9体积(体积 分钟)，在培养20h后，通气量为0. 7体积(体积 分钟)。通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH< 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养，得到成熟种子液。(7)将得到的成熟种子液加入到发酵罐的发酵培养基中开始发酵，接种量为11%，发酵条件包括温度为38°C，起始pH值为4，压力为0. 06MPa，在培养0_8h过程中，通气量为
0.9体积(体积 分钟)，在培养8-24h过程中，通气量为I. I体积(体积 分钟)，在培养24-48h过程中，通气量为0. 9体积(体积 分钟)，在培养48h后，通气量为0. 7体积 (体积 分钟)。当发酵液中还原性糖浓度检测值低于0. 2g/100ml时停止发酵，统计发酵周期。然后进行固液分离，得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度(即终点柠檬酸含量，下同)，计算转化率见表I。对比例I按照实施例I的方法发酵制备柠檬酸，不同的是，将玉米进行粉碎，将粉碎产物与水混合调浆，得到浆液B，浆液B的固含量为24重量％。当发酵液中还原性糖浓度检测值低于0.2g/100ml时停止发酵，统计发酵周期。然后进行固液分离，得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度(即终点柠檬酸含量，下同)，计算转化率见表I。表I


本发明公开了一种淀粉质原料酶解产物的制备方法，其中，该方法包括(1)将酒糟滤液的残糖中的可水解糖水解为单糖，得到液体A；(2)将淀粉质原料粉碎，并将得到的粉碎产物与步骤(1)得到的液体A混合调浆，得到浆液B；(3)在第一酶解条件下，将浆液B酶解，得到酶解产物。本发明还公开了一种淀粉质原料酶解产物，包括上述方法制得的酶解产物和/或所述酶解产物经固液分离后得到的清液。本发明还公开了上述淀粉质原料酶解产物在发酵制备柠檬酸中的应用及发酵制备柠檬酸的方法。本发明的淀粉质原料酶解产物用于发酵制备柠檬酸，可缩短柠檬酸的发酵周期，提高糖酸转化率；本发明的淀粉质原料酶解产物的制备方法经济环保地处理了酒糟滤液。