专利名称：一株无色杆菌及其不对称催化还原碳碳双键的方法光学纯缺电子烷烃化合物是有机合成中的重要合成块，可以用来制备光学纯手性药物。碳碳双键还原酶(enoate reductase)不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键，可同时得到具有一个或两个手性中心的光学纯缺电子烷烃化合物，是广泛用来制备手性缺电子烷烃类的方法之一(Stuermer et al. 2007 Asymmetric bioreduction of activated C = C bonds using enoate reductases from the old yellow enzyme family. [Review], Curr Opin Chem Biol 11:203-213)。近几十年来，随着不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键的快速发展，越来越多合成家开始关注碳碳双键还原酶的新酶源的开发及底物谱的扩增。经过数十年的探索，已经从许多不同的生物来源中得到了碳碳双键还原酶，如高等植物(地钱，长春花，烟草，番茄等)，细菌和真菌(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases. Chemcatchem 2:892-914)。由于微生物具有培养简单，周期短等特点，所以在全细胞催化的生物转化中，绝大数为微生物。相比之下，植物细胞培养比较复杂，不仅需要光照，而且周期较长，因此很少用于生物转化中。碳碳双键还原酶不对称催化还原的底物类型主要有烯醛、烯酮、炔酮、不饱和硝基、不饱和硝基酯、不饱和腈、不饱和羧酸及其衍生物(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases. Chemcatchem 2:892-914)。与生物催化羰基还原相比， 生物催化碳碳双键还原的研究较少，商品化的碳碳双键还原酶更少(Chaparro-Riggers et al. 2007Comparison of three enoate reductases and their potential use for biotransformations. Adv Synth Catal 349 :1521-1531)。其主要原因是酶的活力低、稳定性差，不适合应用。因此，新型酶源的发掘对于发展碳碳双键还原酶具有重要意义。
本发明的目的是公开一株无色杆菌，该菌于2011年10月31日在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2011369，分类命名=AchromcAacter sp. JA81，并利用该菌具有生产高活力、高对映选择性的碳碳双键还原酶的特性，还原底物 (Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸制备光学纯(R)-3-芳基-3-氰基丙酸，该(R)型产物是合成光学纯Y-氨基丁酸的关键手性中间体。同时，该菌还可以催化环状酰亚胺和不饱和硝基化合物制备光学纯缺电子烷烃类化合物。为无色杆菌首次用于不对称催化还原碳碳双键。本发明无色杆菌(AchromcAacter sp. JA81)的筛选方法以柠檬醛和(Z)-2_苯基丁 -2-烯腈为唯一碳源对来自成都龙泉果园和四川师范大学果园的土壤样品进行富集，得到纯培养菌株46株，以此46株菌株对模式底物马来酰亚胺进行生物转化，得到活力菌株16株，将此16株菌株对目标底物(Z) -3-苯基-3-氰基-丙烯酸进行生物转化，对目标底物有活性的菌株进行进一步的鉴定。经筛选得到本发明涉及的无色杆菌JA81。具体方案见实施例。以无色杆菌JA81作为生物催化剂，转化目标底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸生成相应的(R)-3-苯基-3-氰基丙酸。具体方法如下1.菌株培养斜面保存培养基组分为胰蛋白胨lg/100mL;酵母提取物0. 5g/100mL;NaCl lg/IOOmL ；琼脂粉 2g/100mL ；液体发酵培养基组成为胰蛋白胨lg/100mL;酵母提取物0.5g/100mL;NaCl lg/IOOmL ；溶于去离子水，用NaOH调pH值为7. 0，105kPa，121°C，灭菌20分钟。斜面培养将筛选得到的纯培养菌株接种于斜面保存培养基上，30°C培养 24-48h ；种子培养将单菌落无菌条件下用灭菌枪头接种于约IOml液体发酵培养基中， 300C，230rpm,培养Mh，制得种子液；摇瓶培养以的接种量将种子液接入新鲜的液体发酵培养基中，30°C， 230rpm，培养 36h02.收集菌体取步骤(1)中的摇瓶培养的菌液在4°C、7000转/分钟条件下离心8 分钟，收集菌体，并用浓度为0. 79g/100mL的生理盐水充分洗涤2次，得到湿菌体作为生物催化剂。3.生物转化将步骤O)中得到的湿菌体以pH7. 0,0. IM磷酸钾缓冲液配成细胞浓度为100-300g/L的菌悬液，加入底物(Z) -3-苯基-3-氰基-丙烯酸(底物溶于二甲亚砜，用量为100g/L)，终浓度为l-10g/L，按每IOOmL加入Ig的葡萄糖和5mL的异丙醇作为辅酶再生底物。生物转化条件为30°C，230rpm，转化时间为48h。4.分离样品调反应液pH为6. 0-6. 5左右，分别用一倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得产品经Meglich酯化 (Neises and Steglich 1978 Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids. Angew Chem Int Ed 17: 522-5 )，得到甲酯化产物，分离纯化，所得物充分溶于 ImL异丙醇(HPLC级)溶剂为备用检测样品。5.HPLC检测取步骤中IyL样品进样，利用手性色谱柱测定(R)_3_苯基-3-氰基丙酸甲酯的含量，最后计算ee值。检测ee值时手性色谱柱为Daicel Chiralcel 0D_!K250X4. 6mm)，流动相正己烷异丙醇=90 10，流速0.8ml/min，(R) _3_苯基-3-氰基丙酸甲酯和(S)-3-苯基-3-氰基丙酸甲酯的保留时间分别为11. 480min和14. 809min。其反应式如下本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株无色杆菌(Achromobacter sp.)JA81，保藏号为CCTCC M 2011369，以及利用该无色杆菌作为生物催化剂转化(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸，环状酰亚胺和不饱和硝基化合物，获得缺电子烷烃化合物的方法，而且可获得的最高对映体过量达到＞99％，最高转化率达到100％。本发明的催化剂无色杆菌菌体易于制备，反应条件温和，是绿色制造手性缺电子烷烃化合物的有效方法之一。